Обогащенная фибрином и чувствительная к tPA модель фототромботического инсульта

Резюме

Традиционные модели фототромботического инсульта (ПТС) в основном индуцируют плотные агрегаты тромбоцитов с высокой резистентностью к тканевой терапии активатором плазминогена (tPA)-литическим лечением. Здесь модифицированная мышиная модель ПТС вводится путем совместного введения тромбина и фоточувствительного красителя для фотоактивации. Модель ПТС, усиленная тромбином, производит смешанные тромбоцитарно-фибриновые сгустки и обладает высокой чувствительностью к tPA-тромболизису.

Аннотация

Идеальная модель тромбоэмболического инсульта требует определенных свойств, в том числе относительно простых хирургических процедур с низкой смертностью, постоянного размера и локализации инфаркта, осаждения тромбоцитов и сгустков крови с примесью тромбоцитов и фибрина, аналогичных таковым у пациентов, и адекватной чувствительности к фибринолитическому лечению. Модель фототромботического инсульта на основе красителя бенгальской розы (RB) отвечает первым двум требованиям, но обладает высокой рефрактерностью к tPA-опосредованному литической терапии, предположительно из-за богатого тромбоцитами, но бедного фибрином состава сгустков. Мы полагаем, что комбинация RB-красителя (50 мг/кг) и субтромботической дозы тромбина (80 ЕД/кг) для фотоактивации, направленной на проксимальную ветвь средней мозговой артерии (МЦА), может приводить к образованию обогащенных фибрином и tPA-чувствительных тромбов. Действительно, модель комбинированного фототромбоза с тромбином и RB (T+RB) вызывала смешанные тромбоцитарно-фибриновые тромбы, как показали иммуноокрашивание и иммуноблоты, и поддерживала постоянные размеры и локализацию инфаркта плюс низкую смертность. Кроме того, внутривенное введение tPA (Alteplase, 10 мг/кг) в течение 2 ч после фотоактивации значительно уменьшало размер инфаркта при фототромбозе T+RB. Таким образом, модель фототромботического инсульта, усиленная тромбином, может быть полезной экспериментальной моделью для тестирования новых методов тромболитической терапии.

Введение

Эндоваскулярная тромбэктомия и tPA-опосредованный тромболизис являются единственными двумя одобренными Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) методами лечения острого ишемического инсульта, которым ежегодно^{в Соединенных Штатах} страдают ~700 000 пациентов. Поскольку применение тромбэктомии ограничено окклюзией крупных сосудов (LVO), в то время как tPA-тромболизис может облегчить окклюзию мелких сосудов, оба метода лечения острого ишемического инсульта² являются ценными. Кроме того, комбинация обоих методов лечения (например, начало tPA-тромболизиса в течение 4,5 часов после начала инсульта с последующей тромбэктомией) улучшает реперфузию и функциональные исходы³. Таким образом, оптимизация тромболизиса остается важной целью для исследований инсульта, даже в эпоху тромбэктомии.

Тромбоэмболические модели являются важным инструментом для доклинических исследований инсульта, направленных на улучшение тромболитической терапии. Это связано с тем, что модели механической окклюзии сосудов (например, внутрипросветная окклюзия MCA) не приводят к образованию тромбов, а быстрое восстановление мозгового кровотока после удаления механической окклюзии чрезмерно идеализировано ^4,5. На сегодняшний день основные модели тромбоэмболии включают фототромбоз ^6,7,8, местное применение хлорида железа (FeCl₃)⁹, микроинъекцию тромбина в ветвь MCA 10,11, инъекцию ex vivo (микро)эмболии в MCA или общую сонную артерию (CCA)12,13,14 и транзиторную гипоксию-ишемию (tHI)^{15,16, 17,18}. Эти модели инсульта различаются по гистологическому составу последующих тромбов и чувствительности к tPA-опосредованной литической терапии (табл. 1). Они также различаются по хирургическому требованию трепанации черепа (необходимой для инъекции тромбина in situ и местного применения FeCl₃), постоянству размера и расположения инфаркта (например, CCA-инфузия микроэмболов дает очень разные результаты) и глобальному воздействию на сердечно-сосудистую систему (например, tHI увеличивает частоту сердечных сокращений и сердечный выброс, чтобы компенсировать вызванную гипоксией периферическую вазодилатацию).

Модель фототромботического инсульта (ПТС) на основе красителя RB имеет много привлекательных особенностей, включая простые хирургические процедуры без трепанации черепа, низкую смертность (обычно < 5%) и предсказуемый размер и расположение инфаркта (на территории, поставляющей MCA), но у нее есть два основных ограничения. ⁸ Первое предостережение – слабый или нулевой ответ на tPA-опосредованную тромболитическую терапию, что также является недостатком модели FeCl₃ ^7,19,20. Второе предостережение моделей инсульта PTS и FeCl₃ заключается в том, что последующие тромбы состоят из плотно упакованных агрегатов тромбоцитов с небольшим количеством фибрина, что не только приводит к их устойчивости к tPA-литической терапии, но и отклоняется от картины смешанных тромбоцитов:фибриновых тромбов у пациентов с острым ишемическим инсультом^21,22. В отличие от этого, модель микроинъекций тромбина in situ в основном включает полимеризованный фибрин и неопределенное содержание тромбоцитов¹⁰.

Учитывая вышеизложенное, мы предположили, что примесь RB и субтромботической дозы тромбина для MCA-направленной фотоактивации через истонченный череп может увеличить фибриновый компонент в образующихся тромбах и повысить чувствительность к tPA-опосредованному литическому лечению. Мы подтвердили эту ^{гипотезу,23} и в данной статье подробно описываем процедуры модифицированной (Т+РБ) модели фототромботического инсульта.

протокол

Этот протокол одобрен Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) при Университете Вирджинии и соответствует Руководству Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. На рисунке 1А показана последовательность хирургических процедур этого протокола.

1. Подготовка к операции

1. Положите грелку с температурой 37 °C на адаптер для мелких животных не менее чем за 15 минут до операции. Подготовьте ролик с зажимом для носа для адаптера, который позволяет поворачивать голову животного. Приготовьте анестетики Кетамин (60 мг/кг)/Ксилазин (10 мг/кг).
2. Стерилизовать хирургические инструменты, включая ножницы, щипцы, микроиглодержатели, гемостаты, ватные палочки и швы, в автоклаве (121 °C при давлении 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 60 минут). Приготовьте тканевый клей и глазную мазь. Подготовьте для хирургов защитные очки с длиной волны лазера 532 нм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает основную хирургическую процедуру выживания и должен проводиться с использованием асептических методов.
3. Настройте систему подсветки с помощью лазерного источника с длиной волны 532 нм. Подготовьте бормашину.
4. Приготовьте раствор бенгальской розы в физиологическом растворе (10 мг/мл). Поместите аликвотный бычий тромбин (0,1 Ед/мкл) на ведро со льдом.
5. Вводите мышам кетопрофен (4,0 мг/кг) подкожно в качестве обезболивающего средства за 30 мин до операции или используйте схему обезболивания, рекомендованную местными рекомендациями.

2. Перевязка ипсилатеральной общей сонной артерии

1. Обезболивайте 10-14-недельных самцов мышей C57BL/6NCrl массой от 22 до 30 г путем внутримышечного введения кетамина (60 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидается, что вся хирургическая процедура, включающая перевязку ипсилатеральной общей сонной артерии посредством мониторинга мозгового кровотока, займет ~120 минут. Режим анестезии, как правило, эффективен в течение всего этого времени, но глубину анестезии следует пересматривать не реже чем каждые 15 минут. При изучении этих процедур может потребоваться повторная доза анестезии.
2. Защипните пальцы ног, чтобы убедиться, что животное полностью обезболино. Удалите волосы на левой шее для перевязки CCA и голову для истончения черепа с помощью крема для удаления волос.
3. Поместите мышь на адаптер для мелких животных в положении лежа на спине. Стерилизуйте операционную область, протирая кожу тремя чередующимися движениями повидон-йода и 70% этанола.
4. Закрепите головку мыши с помощью ушных планок. Под препарирующим микроскопом сделайте разрез левой шейки матки диаметром 0,5 см с помощью микроножниц и прямых щипцов на расстоянии около 0,2 см латеральнее средней линии.
5. Используйте пару тонких зубчатых щипцов, чтобы раздвинуть мягкие ткани и фасции, чтобы обнажить левую общую сонную артерию (LCCA). Осторожно отделите левую КЦА от блуждающего нерва с помощью пары тонких гладких щипцов.
6. Наложите постоянный шов с двойным узлом вокруг LCCA с помощью шелкового шовного материала 5-0, разрезанного на сегменты по 20 мм, а затем закройте рану стерильными раневыми зажимами.

3. Истончение черепа над ветвью MCA и фотоактивация

1. Переверните мышь в положение лежа на адаптере для мелких животных. Поверните ролик с зажимом для носа на 15°. Стерилизуйте операционную область, протирая кожу тремя чередующимися движениями бетадина и 70% этанола.
2. Сделайте разрез 0,8 см на волосистой части головы с помощью микроножниц и прямых щипцов вдоль левого глаза и уха, чтобы обнажить височную мышцу, которая расположена между глазом и ухом (рисунок 1B).
3. Под препарирующим микроскопом делают разрез 0,5 см по краю височной мышцы на левой теменной кости парой тонких зубчатых щипцов. Сделайте второй вертикальный разрез 0,3 см на височной мышце микроножницами. Втяните височную мышцу, чтобы обнажить край теменной кости и чешуйчатую кость. Обязательно визуализируйте ориентир венечного шва между лобной и теменной костями (рис. 1B, C).
4. Увлажните череп, нанеся стерильный физиологический раствор, чтобы обнажить левую MCA. Отметьте маркером проксимальную ветвь MCA на чешуйчатой кости. Осторожно нарисуйте круг диаметром около 1 мм, окружающий отмеченную область, с помощью пневматической бормашины (скорость заусенцев установлена на 50% от регулятора скорости), а затем утончите череп примерно на 0,2 мм в глубину, не касаясь нижней твердой мозговой оболочки. Прекратите сверление до тех пор, пока не останется очень тонкий слой кости.
5. Смешайте раствор тромбина (T, 0,1 Ед/мкл, 80 Ед/кг) и Rose bengal (RB, 10 мг/мл, 50 мг/кг) в расчете на массу тела мыши. Например, для мыши массой тела 25 г смешайте 20 мкл тромбина (0,1 Ед/мкл) и 125 мкл RB (10 мг/мл).
6. Медленно вводят раствор Т+РБ (145 мкл на 25 г массы тела) в ретроорбитальный синус инсулиновым шприцем (иглой #31G).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В пилотных экспериментах исследовали смертность от возрастающих доз тромбина, смешанных со стандартной дозой RB-красителя (50 мг/кг) для фотоактивации. Смертность составила 0% для тромбина 80 ЕД/кг (n=13), 43% для тромбина 120 ЕД/кг (n=7) и 100% для тромбина 160 ЕД/кг (n=5) и 200 ЕД/кг тромбина (n=5). Поэтому для этой модели была выбрана доза 80 ЕД/кг тромбина. Для исключения возможности безудержного свертывания крови вблизи полости глазницы после ретроорбитальной синусовой инъекции Т+RB (дополнительный рисунок 1) также использовалась лазерная спекл-контрактная визуализация, а также распространенное отложение фибрина в контралатеральном полушарии, не подвергавшемся лазерному излучению (дополнительный рисунок 2).
7. Нанесите глазную мазь на оба глаза, чтобы предотвратить сухость.
8. Нанесите осветитель лазерным лучом с длиной волны 532 нм (с энергией 0,5 мВт) на просверленный участок с расстоянием 2 дюйма в течение 20 минут. Визуализируйте освещение на проксимальной ветви MCA через лазерный защитный очки (рис. 1C,D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: MCA с подсветкой 532 нм показывает красную флуоресценцию под очками. Дистальная MCA исчезает через 10 минут освещения. Исключите животное, если дистальный поток MCA все еще присутствует после 20-минутного освещения.
9. Прекратите лазерную подсветку через 20 мин. Закройте рану стерильными зажимами.

4. Прижизненная визуализация (опционально)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для характеристики тромбообразования in vivo используют внутривирусную визуализацию с помощью спин-диска конфокального с фотоактивационной системой²³.

1. Сделайте краниальное окно диаметром ~3 мм на теменной кости черепа.
2. Поместите защитное стекло на краниальное окно и найдите дистальную MCA (~50 мкм в диаметре) под объективом для погружения в воду с 20-кратным увеличением.
3. Маркируйте циркулирующий тромбоцит путем инъекции в хвостовую вену конъюгированного антитела DyLight488 против GPIbβ (0,1 мг/кг) за 5 мин до визуализации.
4. Вводят раствор смеси тромбина (80 ЕД/кг) и бенгальской розы (50 мг/кг) ретроорбитальным путем за 5 мин до визуализации.
5. Фотоактивируйте MCA с помощью лазерной системы 561 нм с лазерным лучом диаметром 10 мкм и записывайте изображение до образования тромба.

5. Администрирование tPA

1. Поместите животное под наркозом на теплую подушку с температурой 37 °C. В выбранный момент времени после фотоактивации смочите марлю теплой водой с температурой ~45 °C и укутайте ее на хвосте на 1 минуту.
2. Вводят рекомбинантный человеческий tPA (10 мг/кг) через хвостовую вену с 50% болюсом и 50% в течение 30 мин с помощью инфузионной помпы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя клиническая доза рекомбинантного человеческого tPA для лечения острого ишемического инсульта составляет 0,9 мг/кг, более высокая доза (10 мг/кг) обычно используется у грызунов для компенсации снижения межвидовой реактивности tPA. Мы также следовали стандартному протоколу введения tPA в доклинических моделях инсульта, используя 50% в качестве болюса и 50% через хвостовую вену в течение 30 ^{минут.24}

6. Монитор мозгового кровотока (ЦБК)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для подтверждения восстановления КБВ после лечения ТПА используют двухмерную лазерную систему спекл-контрастной визуализации¹⁵ и записывают сразу после фототромбоза (шаг 3.9) или через 24 ч после лечения ТПА.

1. Поместите животное под наркозом в положение лежа на животе и сделайте разрез по средней линии на волосистой части головы, обнажив череп.
2. Увлажните череп стерильным физиологическим раствором и аккуратно нанесите ультразвуковой гель на череп. Избегайте волос и пузырьков в геле, которые будут мешать сигналу CBF.
3. Контролируйте КБФ в обоих полушариях головного мозга под лазерным спекл-контрастным тепловизором в течение 10 мин.
4. После записи изображения КБФ закройте кожу головы тканевым клеем и верните животное в клетку.
5. Анализ НБВ в выбранных регионах и расчет процента извлечения НБВ по сравнению с контралатеральной областью.
6. Затем поместите животное обратно в теплую клетку для восстановления. Наблюдайте за мышами в течение 5-10 минут, пока они не оправятся от анестезии. Поместите смоченный корм в клетку и верните ее в учреждение по уходу за животными.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте послеоперационное обезболивание в соответствии с рекомендациями местных учреждений.

7. Измерение объема инфаркта методом окрашивания трифенилтетразолия хлоридом (ТТС)

1. Через 24 часа после фототромбоза глубоко обезболивайте животное в соответствии с местными рекомендациями по хирургическому вмешательству, не связанному с выживанием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы вводим трибромэтанол (авертин) в дозе 250 мг/кг внутрибрюшинно (ВП).
2. Проводят транскардиальную перфузию с PBS, берут свежий мозг и встраивают в 3% агаровый гель.
3. Срез мозга толщиной 1 мм разрезать вибратомом и инкубировать в 2% растворе ТТС в течение 10 мин.
4. Количественно определите общий объем инфаркта из 6 срезов мозга как абсолютный объем с помощью программного обеспечения ImageJ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отек мозга не использовался в качестве показателя исхода по двум причинам. Во-первых, окрашивание TTC измеряет жизнеспособность тканей (через митохондриальную восстановительную активность), что является более серьезным последствием, чем отек. Во-вторых, по мере развития инфаркта возникают как вазогенные, так и цитотоксические отеки, которые не могут быть легко различимы стандартными методами измерения отека мозга. Тем не менее, мы использовали мечение антииммуноглобином (IgG) для оценки целостности гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и обнаружили сопоставимую экстравазацию IgG через 6 ч после фотоактивации как в RB, так и в T+RB (дополнительный рисунок 3).

8. Измерение тромбообразования

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы измерить образование тромба, соберите данные головного мозга через 1 ч и 2 ч после фототромбоза для измерения тромба в MCA с помощью иммунохимии (IHC) и для измерения фибрина в полушарии мозга с помощью иммуноблоттинга, соответственно.

1. Выполняют ВПХ для характеристики состава тромба. Зафиксируйте мозг 4% параформальдегидом на ночь, а затем обезвоживайте мозг 30% сахарозой для встраивания ОКТ.
2. Срез головного мозга с сагиттальной ориентацией толщиной 20 мкм и выполнение ВПХ специфическими антителами против фибриногена, тромбоцитов (гликопротеина IIb), эритроцитов (TER119) и кровеносных сосудов (изолектин GS-IB4).
3. Проводят измерение фибрина в полушарии головного мозга методом иммуноблоттинга с антителом против фибриногена.

Результаты

Во-первых, мы сравнили содержание фибрина в RB и T+RB, индуцированных фототромбозом. Мышей приносили в жертву транскардиальной перфузией фиксаторов через 2 ч после фотоактивации, а мозг удаляли для иммунофлуоресцентного окрашивания ветви MCA в продольной и поперечной плоскостях. При фотот?...

Обсуждение

Традиционный RB-фототромботический инсульт, представленный в 1985 году, является привлекательной моделью фокальной ишемии головного мозга для простых хирургических процедур, низкой смертности и высокой воспроизводимости инфаркта головного мозга. ⁵ В этой модели фотодинами...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Sigma	T8877	infarct
4-0 Nylon monofilament suture	LOOK	766B	surgical supplies
5-0 silk suture	Harvard Apparatus	624143	surgical supplies
543nm laser beam	Melles Griot	25-LGP-193-249	photothrombosis
adult male mice	Charles River	C57BL/6	10~14 weeks old (22~30 g)
Anesthesia bar for mouse adaptor	machine shop, UVA		surgical setup
Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol)	Sigma	T48402	euthanasia
Dental drill	Dentamerica	Rotex 782	surgical setup
Digital microscope	Dino-Lite	AM2111	brain imaging
Dissecting microscope	Olympus	SZ40	surgical setup
Fine curved forceps (serrated)	FST	11370-31	surgical instrument
Fine curved forceps (smooth)	FST	11373-12	surgical instrument
goat anti-rabbit Alexa Fluro 488	Invitrogen	A11008	Immunohistochemistry
Halsted-Mosquito hemostats	FST	13008-12	surgical instrument
Heat pump with warming pad	Gaymar	TP700	surgical setup
infusion pump	KD Scientific	200	thrombolytic treatment
Insulin syringe with 31G needle	BD	328291	photothrombosis
Ketamine	CCM, UVA		anesthesia
Laser protective google 532nm	Thorlabs	LG3	photothrombosis
Ketoprofen	CCM, UVA		NSAID analgesia
micro needle holders	FST	12060-01	surgical instrument
micro scissors	FST	15000-03	surgical instrument
MoorFLPI-2 blood flow imager	Moor	780-nm laser source	Laser Speckle Contrast Imaging
Mouse adaptor	RWD	68014	surgical setup
Puralube Vet ointment	Fisher	NC0138063	eye dryness prevention
Retractor tips	Kent Scientific	Surgi-5014-2	surgical setup
Rose Bengal	Sigma	198250	photothrombosis
Thrombin	Sigma	T7513	photothrombosis
Tissue glue	Abbott Laboratories	NC9855218	surgical supplies
tPA	Genetech	Cathflo activase 2mg	thrombolytic treatment
Vibratome	Stoelting	51425	TTC infacrt
Xylazine	CCM, UVA		anesthesia