Ein mit Fibrin angereichertes und tPA-sensitives photothrombotisches Schlaganfallmodell

Zusammenfassung

Traditionelle photothrombotische Schlaganfallmodelle (PTS) induzieren hauptsächlich dichte Thrombozytenaggregate mit einer hohen Resistenz gegen eine lytische Behandlung mit Gewebeplasminogenaktivator (tPA). Hier wird ein modifiziertes murines PTS-Modell durch Co-Injektion von Thrombin und lichtempfindlichem Farbstoff zur Photoaktivierung eingeführt. Das Thrombin-verstärkte PTS-Modell erzeugt gemischte Thrombozyten-Fibrin-Gerinnsel und ist hochempfindlich gegenüber tPA-Thrombolyse.

Zusammenfassung

Ein ideales thromboembolisches Schlaganfallmodell erfordert bestimmte Eigenschaften, darunter relativ einfache chirurgische Eingriffe mit geringer Mortalität, eine konsistente Infarktgröße und -lokalisation, Ausfällung von Blutplättchen-Fibrin-gemischten Blutgerinnseln, die denen bei Patienten ähneln, und eine ausreichende Empfindlichkeit gegenüber fibrinolytischer Behandlung. Das photothrombotische Schlaganfallmodell auf Basis von Rosen-Bengalen (RB) erfüllt die ersten beiden Anforderungen, ist aber sehr refraktär gegenüber tPA-vermittelter lytischer Behandlung, vermutlich aufgrund seiner plättchenreichen, aber fibrinarmen Gerinnselzusammensetzung. Wir gehen davon aus, dass die Kombination von RB-Farbstoff (50 mg/kg) und einer subthrombotischen Dosis Thrombin (80 U/kg) zur Photoaktivierung auf den proximalen Ast der mittleren Hirnarterie (MCA) fibrinangereicherte und tPA-empfindliche Gerinnsel erzeugen kann. In der Tat löste das kombinierte Photothrombosemodell von Thrombin und RB (T+RB) gemischte Blutgerinnsel aus Thrombozyten und Fibrin aus, wie durch Immunfärbung und Immunablots gezeigt wurde, und behielt konsistente Infarktgrößen und -lokalisationen sowie eine niedrige Mortalität bei. Darüber hinaus verringerte die intravenöse Injektion von tPA (Alteplase, 10 mg/kg) innerhalb von 2 h nach der Photoaktivierung die Infarktgröße bei T+RB-Photothrombose signifikant. Daher könnte das Thrombin-verstärkte photothrombotische Schlaganfallmodell ein nützliches experimentelles Modell sein, um neuartige thrombolytische Therapien zu testen.

Einleitung

Die endovaskuläre Thrombektomie und die tPA-vermittelte Thrombolyse sind die einzigen beiden von der U.S. Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen Therapien des akuten ischämischen Schlaganfalls, von dem in den Vereinigten Staaten jährlich ~700.000 Patienten betroffen sind¹. Da die Anwendung der Thrombektomie auf den Verschluss großer Gefäße (LVO) beschränkt ist, während die tPA-Thrombolyse Verschlüsse kleiner Gefäße lindern kann, sind beide wertvolle Therapien des akuten ischämischen Schlaganfalls². Darüber hinaus verbessert die Kombination beider Therapien (z.B. Einleitung einer tPA-Thrombolyse innerhalb von 4,5 Stunden nach Beginn des Schlaganfalls, gefolgt von einer Thrombektomie) die Reperfusion und die funktionellen Ergebnisse³. So bleibt die Optimierung der Thrombolyse auch im Zeitalter der Thrombektomie ein wichtiges Ziel für die Schlaganfallforschung.

Thromboembolische Modelle sind ein wesentliches Werkzeug für die präklinische Schlaganfallforschung mit dem Ziel, thrombolytische Therapien zu verbessern. Dies liegt daran, dass mechanische Gefäßverschlussmodelle (z. B. intraluminaler Naht-MCA-Verschluss) keine Blutgerinnsel erzeugen und die schnelle Wiederherstellung des zerebralen Blutflusses nach der Entfernung des mechanischen Verschlusses übermäßig idealisiert ist ^4,5. Zu den wichtigsten thromboembolischen Modellen gehören bisher die Photothrombose ^6,7,8, die topische Anwendung von Eisenchlorid (FeCl₃)⁹, die Mikroinjektion von Thrombin in den MCA-Zweig 10,11, die Injektion von ex vivo (Mikro-)Embolien in das MCA oder die Arteria carotis communis (CCA)12,13,14 und die transiente Hypoxie-Ischämie (tHI)^{15,16, 17,18}. Diese Schlaganfallmodelle unterscheiden sich in der histologischen Zusammensetzung der nachfolgenden Gerinnsel und der Sensitivität gegenüber tPA-vermittelten lytischen Therapien (Tabelle 1). Sie unterscheiden sich auch in den chirurgischen Anforderungen der Kraniotomie (erforderlich für die In-situ-Thrombininjektion und die topische Anwendung von FeCl₃), der Konsistenz der Infarktgröße und -lokalisation (z. B. führt die CCA-Infusion von Mikroembolien zu sehr unterschiedlichen Ergebnissen) und den globalen Auswirkungen auf das kardiovaskuläre System (z. B. erhöht tHI die Herzfrequenz und das Herzzeitvolumen, um die Hypoxie-induzierte periphere Vasodilatation zu kompensieren).

Das RB-Farbstoff-basierte photothrombotische Schlaganfallmodell (PTS) hat viele attraktive Merkmale, darunter einfache kraniotomiefreie chirurgische Eingriffe, eine niedrige Mortalität (typischerweise < 5 %) und eine vorhersagbare Größe und Lokalisation des Infarkts (im MCA-liefernden Bereich), aber es hat zwei wesentliche Einschränkungen. ⁸ Der erste Vorbehalt ist das schwache bis Null-Ansprechen auf eine tPA-vermittelte thrombolytische Behandlung, was auch ein Nachteil des FeCl-3-Modells ^{ist 7,19,20}. Der zweite Vorbehalt von PTS- und FeCl-3-Schlaganfallmodellen besteht darin, dass die nachfolgenden Thromben aus dicht gepackten Thrombozytenaggregaten mit einer geringen Menge Fibrin bestehen, was nicht nur zu ihrer Widerstandsfähigkeit gegenüber der tPA-lytischen Therapie führt, sondern auch vom Muster der gemischten Thrombozyten:Fibrin-Thromben bei akuten ischämischen Schlaganfallpatienten abweicht ^21,22. Im Gegensatz dazu besteht das in situ Thrombin-Mikroinjektionsmodell hauptsächlich aus polymerisiertem Fibrin und einem unsicheren Gehalt an Thrombozyten¹⁰.

Vor diesem Hintergrund stellten wir die Hypothese auf, dass die Beimischung von RB und einer subthrombotischen Dosis Thrombin zur MCA-gezielten Photoaktivierung durch einen ausgedünnten Schädel die Fibrinkomponente in der resultierenden Thrombe erhöhen und die Empfindlichkeit gegenüber tPA-vermittelter lytischer Behandlung erhöhen kann. Wir haben diese Hypothese ^{bestätigt,23} und hier beschreiben wir detaillierte Prozeduren des modifizierten (T+RB) photothrombotischen Schlaganfallmodells.

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Protokoll

Dieses Protokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of Virginia genehmigt und folgt der Richtlinie der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Abbildung 1A zeigt die Abfolge der chirurgischen Eingriffe dieses Protokolls.

1. Aufbau der Chirurgie

1. Legen Sie mindestens 15 Minuten vor der Operation ein Wärmekissen mit einer Temperatureinstellung von 37 °C auf den Kleintieradapter. Bereiten Sie eine Nasenklammerrolle für den Adapter vor, die die Drehung des Tierkopfes ermöglicht. Bereiten Sie die Anästhetika Ketamin (60 mg/kg)/ Xylazin (10 mg/kg) vor.
2. Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente, einschließlich Scheren, Pinzetten, Mikronadelhalter, Hämostaten, Wattestäbchen und Nähte, mit einem Autoklaven (121 °C bei 15 psi für 60 Minuten). Bereiten Sie Gewebekleber und Augensalbe vor. Bereiten Sie die 532-nm-Laserschutzbrille für Chirurgen vor.
   HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt ein wichtiges Verfahren zur Überlebenschirurgie und sollte mit aseptischen Techniken durchgeführt werden.
3. Richten Sie das Beleuchtungssystem mit einer 532-nm-Laserquelle ein. Bereite einen Zahnarztbohrer vor.
4. Bereiten Sie die Rosenbengalenlösung in Kochsalzlösung (10 mg/ml) zu. Ein aliquotes Rinderthrombin (0,1 U/μl) auf einen Eiskübel geben.
5. Injizieren Sie der Maus Ketoprofen (4,0 mg/kg) 30 Minuten vor der Operation subkutan als Analgesie oder verwenden Sie das von den lokalen institutionellen Richtlinien empfohlene Analgetikum-Schema.

2. Ligatur der ipsilateralen Arteria carotis communis

1. 10-14 Wochen alte männliche C57BL/6NCrl-Mäuse mit einem Gewicht von 22 bis 30 g durch intramuskuläre Injektion von Ketamin (60 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) anästhesieren.
   HINWEIS: Der gesamte chirurgische Eingriff, der die Ligatur der ipsilateralen Arteria carotis communis durch die Überwachung des zerebralen Blutflusses umfasst, wird voraussichtlich ~120 Minuten dauern. Das Anästhesieschema ist in der Regel für die gesamte Dauer wirksam, aber die Anästhesietiefe sollte mindestens alle 15 Minuten neu beurteilt werden. Beim Erlernen dieser Verfahren kann es notwendig sein, die Anästhesie neu zu dosieren.
2. Führen Sie eine Zehenkneifung durch, um sicherzustellen, dass das Tier vollständig betäubt ist. Entfernen Sie die Haare am linken Hals für die CCA-Ligatur und den Kopf für die Schädelausdünnung mit der Haarentfernungscreme.
3. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf den Kleintieradapter. Sterilisieren Sie den Operationsbereich, indem Sie die Haut mit drei abwechselnden Streichen von Povidon-Jod und 70%igem Ethanol abwischen.
4. Befestigen Sie den Mauskopf mit Ohrbügeln. Machen Sie unter einem Präpariermikroskop einen 0,5 cm langen Schnitt der linken Halswirbelsäule mit einer Mikroschere und einer geraden Pinzette etwa 0,2 cm seitlich der Mittellinie.
5. Verwenden Sie eine feine gezackte Pinzette, um das Weichgewebe und die Faszie auseinander zu ziehen, um die linke Halsschlagader (LCCA) freizulegen. Trennen Sie vorsichtig den linken CCA vom Vagusnerv mit einer feinen, glatten Pinzette.
6. Legen Sie eine permanente Doppelknotennaht um die LCCA mit 5-0-Seidennaht, die in 20-mm-Segmente geschnitten wird, und verschließen Sie die Wunde dann mit sterilen Wundclips.

3. Ausdünnung des Schädels über dem MCA-Ast und Photoaktivierung

1. Drehen Sie die Maus in die Bauchlage des Kleintieradapters. Drehen Sie die Nasenbügelrolle um 15°. Sterilisieren Sie den Operationsbereich, indem Sie die Haut mit drei abwechselnden Streichen von Betadin und 70%igem Ethanol abwischen.
2. Machen Sie einen 0,8 cm langen Schnitt in der Kopfhaut mit einer Mikroschere und einer geraden Pinzette entlang des linken Auges und Ohrs, um den Schläfenmuskel freizulegen, der sich zwischen Auge und Ohr befindet (Abbildung 1B).
3. Unter dem Präpariermikroskop wird mit einer feinen gezackten Zange ein 0,5 cm langer Schnitt entlang des Randes des Schläfenmuskels am linken Scheitelbein gemacht. Machen Sie einen zweiten 0,3 cm langen vertikalen Schnitt am Schläfenmuskel mit einer Mikroschere. Ziehen Sie den Schläfenmuskel zurück, um den Rand des Scheitelknochens und des Plattenepithelknochens freizulegen. Stellen Sie sicher, dass Sie die Markierung der koronalen Naht zwischen dem Stirn- und dem Scheitelbein visualisieren (Abbildung 1B,C).
4. Befeuchten Sie den Schädel, indem Sie sterile Kochsalzlösung auftragen, um das linke MCA freizulegen. Markieren Sie den proximalen MCA-Ast auf dem Plattenepithelknochen mit einem Markerstift. Zeichnen Sie mit dem pneumatischen Dentalbohrer vorsichtig einen Kreis mit einem Durchmesser von etwa 1 mm, der den markierten Bereich umgibt (Gratgeschwindigkeitseinstellung auf 50 % des Drehzahlreglers), und verdünnen Sie dann den Schädel etwa 0,2 mm tief, ohne die darunter liegende Dura zu berühren. Stoppen Sie das Bohren, bis eine sehr dünne Knochenschicht übrig bleibt.
5. Mischen Sie die Thrombin- (T, 0,1 U/μl, 80 U/kg) und Rosenbengalenlösung (RB, 10 mg/ml, 50 mg/kg) basierend auf dem Körpergewicht der Maus. Bei einer Maus mit einem Körpergewicht von 25 g mischen Sie beispielsweise 20 μl Thrombin (0,1 U/μl) und 125 μl RB (10 mg/ml).
6. T+RB-Lösung (145 μl pro 25 g Körpergewicht) langsam mit einer Insulinspritze (#31G Nadel) in den Retroorbitalsinus injizieren.
   ANMERKUNG: In Pilotexperimenten wurde die Mortalitätsrate bei steigenden Dosen von Thrombin gemischt mit der Standarddosis des RB-Farbstoffs (50 mg/kg) auf Photoaktivierung untersucht. Die Mortalität betrug 0 % für 80 U/kg Thrombin (n=13), 43 % für 120 U/kg Thrombin (n=7) und 100 % für 160 U/kg (n=5) und 200 U/kg Thrombin (n=5). Für dieses Modell wurde daher eine Dosis von 80 U/kg Thrombin gewählt. Die Laser-Speckle-Kontrakt-Bildgebung wurde auch verwendet, um die Möglichkeit einer zügellosen Blutgerinnung in der Nähe der Orbitalhöhle nach retroorbitaler Sinusinjektion von T+RB auszuschließen (Ergänzende Abbildung 1) sowie eine ausgedehnte Fibrinablagerung in der kontralateralen Hemisphäre, die keiner Laserbeleuchtung ausgesetzt war (Ergänzende Abbildung 2).
7. Tragen Sie Augensalbe auf beide Augen auf, um Trockenheit zu vermeiden.
8. Bringen Sie den Strahler mit einem 532 nm Laserlicht (mit 0,5 mW Energie) 20 Minuten lang auf die gebohrte Stelle mit einem Abstand von 2 Zoll auf. Visualisieren Sie die Beleuchtung auf dem proximalen Ast des MCA durch eine Laserschutzbrille (Abbildung 1C,D).
   HINWEIS: Der MCA mit 532 nm Beleuchtung zeigt rote Fluoreszenz unter der Brille. Das distale MCA verschwindet nach 10 Minuten Beleuchtung. Schließen Sie das Tier aus, wenn der distale MCA-Fluss nach 20-minütiger Beleuchtung immer noch vorhanden ist.
9. Stoppen Sie die Laserbeleuchtung nach 20 Minuten. Verschließen Sie die Wunde mit sterilen Wundklammern.

4. Intravitale Bildgebung (optional)

ANMERKUNG: Um die Thrombusbildung in-vivo zu charakterisieren, ist die intravirale Bildgebung durch ein konfokales Spin-Scheiben-Photoaktivierungssystem²³ zu verwenden.

1. Machen Sie ein Schädelfenster mit einem Durchmesser von ~3 mm auf dem Scheitelbein des Schädels.
2. Platzieren Sie ein Deckglas auf dem Schädelfenster und lokalisieren Sie den distalen MCA (~50 μm Durchmesser) unter einem 20-fachen Wasserimmersionsobjektiv.
3. Markierung der zirkulierenden Blutplättchen durch Injektion der Schwanzvene mit DyLight488-konjugiertem Anti-GPIbβ-Antikörper (0,1 mg/kg) 5 Minuten vor der Bildgebung.
4. Die Mischungslösung aus Thrombin (80 U/kg) und Rosenbengalen (50 mg/kg) wird 5 Minuten vor der Bildgebung retroorbital injiziert.
5. Photoaktivieren Sie das MCA mit einem 561 nm Lasersystem mit einem Laserstrahl von 10 μm Durchmesser und zeichnen Sie das Bild bis zur Thrombusbildung auf.

5. tPA-Verabreichung

1. Legen Sie das betäubte Tier auf eine 37 °C warme Unterlage. Befeuchten Sie zum gewählten Zeitpunkt nach der Photoaktivierung eine Gaze mit ~45 °C warmem Wasser und wickeln Sie sie 1 Minute lang um den Schwanz.
2. Rekombinantes humanes tPA (10 mg/kg) durch die Schwanzvene mit einem 50%igen Bolus und 50% über 30 min mittels Infusionspumpe injizieren.
   HINWEIS: Obwohl die klinische Dosis von rekombinantem humanem tPA für die Behandlung eines akuten ischämischen Schlaganfalls 0,9 mg/kg beträgt, wird bei Nagetieren üblicherweise eine höhere Dosis (10 mg/kg) verwendet, um die reduzierte tPA-Reaktivität zwischen verschiedenen Spezies auszugleichen. Wir folgten auch dem Standardprotokoll der tPA-Verabreichung in präklinischen Schlaganfallmodellen, wobei 50 % als Bolus und 50 % über die Schwanzvene über 30 Minuten infundiert ^wurden.24

6. Überwachung des zerebralen Blutflusses (CBF)

HINWEIS: Um die CBF-Erholung nach einer tPA-Behandlung zu bestätigen, verwenden Sie ein zweidimensionales Laser-Speckle-Kontrast-Bildgebungssystem¹⁵ und zeichnen Sie unmittelbar nach der Photothrombose (Schritt 3.9) oder 24 Stunden nach der tPA-Behandlung auf.

1. Legen Sie das betäubte Tier in die Bauchlage und machen Sie einen Schnitt in der Mittellinie der Kopfhaut, wobei der Schädel freiliegt.
2. Befeuchten Sie den Schädel mit steriler Kochsalzlösung und tragen Sie das Ultraschallgel sanft auf den Schädel auf. Vermeiden Sie Haare und Blasen im Gel, die das CBF-Signal stören.
3. Überwachen Sie die CBF in beiden Gehirnhälften unter einem Laser-Speckle-Kontrast-Imager für 10 Minuten.
4. Verschließen Sie nach der Aufnahme des CBF-Bildes die Kopfhaut mit Gewebekleber und setzen Sie das Tier wieder in den Käfig ein.
5. Analysieren Sie CBF in den ausgewählten Regionen und berechnen Sie den Prozentsatz der CBF-Rückgewinnung im Vergleich zur kontralateralen Region.
6. Setzen Sie das Tier dann wieder in einen warmen Käfig, um sich zu erholen. Beobachten Sie die Mäuse 5-10 Minuten lang, bis sie sich von der Narkose erholt haben. Legen Sie das angefeuchtete Futter in den Käfig und geben Sie es an die Tierpflegeeinrichtung zurück.
   HINWEIS: Bieten Sie eine postoperative Analgesie an, wie von den lokalen institutionellen Richtlinien empfohlen.

7. Infarktvolumenmessung durch Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-Färbung

1. Vierundzwanzig Stunden nach der Photothrombose ist das Tier gemäß den lokalen institutionellen Richtlinien für Nicht-Überlebensoperationen tief zu betäuben.
   HINWEIS: Wir verabreichen Tribromethanol (Avertin) 250 mg/kg als intraperitoneale (IP) Injektion.
2. Führen Sie eine transkardiale Perfusion mit PBS durch, sammeln Sie frisches Gehirn und betten Sie es in 3% Agar-Gel ein.
3. Den 1 mm dicken Hirnschnitt mit einem Vibratom durchtrennen und 10 min in 2%iger TTC-Lösung inkubieren.
4. Quantifizieren Sie das gesamte Infarktvolumen aus 6 Gehirnschnitten als absolutes Volumen mit der ImageJ-Software.
   HINWEIS: Das Hirnödem wurde aus zwei Gründen nicht als Ergebnismessung verwendet. Erstens misst die TTC-Färbung die Lebensfähigkeit des Gewebes (über die mitochondriale Reduktionsaktivität), was eine schwerwiegendere Folge als ein Ödem ist. Zweitens treten im Verlauf des Infarkts sowohl vasogene als auch zytotoxische Ödeme auf, die mit den Standard-Hirnödem-Messmethoden nicht leicht unterschieden werden können. Wir haben jedoch die Anti-Immunglobin-Markierung (IgG) verwendet, um die Integrität der Blut-Hirn-Schranke (BHS) zu beurteilen, und haben eine vergleichbare IgG-Extravasation 6 h nach der Photoaktivierung sowohl in RB- als auch in T+RB-Schlaganfallmodellen gefunden (ergänzende Abbildung 3).

8. Messung der Thrombusbildung

HINWEIS: Um die Thrombusbildung zu messen, entnehmen Sie das Gehirn 1 h und 2 h nach der Photothrombose zur Thrombusmessung bei MCA mittels Immunchemie (IHC) bzw. zur Fibrinmessung in der Gehirnhälfte mittels Immunoblot.

1. Führen Sie die IHC zur Charakterisierung der Gerinnselzusammensetzung durch. Fixieren Sie das Gehirn über Nacht mit 4 % Paraformaldehyd und dehydrieren Sie das Gehirn dann mit 30 % Saccharose für die OCT-Einbettung.
2. Schneiden Sie das Gehirn mit sagittaler Ausrichtung in 20 μm Dicke und führen Sie die IHC mit spezifischen Antikörpern gegen Fibrinogen, Blutplättchen (Glykoprotein IIb), rote Blutkörperchen (TER119) und Blutgefäße (Isolektin GS-IB4) durch.
3. Führen Sie die Messung von Fibrin in der Gehirnhälfte durch Immunoblot mit einem Antikörper gegen Fibrinogen durch.

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Ergebnisse

Zunächst verglichen wir den Fibringehalt in RB mit T+RB-Photothrombose-induzierten Blutgerinnseln. Die Mäuse wurden 2 Stunden nach der Photoaktivierung durch transkardiale Perfusion von Fixiermitteln getötet, und die Gehirne wurden für die Immunfluoreszenzfärbung des MCA-Zweiges in der Längs- und Transversalebene entfernt. Bei der RB-Photothrombose war der MCA-Zweig dicht gepackt mit CD41⁺-Thrombozyten und wenig Fibrin (Abbildung 2A,C). Im Gegensatz dazu war...

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Diskussion

Der traditionelle photothrombotische RB-Schlaganfall, der 1985 eingeführt wurde, ist ein attraktives Modell der fokalen zerebralen Ischämie für einfache chirurgische Eingriffe, niedrige Mortalität und hohe Reproduzierbarkeit des Hirninfarkts. ⁵ In diesem Modell aktiviert der photodynamische Farbstoff RB die Blutplättchen bei Lichtanregung schnell, was zu dichten Aggregaten führt, die das Blutgefäß verschließen ^5,8,23.

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Sigma	T8877	infarct
4-0 Nylon monofilament suture	LOOK	766B	surgical supplies
5-0 silk suture	Harvard Apparatus	624143	surgical supplies
543nm laser beam	Melles Griot	25-LGP-193-249	photothrombosis
adult male mice	Charles River	C57BL/6	10~14 weeks old (22~30 g)
Anesthesia bar for mouse adaptor	machine shop, UVA		surgical setup
Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol)	Sigma	T48402	euthanasia
Dental drill	Dentamerica	Rotex 782	surgical setup
Digital microscope	Dino-Lite	AM2111	brain imaging
Dissecting microscope	Olympus	SZ40	surgical setup
Fine curved forceps (serrated)	FST	11370-31	surgical instrument
Fine curved forceps (smooth)	FST	11373-12	surgical instrument
goat anti-rabbit Alexa Fluro 488	Invitrogen	A11008	Immunohistochemistry
Halsted-Mosquito hemostats	FST	13008-12	surgical instrument
Heat pump with warming pad	Gaymar	TP700	surgical setup
infusion pump	KD Scientific	200	thrombolytic treatment
Insulin syringe with 31G needle	BD	328291	photothrombosis
Ketamine	CCM, UVA		anesthesia
Laser protective google 532nm	Thorlabs	LG3	photothrombosis
Ketoprofen	CCM, UVA		NSAID analgesia
micro needle holders	FST	12060-01	surgical instrument
micro scissors	FST	15000-03	surgical instrument
MoorFLPI-2 blood flow imager	Moor	780-nm laser source	Laser Speckle Contrast Imaging
Mouse adaptor	RWD	68014	surgical setup
Puralube Vet ointment	Fisher	NC0138063	eye dryness prevention
Retractor tips	Kent Scientific	Surgi-5014-2	surgical setup
Rose Bengal	Sigma	198250	photothrombosis
Thrombin	Sigma	T7513	photothrombosis
Tissue glue	Abbott Laboratories	NC9855218	surgical supplies
tPA	Genetech	Cathflo activase 2mg	thrombolytic treatment
Vibratome	Stoelting	51425	TTC infacrt
Xylazine	CCM, UVA		anesthesia