אין ויטרו הערכה של הגנה שריר הלב בעקבות היפותרמיה-תנאים מקדים במודל מיוציטים לב אנושי

Summary

ההשפעות המובהק של דרגות שונות של היפותרמיה על הגנה שריר הלב לא הוערכו ביסודיות. מטרת המחקר הנוכחי הייתה לכמת את רמות המוות התאי בעקבות טיפולי היפותרמיה שונים במודל מבוסס קרדיומיוציטים אנושיים, ולהניח את היסודות למחקר מולקולרי מעמיק בעתיד.

Abstract

איסכמיה/רפרופוזיה נגזר תפקוד שריר הלב הוא תרחיש קליני נפוץ בחולים לאחר ניתוח לב. בפרט, הרגישות של קרדיומיוציטים לפגיעה איסכמית גבוהה יותר מזו של אוכלוסיות תאים אחרות. כיום, היפותרמיה מעניקה הגנה ניכרת מפני עלבון איסכמי צפוי. עם זאת, חקירות של שינויים מולקולריים מורכבים הנגרמים על ידי היפותרמיה נשארות מוגבלות. לכן, חיוני לזהות מצב תרבותי דומה תנאי vivo שיכול לגרום נזק דומה לזה שנצפה במצב הקליני באופן לשחזור. כדי לחקות תנאים דמויי איסכמיה במבחנה, התאים במודלים אלה טופלו על ידי מחסור בחמצן / גלוקוז (OGD). בנוסף, יישמנו פרוטוקול טמפרטורת זמן סטנדרטי המשמש במהלך ניתוח לב. יתר על כן, אנו מציעים גישה להשתמש בשיטה פשוטה אך מקיפה לניתוח כמותי של פגיעה בשריר הלב. אפופטוזיס ורמות ביטוי של חלבונים הקשורים אפופטוזיס הוערכו על ידי cytometry זרימה באמצעות ערכת ELISA. במודל זה, בדקנו השערה לגבי ההשפעות של תנאי טמפרטורה שונים על אפופטוזיס קרדיומיוציטים במבחנה. האמינות של מודל זה תלויה בבקרת טמפרטורה קפדנית, הליכי ניסוי הניתנים לשליטה ותוצאות ניסיוניות יציבות. בנוסף, מודל זה יכול לשמש כדי ללמוד את המנגנון המולקולרי של cardioprotection היפותרמית, אשר עשויות להיות השלכות חשובות על התפתחות טיפולים משלימים לשימוש עם היפותרמיה.

Introduction

איסכמיה/reperfusion נגזר תפקוד שריר הלב הוא תרחיש קליני נפוץ בחולים לאחר ניתוח לב^1,2. במהלך זריעת זרימה נמוכה nonpulsatile ותקופות של מעצר במחזור הדם הכולל, נזק מעורבים כל סוגי תאי הלב עדיין מתרחשת. בפרט, הרגישות של קרדיומיוציטים לפגיעה איסכמית גבוהה יותר מזו של אוכלוסיות תאים אחרות. כיום, היפותרמיה טיפולית (TH) מעניקה הגנה משמעותית מפני עלבון איסכמי צפוי בחולים שעברו ניתוח לב^3,4. TH מוגדר כטמפרטורת גוף ליבה של 14-34 מעלות צלזיוס, אם כי אין קונצנזוס לגבי הגדרה של^קירורבמהלך ניתוח לב 5^,6,7. בשנת 2013, פאנל בינלאומי של מומחים הציע מערכת דיווח סטנדרטית כדי לסווג טווחי טמפרטורה שונים של מעצר היפותרמי מערכתי במחזור הדם⁸. בהתבסס על מחקרי אלקטרואנצפלוגרפיה ומטבוליזם של המוח, הם חילקו היפותרמיה לארבע רמות: היפותרמיה עמוקה (≤ 14 מעלות צלזיוס), היפותרמיה עמוקה (14.1-20 מעלות צלזיוס), היפותרמיה מתונה (20.1-28 מעלות צלזיוס) והיפותרמיה קלה (28.1-34 מעלות צלזיוס). הקונצנזוס המומחה סיפק סיווג ברור ואחיד, המאפשר למחקרים להיות דומים יותר ולספק תוצאות רלוונטיות יותר מבחינה קלינית. הגנה זו הניתנת על ידי TH מבוססת על יכולתה להפחית את הפעילות המטבולית של תאים, להגביל עוד יותר את קצב צריכת הפוספטים באנרגיה גבוהה^9,10. עם זאת, התפקיד של TH בהגנה שריר הלב הוא שנוי במחלוקת, עשוי להיות השפעות מרובות בהתאם למידת ההיפותרמיה.

שריר הלב I /R ידוע להיות מלווה apoptisis תא^{מוגברת 11}. דיווחים אחרונים הבחינו כי מוות קרדיומיוציטים מתוכנת עולה במהלך ניתוח לב פתוח, ועלול לחפוף עם נמק, ובכך להגדיל את מספר תאי שריר הלב המתים¹². לכן, הפחתת אפופטוזיס קרדיומיוציטים היא גישה טיפולית שימושית בפרקטיקה הקלינית. במודל קרדיומיוציטים פרוזדוריים לעכבר HL-1, היפותרמיה טיפולית הוצגה כדי להפחית את שחרור המיטוכונדריה של ציטוכרום c וגורם גרימת אפופטוזיס (AIF) במהלך רפרופוזיה¹³. עם זאת, ההשפעה של הטמפרטורה בוויסות אפופטוזיס שנוי במחלוקת ונראה תלוי במידת ההיפותרמיה. קופר ועמיתיו הבחינו כי בהשוואה לקבוצת ביקורת מעקף לב-ריאה נורמותרמית, שיעור האפופטוזיס של רקמת שריר הלב מחזירים עם מעצר מחזור הדם ההיפותרמי העמוק הוגדל¹⁴. בנוסף, התוצאות של מספר מחקרים הראו כי היפותרמיה עמוקה עשויה להפעיל את מסלול האפופטוזיס, בעוד היפותרמיה פחות אגרסיבית מופיעה כדי לעכב את המסלול^12,15,16. הסיבה לתוצאה זו עשויה להיות בשל השפעות מבלבלות הקשורות לפציעה איסכמית וחוסר הבנה של המנגנונים שבאמצעותם הטמפרטורה משפיעה על רקמת שריר הלב. לכן, גבולות הטמפרטורה שבהם אפופטוזיס משופר או מוחלש צריך להיות מוגדר במדויק.

כדי להשיג הבנה טובה יותר של המנגנונים הקשורים ליעילות של היפותרמיה ולספק בסיס רציונלי ליישומה בבני אדם, חיוני לזהות מצב תרבותי דומה לתנאי vivo שיכולים לייצר נזק דומה לזה שנצפה למצב הקליני באופן לשחזור. צעד חיוני להשגת מטרה זו הוא לקבוע את התנאים האופטימליים לגרימת אפופטוזיס קרדיומיוציטים. בהתאם לכך, במחקר הנוכחי חקרנו את הפרטים המתודולוגיים לגבי ניסויים בחסך חמצן-גלוקוז עם תאים מתורבתים, מודל במבחנה של איסכמיה-רפרופוזיה. יתר על כן, הערכנו את ההשפעה של זמנים היפוקסיים-איסכמיים שונים על אפופטוזיס קרדיומיוציטים, ואימתנו את ההשערה שלנו לגבי ההשפעה של תנאי טמפרטורה שונים על אפופטוזיס התא במבחנה.

Protocol

מידע על ריאגנטים ומכשירים מסחריים מפורט בטבלת החומרים.

קו התאים הקרדיומיוציטים האנושי AC16 נגזר מההיתוך של תאים ראשוניים מרקמת לב חדרית בוגרת עם פיברובלסטים אנושיים שעברו טרנספורמציה SV40¹⁷, שנרכשו מ- BLUEFBIO (שנגחאי, סין). קו התאים מפתח תכונות ביוכימיות ומורפולוגיות רבות האופייניות לקרדיומיוציטים. בנוסף, קו התא נמצא בשימוש נרחב כדי להעריך נזק שריר הלב ותפקוד שריר הלב במבחנה^18,19.

1. תרבות התאים

הערה: מדיום תרבות הבסיס מורכב בינוני של הנשר שונה של Dulbecco בסרום (DMEM), 10% סרום שור עוברי (FBS), 1% תוסף צמיחה מיוציטים לב, ו 1% פניצילין / סטרפטומיצין פתרון. יש לאחסן את המדיום ב-4°C וקדם-מלחמה עד 37°C לפני השימוש.

1. הסר את תאי הקרדיומיוציטים האנושיים ההקפאה (HCM) מחנקן נוזלי והפשיר אותם באמבט מים ב-37 מעלות צלזיוס.
2. בעדינות לנער את הבקבוקון (<1 דקה) באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עד רק חתיכת קרח קטנה נשאר בקבוקון.
3. מעבירים את הבקבוקון למכסה המנוע הסטרילי של הזרימה הלמינארית. לנגב את החלק החיצוני של הבקבוקון עם כדור צמר גפן טבול 70% אלכוהול.
4. העבר 4 מ"ל של מדיום צמיחה מלאה מראש dropwise לתוך צינור צנטריפוגה המכיל את התאים מופשרים.
5. צנטריפוגה השעיית התא ב 200 × g במשך 10 דקות. לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant ו resuspend גלולה ב 5 מ"ל של מדיום שלם.
6. לשמור על התאים ב 37 °C (69 °F) באינקובטור לח תחת אטמוספרה עם 95% אוויר ו 5% CO₂.
   הערה: לפני קצירת התאים לניסויים, התאים רשאים לגדול עד להגיע לערך 60-70% מפגש.

2. הקמת מודל מניעת גלוקוז בחמצן (OGD)

הערה: שעתיים לפני תקופת המחקר, להחליף את מדיום הצמיחה עם מדיום ללא סרום, ואת התאים היו reincubated באינקובטור לח במשך 2 שעות ב 37 °C (69 °F) תחת אטמוספרה עם 5% CO₂.

1. שאפו את המדיום מצלחת של 6 בארות ושטפו בעדינות את התאים שלוש פעמים עם מלוחים עם אגירת פוספט (PBS).
2. הוסיפו 2 מ"ל של DMEM טרי ללא סוכר לבאר.
3. תרבות התאים בטמפרטורה קבועה באינקובטור שלושה גזים תחת אטמוספרה עם תערובת של 95% N₂, 5% CO₂, ו 0.1% O₂ ב 37 °C (60 °F) עבור 1, 2, 4, 8, 12, או 16 שעות.
4. לאחר הטיפול היפוקסיה, לשאוף את המדיום מצלחת 6-well ולשטוף את התאים עם PBS (pH 7.4) שלוש פעמים.
5. הוסף 2 מ"ל של DMEM מלא לבאר.
6. לשמור על התאים ב 37 °C (69 °F) באינקובטור לח תחת אטמוספרה עם 95% אוויר ו 5% CO₂.

3. פרוטוקול טמפרטורת זמן

הערה: פרוטוקול טמפרטורת זמן סטנדרטי משמש במהלך ניתוח לב, כפי שתואר בעבר על ידי אחרים^20,21. טיפול ב- HCMs בהתאם לפרוטוקול הבא (איור 1): נקודת זמן 1 (T1) מציינת את סוף האינדוקציה, נקודת זמן 2 (T2) מציינת את סוף התחזוקה ונקודת זמן 3 (T3) מציינת את סוף החינום מחדש. לנתח תאי בקרה המתוחזקים בתנאים נורמותרמיים רציפים (37 °C (67 °F). תנאי הטמפרטורה נוצרים באמצעות חממה תלת-גזית, המאפשרת ויסות טמפרטורה מדויק.

1. שעתיים לפני הניסויים, שאפו את מדיום התרבות מצלחת של 6 בארות והוסיפו 2 מ"ל של DMEM טרי ללא סרום לבאר.
2. דגירה מחדש של התאים באינקובטור לח במשך 2 שעות ב 37 °C (69 °F) תחת אטמוספרה עם 5% CO₂.
3. לאחר 2 שעות, לשאוף את המדיום מצלחת 6-well ולשטוף את התאים עם PBS (pH 7.4) שלוש פעמים.
4. הוסיפו 2 מ"ל של DMEM טרי ללא סרום לבאר.
5. צנרור מחדש את התאים באינקובטור התלת-גז.
   הערה: החלף את המדיום כדי להסיר תאים ופסולת לא מחוברים.
6. מיד לשנות את הטמפרטורה על ידי הצבת מנות התרבות חממה שלושה גז.
7. לאחר שעה של קירור, שאפו במהירות את המדיום מצלחת ה-6 בארות והוסיפו 2 מ"ל של DMEM טרי ללא סוכר לבאר.
8. תרבות התאים באינקובטור תלת-גז תחת אטמוספרה הכוללת 95% N₂, 5% CO₂, ו 0.1% O₂ ב 37 °C (70 °F) עבור 12 שעות להקים היפוקסיה.
9. הגדר את הטמפרטורה כמתואר להלן.
   הערה: הפרוטוקול מתחיל עם 10 שעות של טיפול בטמפרטורה נמוכה, ואחריו שלב חנוכה מחדש עבור 2 שעות עד 37 מעלות צלזיוס, ו 24 שעות של נורמותרמיה (37 °C (37 °F). בכל נקודת זמן, שלוש מנות פטרי מוסרות לניתוח.
10. לאחר טיפול בטמפרטורה נמוכה, לשאוף את המדיום מצלחת 6-well ולשטוף עם PBS (pH 7.4) שלוש פעמים.
11. הוסף 2 מ"ל של DMEM מלא לבאר.
12. לשמור על התאים ב 37 °C (69 °F) באינקובטור לח תחת אטמוספרה עם 95% אוויר ו 5% CO₂.

4. CCK-8 מבחני הכדאיות

1. לחמם את 0.25% טריפסין-אתילנדיאמינטי חומצה טראצטית (EDTA) פתרון PBS כדי 37 °C (70 °F) לפני השימוש.
2. לשאוף את המדיום, לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS ולאחר מכן להוסיף 0.5 מ"ל של 0.25% טריפסין לאורך הקיר של הבאר. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עד כמעט כל HCMs מנותקים (כ 1 דקות).
3. הוסף 1 מ"ל של מדיום שלם DMEM לבארות כדי לנטרל את טריפסין.
4. להעביר את ההשעיה התא צינור צנטריפוגה 15 מ"ל גלולה HCMs על ידי צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 3 דקות. לשאוף את supernatant מבלי להפריע גלולה.
5. לוותר על 100 μL aliquots של השעיית התא (5000 תאים / טוב) לתוך צלחת 96-well. קדם-צנרור של הצלחת למשך 24 שעות באינקובטור לח (ב-37 מעלות צלזיוס).
6. השתמש בתאים התרבותיים בצלחות 96-באר כדי ליצור קבוצות טיפול שונות.
7. הדגירה את הצלחת לאורך זמן מתאים (16 שעות) באינקובטור.
8. הוסף 10 μL של פתרון CCK-8 לכל באר של הצלחת.
9. דגירה את הצלחת במשך שעה באינקובטור.
10. למדוד את הספיגה ב 450 ננומטר באמצעות קורא microplate.
    התראה: היזהר לא להציג בועות לבארות, כפי שהם מפריעים מדידות קריאת OD.

5. ציטומטריית זרימה לניתוח אפופטוזיס

1. בצע את שלבי הנסיון והצנטריפוגה על-ידי ביצוע שלבים 4.2-4.4.
   הערה: תאים נקצרים עם טריפסין ללא EDTA. כדי להעריך אפופטוזיס, תאים צפים ודבקים נאספים.
2. צנטריפוגה התאים במשך 5 דקות ב 1000 × גרם. השלך את supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ"ל של PBS.
3. לספור את התאים באמצעות המוציטרומטר. באמצעות פיפטה, להעביר 100 μL של השעיית תאים שטופלו כחול Trypan להמוציטרומטר. באמצעות מונה ספירת ידיים, לספור את התאים חיים, מוכתמים בערכה אחת של 16 ריבועים ולאחר מכן להשתמש PBS כדי ליצור השעיית תא ב 1×10⁷ תאים / מיליליטר.
4. להשיג 200 μL של השעיית התא (5 × 10⁵ -1 × 10⁶ תאים).
5. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 1000 × גרם ו resuspend גלולה בנספח V-FITC פתרון מחייב.
6. הוסף 5 μL של נספח V-FITC לצבוע את התאים.
7. הוסף 10 μL של פרופידיום יודיד לתוך ההשעיה התא.
8. מערבבים בעדינות את התאים ומדגירה אותם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
   הערה: התאים מנוצלים מחדש 2-3 פעמים במהלך הדגירה כדי לשפר את הכתם.
9. הפעל את ציטומטר הזרימה וודא שהתוכנה פועלת כראוי.
10. פתח שני חלונות התוויית נקודות בתוכנת ציטומטריית הזרימה.
11. בחר אור מפוזר קדימה (FSC) על ציר X ואור מפוזר בצד (SSC) על ציר Y כדי לא לכלול פסולת תא ו / או גושים במונחים של גודלם וצפיפותם, בהתאמה.
12. בחר את ערוץ הזיהוי PE (590 מ"מ) ואת FITC (530 מ"מ), המשמש למדידת עוצמת הפלואורסצנטיות של התאים.
13. מקם את הצינור לדוגמה ריק (HCMs שלא נצבעו) על ציטומטר הזרימה.
14. לחץ על רשומה כדי לאסוף חלקיקים מן ההשעיה בצינור מדגם ריק ולאחר מכן שער אוכלוסיית התא לניתוח נוסף בחלקת הנקודה הראשונה.
15. מניחים את הדגימות המוכתמות על זרוע התמיכה בצינור. לחץ על רשומה כדי לאסוף חלקיקים מההשעיה ולאחר מכן שער אוכלוסיית התא לניתוח נוסף בחלקת הנקודה הראשונה.
16. לאסוף את HCMs בצינורות מדגם אחרים לייעל את המדידה על ידי התאמת המתחים של ערוצי פלואורסצנטיות.
    הערה: דגימות לא מוכתמות ומוכתמות בודדות משמשות כפקדי פיצוי במהלך הניסוי.
17. הצג את הסטטיסטיקה של כל צינור מדגם וחשב את קצב האפופטוזיס של כל דגימה.

6. הערכת דה-פולריזציה מיטוכונדרית

1. בצע טריפסיניזציה וצנטריפוגה על-ידי ביצוע שלבים 4.2-4.4.
2. resuspend התאים ב 500 μL של מדיום מלא, ולאחר מכן להתאים את צפיפות התא מותאם 1 × 10⁵ - 6 × 10⁶ תאים
3. הוסף 0.5 מ"ל של פתרון עבודה JC-1 לכל צינור.
4. דגירה התאים באינקובטור התא ב 37 °C (69 °F) במשך 20 דקות.
   הערה: במהלך תקופת הדגירה, להוסיף 1 מ"ל של 5× JC-1 חיץ כתמים ל 4 מ"ל של מים מזוקקים כדי להכין את חיץ הכתמים JC-1.
5. לאחר הדגירה, צנטריפוגה התאים ב 600 × גרם במשך 3 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
6. השלך את supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ"ל של JC-1 חיץ כתמים.
7. חזור על שלבים 6.5 עד 6.6 שלוש פעמים.
8. לשים מחדש את HCMs ב 1 מ"ל של חיץ כתמים קר כקרח בצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל ולהשתמש בתאים לניתוח בתוך 30 דקות.
9. בחר בערוץ הזיהוי PE (590 ננומטר) וב- FITC (530 ננומטר) כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות של צבע JC-1 בתאים.
   הערה: הגדר את סיטומטר הזרימה על-ידי ביצוע שלבים 5.10-5.17.

7. מבחני חמצן תגובתי

1. בצע טריפסיניזציה וצנטריפוגה על-ידי ביצוע שלבים 4.2-4.4.
2. הכתים את התאים במדיום תרבות עם 10 מיקרומטר DCFDA ולהתאים את צפיפות התא ל 1 × 10⁶ - 1 × 10⁷ תאים
3. דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
4. בעדינות פיפטה התאים למעלה / למטה כל 3-5 דקות.
5. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם מדיום תרבות התא ללא סרום.
6. לנתח את התאים על cytometer זרימה על ידי ביצוע שלבים 5.10-5.17.
   הערה: DCF מתרגש ב-488 ננומטר ועוצמת הפליטה נמדדת ב-530 ננומטר.

8. מדידה של Caspase 3 / Caspase 8 פעילות

1. בצע נסיון על-ידי ביצוע שלבים 4.2-4.4.
2. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 600 × גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
3. הוסף 100 μL של מאגר ליזלת לכל 2 × 10⁶ תאים.
4. ליס התאים במשך 15 דקות על קרח.
5. לאחר הדגירה במשך 15 דקות באמבט קרח, צנטריפוגה המדגם ב 1.6 × 10 4 x^גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
6. מעבירים את הסופרנט לצינור צנטריפוגות קר כקרח לשימוש.
   הערה: ריכוז החלבון במדגם צריך להיות לפחות 1-3 מ"ג / מ"ל.
7. הסר Ac-DEVD-pNA (2 mM) ומניחים אותו על אמבט קרח לשימוש.
8. להוסיף במדויק 40 μL של פתרון חיץ לצלחת שכותרתו אנזים, להוסיף 80 μL של המדגם, ולבסוף להוסיף 10 μL של Ac-DEVD-pNA (2 מ"מ).
9. דגירה את המדגם ב 37 °C (69 °F) במשך 120 דקות.
10. מדד את ערך A405 בקורא מיקרופלאט בהתאם להוראות היצרן.
    הערה: הספיגה המיוצרת על-ידי pNA שנוצר על-ידי caspase-3/caspase-8 מחושבת על-ידי חיסור ערך A405 של הפקד הריק מזה של המדגם.

תוצאות

ההשפעה של חשיפה OGD על הכדאיות של HCMs נקבע על ידי CCK-8 assay. בהשוואה לזה שנצפה בקבוצת הביקורת, הכדאיות של התאים פחתה באופן משמעותי באופן תלוי זמן (איור 2A). שיעורי האפופטוזיס של HCMs בזמנים שונים לאחר ההיתוך הראו מגמה ספציפית, שבה מ-0 ל-16 שעות, שיעורי האפופטוזיס עלו בהדרגה והגיעו לקצב ?...

Discussion

המורכבות של בעלי חיים שלמים, כולל האינטראקציות בין סוגים שונים של תאים, מונעת לעתים קרובות מחקרים מפורטים של רכיבים ספציפיים של פגיעה ב- I/R. לכן, יש צורך להקים מודל תא במבחנה שיכול לשקף במדויק את השינויים המולקולריים לאחר איסכמיה ב vivo. מחקר על מודלים OGD דווח בעבר^13,

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit	Bio-Technology,China	C1062M
Cardiac myocyte growth supplement	Sciencell,USA	6252
Caspase 3 activity assay kit	Bio-Technology,China	C1115
Caspase 8 activity assay kit	Bio-Technology,China	C1151
DMEM, no glucose	Gibco,USA	11966025
Dulbecco's modified eagle medium	Gibco,USA	11960044
Fetal bovine serum	Gibco,USA	16140071
Flow cytometry	CytoFLEX,USA	B49007AF
Human myocardial cells	BLUEFBIO,China	BFN60808678
Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1	Bio-Technology,China	C2006
Penicillin/Streptomycin solution	Gibco,USA	10378016
Reactive oxygen species assay kit	Bio-Technology,China	S0033S
Three-gas incubator	Memmert,Germany	ICO50
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco,USA	25200056