フィブリン富化およびtPA感受性光血栓性脳卒中モデル

要約

従来の光血栓性脳卒中(PTS)モデルは、主に組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)溶解性治療に対して高い耐性の高密度血小板凝集体を誘導します。ここでは、光活性化のためにトロンビンと感光性色素を同時注入することにより、修正されたマウスPTSモデルが導入されています。トロンビン増強PTSモデルは、血小板:フィブリン血栓を混合し、tPA血栓溶解に対して非常に敏感です。

要約

理想的な血栓塞栓性脳卒中モデルには、死亡率の低い比較的単純な外科的処置、一貫した梗塞のサイズと位置、患者と同様の血小板:フィブリン混合血栓の沈殿、線溶治療に対する適切な感受性など、特定の特性が必要です。ローズベンガル(RB)色素ベースの光血栓性脳卒中モデルは、最初の2つの要件を満たしていますが、おそらく血小板に富むがフィブリンに乏しい血栓組成のために、tPAを介した溶解性治療に非常に抵抗性があります。RB色素(50 mg / kg)と血栓下用量のトロンビン(80 U / kg)の組み合わせは、中大脳動脈(MCA)の近位枝を対象とした光活性化のために、フィブリンが豊富でtPA感受性の血栓を生成する可能性があると推論します。実際、トロンビンとRB(T+RB)を組み合わせた光血栓症モデルは、免疫染色と免疫ブロットによって示されるように、血小板:フィブリン混合血栓を引き起こし、一貫した梗塞のサイズと位置を維持し、死亡率を低くしました。さらに、光活性化後2時間以内にtPA(アルテプラーゼ、10mg / kg)を静脈内注射すると、T + RB光血栓症の梗塞サイズが有意に減少しました。したがって、トロンビン増強光血栓性脳卒中モデルは、新規の血栓溶解療法を試験するための有用な実験モデルとなり得る。

概要

血管内血栓摘出術とtPA媒介性血栓溶解療法は、米国で年間~70万人の患者を苦しめている急性虚血性脳卒中に対して、米国食品医薬品局(FDA)が承認した唯一の治療法です¹。血栓摘出術の適用は大血管閉塞症(LVO)に限定されていますが、tPA血栓溶解療法は小血管閉塞を緩和する可能性があるため、どちらも急性虚血性脳卒中の貴重な治療法^です2。さらに、両方の治療法の組み合わせ(例:脳卒中発症から4.5時間以内にtPA血栓溶解療法を開始し、その後血栓摘出術を行う)により、再灌流と機能的転帰が改善されます³。このように、血栓溶解の最適化は、血栓摘出術の時代になっても、脳卒中研究にとって重要な目標であり続けています。

血栓塞栓症モデルは、血栓溶解療法の改善を目的とした前臨床脳卒中研究に不可欠なツールです。これは、機械的血管閉塞モデル(例:管腔内縫合MCA閉塞)が血栓を作らず、機械的閉塞除去後の脳血流の迅速な回復が過度に理想化されているためです^4,5。現在までに、主要な血栓塞栓症モデルには、光血栓症^6,7,8、局所塩化第二鉄(FeCl₃)アプリケーション9、MCA枝へのトロンビンのマイクロインジェクション^10,11、MCAまたは総頸動脈(CCA)へのex vivo(マイクロ)塞栓の注入12,13,14、および一過性低酸素虚血(tHI)^{15,16が含まれます。17,18}。これらの脳卒中モデルは、その後の血栓の組織学的組成とtPAを介した溶解療法に対する感受性が異なります(表1)。それらはまた、開頭術の外科的要件(in situトロンビン注射およびFeCl₃の局所適用に必要)、梗塞のサイズと位置の一貫性(例、微小塞栓のCCA注入は非常に異なる結果をもたらす)、および心血管系への全体的な影響(例:tHIは心拍数と心拍出量を増加させ、低酸素誘発性末梢血管拡張を補う)にもさまざまである。

RB色素ベースの光血栓性脳卒中(PTS)モデルには、開頭術を使わない簡単な外科的処置、低い死亡率(通常<5%)、梗塞のサイズと位置の予測可能(MCA供給領域内)など、多くの魅力的な特徴がありますが、2つの大きな制限があります。⁸ 最初の注意点は、tPAを介した血栓溶解治療に対する反応が弱いかゼロであることであり、これもFeCl₃モデル^7,19,20の欠点です。PTSおよびFeCl₃脳卒中モデルの2番目の注意点は、その後の血栓が少量のフィブリンを含む高密度の血小板凝集体で構成されており、tPA溶解療法に対する回復力につながるだけでなく、急性虚血性脳卒中患者における血小板:フィブリン血栓の混合パターンからも逸脱していることです^21,22。対照的に、in situトロンビン−マイクロインジェクションモデルは、主に重合フィブリンと不確実な血小板の含有量を含む¹⁰。

上記の推論を考えると、RBと血栓下用量のトロンビンの混合は、薄くなった頭蓋骨を介したMCA標的光活性化のために、結果として生じる血栓のフィブリン成分を増加させ、tPAを介した溶解治療に対する感受性を高める可能性があると仮定しました。我々はこの仮説を確認し²³ 、ここでは修正(T+RB)光血栓性脳卒中モデルの詳細な手順を説明する。

プロトコル

このプロトコルは、バージニア大学の動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されており、実験動物のケアと使用に関する国立衛生研究所のガイドラインに従っています。 図1A は、このプロトコルの外科的処置のシーケンスを概説しています。

1. 手術のセットアップ

1. 手術の少なくとも15分前に、小動物用アダプターに温度設定37°Cの加温パッドを置きます。動物の頭を回転させるアダプター用のノーズクリップロールを用意します。麻酔薬ケタミン(60 mg / kg)/キシラジン(10 mg / kg)を準備します。
2. ハサミ、鉗子、マイクロニードルホルダー、止血剤、綿棒、縫合糸などの手術器具をオートクレーブで滅菌します(121°C、15psi、60分間)。ティッシュグルーと眼軟膏を準備します。外科医用の532nmレーザー保護ゴーグルを準備します。
   注:このプロトコルは、主要な生存手術手順を説明しており、無菌技術を使用して実施する必要があります。
3. 532nmのレーザー光源で照明システムをセットアップします。歯科用ドリルを準備します。
4. Rose Bengal溶液を生理食塩水(10 mg/mL)で調製します。分注したウシトロンビン(0.1 U/μL)をアイスバケットに置きます。
5. 手術の30分前に鎮痛剤としてケトプロフェン(4.0 mg / kg)をマウスに皮下注射するか、地域の施設ガイドラインで推奨されている鎮痛レジメンを使用します。.

2.同側総頸動脈の結紮術

1. 体重22〜30gの10〜14週齢の雄C57BL / 6NCrlマウスに、ケタミン(60 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)の筋肉内注射で麻酔します。
   注:脳血流のモニタリングによる同側総頸動脈の結紮を含む外科的処置全体は、~120分かかると予想されます。麻酔薬レジメンは通常、この期間全体にわたって有効ですが、麻酔薬の深さは少なくとも15分ごとに再評価する必要があります。これらの手順を学習している間に、麻酔を再投与する必要がある場合があります。
2. つま先をつまんで、動物が完全に麻酔されていることを確認します。CCA結紮のために左首の毛を取り除き、頭蓋骨を薄くするために頭部を脱毛クリームで除去します。
3. マウスを小動物用アダプターの上に仰臥位で置きます。ポビドンヨードと70%エタノールを交互に3回スワイプして皮膚を拭いて、手術部位を滅菌します。
4. イヤーバーを使用してマウスヘッドを固定します。解剖顕微鏡下で、正中線から外側約0.2cmのところにマイクロハサミとまっすぐな鉗子を使用して、0.5cmの左頸部切開を行います。
5. 一対の細い鋸歯状の鉗子を使用して軟部組織と筋膜を引き離し、左総頸動脈(LCCA)を露出させます。一対の細かく滑らかな鉗子を使用して、左CCAを迷走神経から慎重に分離します。
6. 20mmセグメントにカットされた5-0シルク縫合糸を使用してLCCAの周囲に恒久的なダブルノット縫合糸を配置し、滅菌創傷クリップを使用して創傷を閉じます。

3. MCA枝の上の頭蓋骨の薄化と光活性化

1. マウスをひっくり返して、小動物用アダプターの腹臥位にします。ノーズクリップロールを15°回転させます。ベタジンと70%エタノールを交互に3回スワイプして皮膚を拭いて、手術部位を滅菌します。
2. 左目と耳に沿ってマイクロハサミとまっすぐな鉗子を使用して頭皮を0.8cm切開し、目と耳の間にある側頭筋を露出させます(図1B)。
3. 解剖顕微鏡の下で、一対の細かい鋸歯状の鉗子によって、左頭頂骨の側頭筋の端に沿って0.5cmの切開を行います。マイクロハサミで側頭筋を0.3cmの垂直切開します。側頭筋を引っ込めて、頭頂骨と扁平上皮骨の端を露出させます。前頭骨と頭頂骨の間の冠状縫合のランドマークを必ず視覚化してください(図1B、C)。
4. 滅菌生理食塩水を塗布して頭蓋骨を湿らせ、左MCAを明らかにします。扁平上皮骨の近位MCA枝にマーカーペンで印を付けます。空気圧式歯科用ドリル(スピードコントローラーの50%でバリ速度設定)でマークした部分を囲む直径約1mmの円をそっと描き、下の硬膜に触れずに頭蓋骨を深さ約0.2mm薄くします。骨の非常に薄い層が残るまで穴あけを停止します。
5. トロンビン(T、0.1 U/μL、80 U/kg)とローズベンガル(RB、10 mg/mL、50 mg/kg)溶液をマウスの体重に基づいて混合します。例えば、体重25 gのマウスの場合、20 μLのトロンビン(0.1 U/μL)と125 μLのRB(10 mg/mL)を混合します。
6. インスリン注射器(#31G 針)を使用して、T + RB溶液(体重25gあたり145μL)を眼窩後洞にゆっくりと注入します。
   注:パイロット実験では、標準用量のRB色素(50 mg / kg)と混合されたトロンビンの用量を増やした場合の死亡率を調べて、光活性化を調べました。.死亡率は、80 U / kgトロンビン(n = 13)で0%、120 U / kgトロンビン(n = 7)で43%、160 U / kg(n = 5)と200 U / kgトロンビン(n = 5)の両方で100%でした。.したがって、このモデルには80 U / kgトロンビンの用量が選択されました。また、T+RBの眼窩後洞注射後の眼窩腔付近での血液凝固の横行(補足図1)や、レーザー照射を受けなかった対側半球への広範囲のフィブリン沈着(補足図2)を排除するために、レーザースペックル収縮イメージングも使用しました。
7. 乾燥を防ぐために両目に軟膏を塗ります。
8. 532nmのレーザー光(0.5mWのエネルギー)を2インチの距離で掘削した場所に20分間照射します。レーザー保護ゴーグルを通してMCAの近位枝の照明を視覚化します(図1C、D)。
   注:532nmの照明を備えたMCAは、ゴーグルの下で赤色蛍光を示します。遠位MCAは10分間の照明後に消えます。遠位MCAの流れが20分間の照明後もまだ存在する場合は、動物を除外します。
9. 20分後にレーザー照射を停止します。滅菌創傷クリップで創傷を閉じます。

4.生体内イメージング(オプション)

注:生体内での血栓形成を特徴付けるには、光活性化システム²³を備えたスピンディスク共焦点によるウイルス内イメージングを使用します。

1. 頭蓋骨の頭頂骨に直径~3mmの頭蓋窓を作ります。
2. 頭蓋窓にカバーガラスを置き、遠位MCA(直径~50μm)を20倍の水浸対物レンズの下に配置します。
3. イメージングの 5 分前に DyLight488 標識抗 GPIbβ 抗体 (0.1 mg/kg) を尾静脈注射して循環血小板を標識します。
4. トロンビン(80 U/kg)とローズベンガル(50 mg/kg)の混合溶液を5分前に眼窩後注入する。
5. 直径10μmのレーザービームを持つ561nmレーザーシステムを使用してMCAを光活性化し、血栓形成までの画像を記録します。

5. tPA投与

1. 麻酔をかけた動物を37°Cの温かいパッドの上に置きます。選択した光活性化後の時点で、ガーゼを~45°Cの温水で濡らし、テールに1分間包みます。
2. 組換えヒトtPA(10 mg / kg)を尾静脈から50%ボーラスで注入し、輸液ポンプで30分かけて50%注入します。
   注:急性虚血性脳卒中治療のための組換えヒトtPAの臨床用量は0.9 mg / kgですが、種間tPA反応性の低下を補うために、げっ歯類ではより高い用量(10 mg / kg)が一般的に使用されます。.また、前臨床脳卒中モデルにおけるtPA投与の標準プロトコルに従い、50%をボーラスとして使用し、50%を尾静脈から30分かけて注入しました²⁴。

6.脳血流(CBF)のモニター

注:tPA処理後のCBF回復を確認するために、2次元レーザースペックルコントラストイメージングシステム¹⁵ を使用し、光血栓症の直後(ステップ3.9)またはtPA処理の24時間後に記録する。

1. 麻酔をかけた動物を腹臥位に置き、頭蓋骨を露出させて頭皮を正中線で切開します。
2. 滅菌生理食塩水で頭蓋骨に潤いを与え、超音波ジェルを頭蓋骨にやさしく塗ります。CBF信号を妨害するジェル内の髪の毛や気泡を避けてください。
3. 両大脳半球のCBFをレーザースペックルコントラストイメージャーで10分間モニターします。
4. CBF画像を記録した後、ティッシュグルーで頭皮を閉じ、動物をケージに戻します。
5. 選択した領域の CBF を分析し、反対側の領域と比較した CBF 回収率を計算します。
6. その後、動物を温かいケージに戻して回復させます。マウスが麻酔から回復するまで5〜10分間監視します。湿らせた餌をケージに入れ、動物飼育施設に戻します。
   注:地域の施設ガイドラインで推奨されているように、術後の鎮痛剤を提供してください。

7. 塩化トリフェニルテトラゾリウム(TTC)染色による梗塞体積測定

1. 光血栓症の24時間後に、非生存手術に関する地域の施設ガイドラインに従って動物に深く麻酔をかけます。
   注:トリブロモエタノール(アベルチン)250 mg / kgを腹腔内(IP)注射で投与します。
2. PBSによる経心灌流を行い、新鮮な脳を採取し、3%寒天ゲルに埋め込みます。
3. 脳スライスをビブラトームで厚さ1mmに切片化し、2%TTC溶液中で10分間インキュベートします。
4. 6つの脳スライスからの梗塞の総体積をImageJソフトウェアによって絶対体積として定量化します。
   注:脳浮腫は、2つの理由でアウトカム測定として使用されませんでした。まず、TTC染色は、浮腫よりも重篤な結果である組織の生存率を(ミトコンドリアの減少活性を介して)測定します。第二に、梗塞が進行すると、血管原性浮腫と細胞傷害性浮腫の両方が発生し、標準的な脳浮腫測定方法では簡単に区別できません。しかし、抗免疫グロビン(IgG)標識を用いて血液脳関門(BBB)の完全性を評価したところ、RB脳卒中モデルとT+RB脳卒中モデルの両方で、光活性化後6時間で同等のIgG血管外漏出が認められました(補足図3)。

8.血栓形成測定

注:血栓形成を測定するには、光血栓症の1時間後と2時間後に脳を採取し、免疫化学(IHC)によるMCAの血栓測定と、イムノブロットによる脳半球のフィブリン測定をそれぞれ行います。

1. 血栓組成の特性評価のためにIHCを実施します。4%パラホルムアルデヒドで脳を一晩固定し、OCT包埋用に30%スクロースで脳を脱水します。
2. 矢状配向で脳を20μmの厚さで切片化し、フィブリノーゲン、血小板(糖タンパク質IIb)、赤血球(TER119)、血管(イソレクチンGS-IB4)に対する特異的抗体でIHCを行います。
3. フィブリノーゲンに対する抗体を用いたイムノブロットにより、脳半球のフィブリンを測定します。

結果

まず、RBとT+RB光血栓誘発血栓のフィブリン含有量を比較しました。マウスは、光活性化後2時間で固定剤の経心灌流によって犠牲にされ、縦方向および横方向の平面におけるMCA枝の免疫蛍光染色のために脳を除去した。RB光血栓症では、MCA枝はCD41⁺血小板と少量のフィブリンで密集していました(図2A、C)。対照的に、T+RB光血栓症のMCA枝は、ランダムに?...

ディスカッション

1985年に導入された従来のRB光血栓性脳卒中は、脳梗塞の簡便な外科的処置、低死亡率、高い再現性のための魅力的な限局性脳虚血モデルです。5 このモデルでは、光力学的色素RBは光励起時に血小板を急速に活性化し、血管を閉塞する高密度の凝集体を引き起こします^5,8,23。しかし、RB誘発性血栓中の少量...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Sigma	T8877	infarct
4-0 Nylon monofilament suture	LOOK	766B	surgical supplies
5-0 silk suture	Harvard Apparatus	624143	surgical supplies
543nm laser beam	Melles Griot	25-LGP-193-249	photothrombosis
adult male mice	Charles River	C57BL/6	10~14 weeks old (22~30 g)
Anesthesia bar for mouse adaptor	machine shop, UVA		surgical setup
Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol)	Sigma	T48402	euthanasia
Dental drill	Dentamerica	Rotex 782	surgical setup
Digital microscope	Dino-Lite	AM2111	brain imaging
Dissecting microscope	Olympus	SZ40	surgical setup
Fine curved forceps (serrated)	FST	11370-31	surgical instrument
Fine curved forceps (smooth)	FST	11373-12	surgical instrument
goat anti-rabbit Alexa Fluro 488	Invitrogen	A11008	Immunohistochemistry
Halsted-Mosquito hemostats	FST	13008-12	surgical instrument
Heat pump with warming pad	Gaymar	TP700	surgical setup
infusion pump	KD Scientific	200	thrombolytic treatment
Insulin syringe with 31G needle	BD	328291	photothrombosis
Ketamine	CCM, UVA		anesthesia
Laser protective google 532nm	Thorlabs	LG3	photothrombosis
Ketoprofen	CCM, UVA		NSAID analgesia
micro needle holders	FST	12060-01	surgical instrument
micro scissors	FST	15000-03	surgical instrument
MoorFLPI-2 blood flow imager	Moor	780-nm laser source	Laser Speckle Contrast Imaging
Mouse adaptor	RWD	68014	surgical setup
Puralube Vet ointment	Fisher	NC0138063	eye dryness prevention
Retractor tips	Kent Scientific	Surgi-5014-2	surgical setup
Rose Bengal	Sigma	198250	photothrombosis
Thrombin	Sigma	T7513	photothrombosis
Tissue glue	Abbott Laboratories	NC9855218	surgical supplies
tPA	Genetech	Cathflo activase 2mg	thrombolytic treatment
Vibratome	Stoelting	51425	TTC infacrt
Xylazine	CCM, UVA		anesthesia