纤维蛋白富集和 tPA 敏感的光血栓形成卒中模型

摘要

传统的光血栓中风 （PTS） 模型主要诱导对组织纤溶酶原激活剂 （tPA） 溶解治疗具有高耐药性的致密血小板聚集体。本文通过共注射凝血酶和光敏染料进行光活化，引入了改良的小鼠PTS模型。凝血酶增强的 PTS 模型产生混合血小板:纤维蛋白凝块，并且对 tPA 溶栓高度敏感。

摘要

理想的血栓栓塞性卒中模型需要某些特性，包括相对简单的外科手术、死亡率低、梗死大小和位置一致、血小板:纤维蛋白混合血凝块的沉淀与患者相似，以及对纤溶治疗具有足够的敏感性。基于孟加拉玫瑰 （RB） 染料的光血栓中风模型满足前两个要求，但对 tPA 介导的裂解处理高度难治，这可能是由于其富含血小板但纤维蛋白贫乏的凝块组成。我们认为，RB染料（50mg / kg）和亚血栓形成剂量的凝血酶（80 U / kg）的组合用于针对大脑中动脉（MCA）近端分支的光活化，可能会产生富含纤维蛋白和tPA敏感的凝块。事实上，凝血酶和RB（T+RB）联合光血栓形成模型触发了混合血小板:纤维蛋白血凝块，如免疫染色和免疫印迹所示，并保持一致的梗死大小和位置以及低死亡率。此外，在光激活后 2 小时内静脉注射 tPA（阿替普酶，10 mg/kg）可显着减小 T+RB 光血栓形成的梗死面积。因此，凝血酶增强的光血栓中风模型可能是测试新型溶栓疗法的有用实验模型。

引言

血管内血栓切除术和 tPA 介导的溶栓是美国食品和药物管理局 （FDA） 批准的仅有的两种急性缺血性卒中疗法，美国每年有 ~700,000 名患者患病¹。由于血栓切除术的应用仅限于大血管闭塞 （LVO），而 tPA 溶栓术可以缓解小血管闭塞，因此两者都是急性缺血性卒中² 的有价值的治疗方法。此外，两种疗法的联合使用（例如，在卒中发作后 4.5 小时内开始 tPA 溶栓，然后进行血栓切除术）可改善再灌注和功能结局³。因此，即使在血栓切除术时代，优化溶栓仍然是卒中研究的重要目标。

血栓栓塞模型是临床前卒中研究的重要工具，旨在改善溶栓治疗。这是因为机械血管闭塞模型（例如，腔内缝合 MCA 闭塞）不会产生血凝块，并且其在去除机械闭塞后脑血流的快速恢复被过度理想化 ^4,5。迄今为止，主要的血栓栓塞模型包括光血栓形成 ^6,7,8、局部氯化铁 （FeCl 3） 应用⁹、凝血酶显微注射到 MCA 分支 10,11、体外（微）栓子注射到 MCA 或颈总动脉 （CCA） 12、13^、14 和短暂性缺氧缺血 （tHI）^{15,16，17,18}.这些卒中模型在随后血栓的组织学组成和对tPA介导的裂解疗法的敏感性方面有所不同（表1）。它们在开颅手术要求（原位凝血酶注射和局部应用 FeCl₃ 需要）、梗死大小和位置的一致性（例如，CCA 输注微栓子产生非常可变的结果）以及对心血管系统的总体影响（例如，tHI 增加心率和心输出量以补偿缺氧诱导的外周血管舒张）方面也有所不同。

基于 RB 染料的光血栓卒中 （PTS） 模型具有许多吸引人的特征，包括简单的无开颅手术、低死亡率（通常< 5%）以及可预测的梗死大小和位置（在 MCA 供应区域），但它有两个主要局限性。⁸ 首先需要注意的是，对 tPA 介导的溶栓治疗反应弱至零，这也是 FeCl₃ 模型⁷、^19、20 的缺点。PTS 和 FeCl₃ 卒中模型的第二个警告是，随后的血栓由密集的血小板聚集体和少量纤维蛋白组成，这不仅导致其对 tPA 溶解治疗的弹性，而且还偏离了急性缺血性卒中患者中血小板:纤维蛋白血栓混合的模式^21,22。相比之下，原位凝血酶显微注射模型主要包括聚合纤维蛋白和不确定含量的血小板¹⁰。

鉴于上述推理，我们假设 RB 和亚血栓形成剂量的凝血酶的混合物通过变薄的颅骨进行 MCA 靶向光活化可能会增加所得血栓中的纤维蛋白成分并提高对 tPA 介导的裂解治疗的敏感性。我们已经证实了这一假设，²³ 在此我们描述了改良 （T+RB） 光血栓中风模型的详细程序。

研究方案

该协议由弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准，并遵循美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南。 图 1A 概述了该协议的外科手术顺序。

1. 手术设置

1. 在手术前至少 15 分钟将温度设置为 37 °C 的加热垫放在小动物适配器上。为适配器准备一个鼻夹卷，允许动物头部旋转。准备麻醉剂氯胺酮 （60 mg/kg）/甲苯噻嗪 （10 mg/kg）。
2. 用高压灭菌器（121°C，15psi，60分钟）对手术工具进行消毒，包括剪刀，镊子，微针架，止血器，棉签和缝合线。准备纸巾胶和眼膏。为外科医生准备 532 nm 激光防护镜。
   注意:该协议描述了一种主要的生存手术程序，应使用无菌技术进行。
3. 使用 532 nm 激光源设置照明系统。准备牙钻。
4. 在盐水（10mg / mL）中制备Rose Bengal溶液。将等分试样的牛凝血酶（0.1U /μL）放在冰桶上。
5. 在手术前 30 分钟皮下注射酮洛芬 （4.0 mg/kg） 作为镇痛剂，或使用当地机构指南推荐的镇痛方案。

2.同侧颈总动脉结扎术

1. 通过肌肉注射氯胺酮（60mg / kg）和甲苯噻嗪（10mg / kg）麻醉体重为22至30g的10-14周龄雄性C57BL / 6NCrl小鼠。
   注意:整个外科手术，包括通过监测脑血流来结扎同侧颈总动脉，预计需要 ~120 分钟。麻醉方案通常在整个持续时间内有效，但应至少每 15 分钟重新评估一次麻醉深度。在学习这些程序时，可能需要重新给麻醉剂。
2. 捏脚趾以确保动物完全麻醉。用脱毛膏去除左脖子上的毛发进行CCA结扎，去除头部的毛发以使头骨变薄。
3. 将鼠标放在仰卧位的小动物适配器上。用聚维酮碘和70%乙醇交替擦拭皮肤，对手术区域进行消毒。
4. 使用耳杆固定鼠标头。在解剖显微镜下，使用一把微型剪刀和直镊子在中线外侧约 0.2 厘米处做一个 0.5 厘米的左颈椎切口。
5. 使用一对细锯齿状镊子拉开软组织和筋膜，露出左颈总动脉 （LCCA）。使用一把细光滑的镊子小心地将左侧CCA与迷走神经分开。
6. 使用切成 20 毫米段的 5-0 丝线在 LCCA 周围放置永久性双结缝合线，然后使用无菌伤口夹闭合伤口。

3. MCA分支上方颅骨变薄和光活化

1. 将鼠标翻转到小动物适配器上的俯卧位置。将鼻夹滚动 15°。通过用三次交替擦拭betadine和70%乙醇擦拭皮肤来消毒手术区域。
2. 使用一把微型剪刀和直镊子沿着左眼和耳朵在头皮上做一个0.8厘米的切口，露出位于眼睛和耳朵之间的颞肌（图1B）。
3. 在解剖显微镜下，用一对细锯齿镊子沿左顶骨颞肌边缘做一个0.5厘米的切口。用微型剪刀在颞肌上做第二个 0.3 厘米的垂直切口。缩回颞肌，露出顶骨和鳞状骨的边缘。确保可视化额骨和顶骨之间的冠状缝合标志（图1B，C）。
4. 通过应用无菌生理盐水来润湿颅骨，以显示左侧MCA。用记号笔在鳞状骨上标记近端MCA分支。用气动牙钻轻轻在标记区域周围画一个直径约1毫米的圆圈（毛刺速度设置为速度控制器的50%），然后在不接触硬脑膜下方的情况下将颅骨深度变薄约0.2毫米。停止钻孔，直到留下一层非常薄的骨头。
5. 根据小鼠的体重混合凝血酶（T，0.1U /μL，80U / kg）和孟加拉玫瑰（RB，10mg / mL，50mg / kg）溶液。例如，对于体重为 25 g 的小鼠，混合 20 μL 凝血酶 （0.1 U/μL） 和 125 μL RB （10 mg/mL）。
6. 用胰岛素注射器（#31G 针头）将 T+RB 溶液（每 25 g 体重 145 μL）缓慢注射到眶后窦中。
   注:在试点实验中，检查增加剂量的凝血酶与标准剂量的RB染料（50mg / kg）混合的光活化死亡率。80 U/kg凝血酶（n=13）的死亡率为0%，120 U/kg凝血酶（n=7）的死亡率为43%，160 U/kg（n=5）和200 U/kg凝血酶（n=5）的死亡率均为100%。因此，该模型选择80 U/kg凝血酶的剂量。激光散斑收缩成像还用于排除眶后窦注射 T+RB 后眶腔附近猖睑性血液凝固的可能性（补充图 1），以及未接受激光照射的对侧半球广泛纤维蛋白沉积（补充图 2）。
7. 在双眼上涂抹眼药膏以防止干燥。
8. 用 532 nm 激光（能量为 0.5 mW）将照明器施加在距离 2 英寸的钻孔部位 20 分钟。通过激光防护镜可视化MCA近端分支上的照明（图1C，D）。
   注意: 具有 532 nm 照明的 MCA 在护目镜下方显示红色荧光。远端 MCA 将在 10 分钟照明后消失。如果远端MCA血流在20分钟照明后仍然存在，则排除动物。
9. 20分钟后停止激光照明。用无菌伤口夹闭合伤口。

4. 活体成像（可选）

注:为了表征体内血栓形成，通过带有光活化系统的旋转盘共聚焦使用病毒内成像²³。

1. 在颅骨顶骨上做一个直径~3毫米的颅窗。
2. 将盖玻片放在颅窗上，并在20倍水浸物镜下定位远端MCA（直径~50μm）。
3. 在成像前 5 分钟通过尾静脉注射 DyLight488 偶联的抗 GPIbβ 抗体 （0.1 mg/kg） 标记循环血小板。
4. 在成像前5分钟通过眼眶后注射凝血酶（80U / kg）和孟加拉玫瑰（50mg / kg）的混合物溶液。
5. 使用直径为10μm的激光束的561nm激光系统光激活MCA，并记录图像直至血栓形成。

5. tPA管理

1. 将麻醉的动物放在37°C的温暖垫上。在选定的光活化后时间点，用~45°C温水润湿纱布，并将其包裹在尾巴上1分钟。
2. 通过输液泵在30分钟内以50%推注和50%的推注通过尾静脉注射重组人tPA（10mg / kg）。
   注:虽然用于急性缺血性中风治疗的重组人 tPA 的临床剂量为 0.9 mg/kg，但啮齿动物通常使用更高的剂量 （10 mg/kg） 来补偿降低的跨物种 tPA 反应性。我们还遵循临床前卒中模型中 tPA 给药的标准方案，使用 50% 作为推注，50% 通过尾静脉输注超过 30 分钟²⁴。

6. 脑血流量监测（CBF）

注:要确认 tPA 治疗后 CBF 恢复，请使用二维激光散斑对比成像系统¹⁵ 并在光血栓形成（步骤 3.9）后立即或在 tPA 治疗后 24 小时记录。

1. 将麻醉的动物置于俯卧位，并在头皮上做一个中线切口，颅骨暴露在外。
2. 用无菌生理盐水润湿颅骨，然后将超声波凝胶轻轻涂抹在颅骨上。避免凝胶中出现任何毛发和气泡，它们会干扰 CBF 信号。
3. 在激光散斑对比成像仪下监测两个大脑半球的 CBF 10 分钟。
4. 记录CBF图像后，用组织胶关闭头皮，然后将动物放回笼子。
5. 分析所选区域的 CBF，并计算与对侧区域相比的 CBF 回收率百分比。
6. 然后，将动物放回温暖的笼子中进行恢复。监测小鼠5-10分钟，直到它们从麻醉中恢复。将湿润的食物放入笼子中，然后将其送回动物护理机构。
   注意:按照当地机构指南的建议提供术后镇痛。

7.三苯基氯化四氮唑（TTC）染色测量梗死体积

1. 光血栓形成后 24 小时，根据当地非存活手术的机构指南对动物进行深度麻醉。
   注:我们通过腹膜内（IP）注射给予三溴乙醇（avertin）250 mg / kg。
2. 用PBS进行心内灌注，收集新鲜脑并嵌入3%琼脂凝胶中。
3. 用振动切片机切开1mm厚的脑切片，并在2%TTC溶液中孵育10分钟。
4. 通过 ImageJ 软件将 6 个脑切片的总梗死体积量化为绝对体积。
   注意:由于两个原因，脑水肿未被用作结果测量。首先，TTC染色测量组织活力（通过线粒体还原活性），这是比水肿更严重的后果。其次，随着梗死的进行，血管源性和细胞毒性水肿都会发生，并且无法通过标准的脑水肿测量方法轻松区分。然而，我们使用抗免疫球蛋白 （IgG） 标记来评估血脑屏障 （BBB） 的完整性，并在 RB 和 T+RB 卒中模型中发现光激活后 6 小时的 IgG 外渗相当（补充图 3）。

8. 血栓形成测量

注:为了测量血栓形成，在光血栓形成后1小时和2小时收集大脑，分别通过免疫化学（IHC）测量MCA中的血栓，并通过免疫印迹测量脑半球的纤维蛋白。

1. 进行 IHC 以表征凝块组成。用 4% 多聚甲醛固定大脑过夜，然后用 30% 蔗糖使大脑脱水以进行 OCT 包埋。
2. 以20μm厚度的矢状方向切开大脑，并用针对纤维蛋白原，血小板（糖蛋白IIb），红细胞（TER119）和血管（异凝集素GS-IB4）的特异性抗体进行IHC。
3. 通过免疫印迹和抗纤维蛋白原抗体测量脑半球中的纤维蛋白。

结果

首先，我们比较了RB与T+RB光血栓形成诱导的血凝块中的纤维蛋白含量。光活化后2 h通过心内灌注固定剂处死小鼠，取出脑进行纵横面MCA分支免疫荧光染色。在RB光血栓形成中，MCA分支密集地填充了CD41⁺血小板和少量纤维蛋白（图2A，C）。相比之下，T+RB光血栓形成中的MCA分支被随机混合的血小板:纤维蛋白凝块阻塞（图2B，D，n

讨论

1985 年引入的传统 RB 光血栓性卒中是一种有吸引力的局灶性脑缺血模型，适用于简单的外科手术、低死亡率和高可重复性脑梗死。5 在该模型中，光动力染料 RB 在光激发下迅速激活血小板，导致致密的聚集体阻塞血管 ^5,8,23。然而，RB诱导的血凝块中的少量纤维蛋白（图2）偏离了缺血性?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Sigma	T8877	infarct
4-0 Nylon monofilament suture	LOOK	766B	surgical supplies
5-0 silk suture	Harvard Apparatus	624143	surgical supplies
543nm laser beam	Melles Griot	25-LGP-193-249	photothrombosis
adult male mice	Charles River	C57BL/6	10~14 weeks old (22~30 g)
Anesthesia bar for mouse adaptor	machine shop, UVA		surgical setup
Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol)	Sigma	T48402	euthanasia
Dental drill	Dentamerica	Rotex 782	surgical setup
Digital microscope	Dino-Lite	AM2111	brain imaging
Dissecting microscope	Olympus	SZ40	surgical setup
Fine curved forceps (serrated)	FST	11370-31	surgical instrument
Fine curved forceps (smooth)	FST	11373-12	surgical instrument
goat anti-rabbit Alexa Fluro 488	Invitrogen	A11008	Immunohistochemistry
Halsted-Mosquito hemostats	FST	13008-12	surgical instrument
Heat pump with warming pad	Gaymar	TP700	surgical setup
infusion pump	KD Scientific	200	thrombolytic treatment
Insulin syringe with 31G needle	BD	328291	photothrombosis
Ketamine	CCM, UVA		anesthesia
Laser protective google 532nm	Thorlabs	LG3	photothrombosis
Ketoprofen	CCM, UVA		NSAID analgesia
micro needle holders	FST	12060-01	surgical instrument
micro scissors	FST	15000-03	surgical instrument
MoorFLPI-2 blood flow imager	Moor	780-nm laser source	Laser Speckle Contrast Imaging
Mouse adaptor	RWD	68014	surgical setup
Puralube Vet ointment	Fisher	NC0138063	eye dryness prevention
Retractor tips	Kent Scientific	Surgi-5014-2	surgical setup
Rose Bengal	Sigma	198250	photothrombosis
Thrombin	Sigma	T7513	photothrombosis
Tissue glue	Abbott Laboratories	NC9855218	surgical supplies
tPA	Genetech	Cathflo activase 2mg	thrombolytic treatment
Vibratome	Stoelting	51425	TTC infacrt
Xylazine	CCM, UVA		anesthesia