Valutazione in vitro della protezione del miocardio a seguito dell'ipotermia-precondizione in un modello di miociti cardiaci umani

Riepilogo

Gli effetti distinti dei diversi gradi di ipotermia sulla protezione del miocardio non sono stati valutati a fondo. L'obiettivo del presente studio era quantificare i livelli di morte cellulare a seguito di diversi trattamenti di ipotermia in un modello umano a base di cardiomiociti, gettando le basi per una futura ricerca molecolare approfondita.

Abstract

La disfunzione miocardica derivata da ischemia/riperfusione è uno scenario clinico comune nei pazienti dopo la cardiochirurga. In particolare, la sensibilità dei cardiomiociti alle lesioni ischemiche è superiore a quella di altre popolazioni cellulari. Attualmente, l'ipotermia offre una notevole protezione contro un atteso insulto ischemico. Tuttavia, le indagini sui complessi cambiamenti molecolari indotti dall'ipotermia rimangono limitate. Pertanto, è essenziale identificare una condizione di coltura simile a condizioni in vivo che possono indurre danni simili a quello osservato nella condizione clinica in modo riproducibile. Per imitare le condizioni simili all'ischemia in vitro, le cellule in questi modelli sono state trattate con privazione di ossigeno / glucosio (OGD). Inoltre, abbiamo applicato un protocollo standard di temperatura del tempo utilizzato durante la cardiochirururga. Inoltre, proponiamo un approccio per utilizzare un metodo semplice ma completo per l'analisi quantitativa delle lesioni del miocardio. L'apoptosi e i livelli di espressione delle proteine associate all'apoptosi sono stati valutati dalla citometria del flusso e utilizzando un kit ELISA. In questo modello, abbiamo testato un'ipotesi riguardante gli effetti delle diverse condizioni di temperatura sull'apoptosi cardiomiocita in vitro. L'affidabilità di questo modello dipende da un rigoroso controllo della temperatura, procedure sperimentali controllabili e risultati sperimentali stabili. Inoltre, questo modello può essere utilizzato per studiare il meccanismo molecolare della cardioprotezione ipotermica, che può avere importanti implicazioni per lo sviluppo di terapie complementari per l'uso con ipotermia.

Introduzione

La disfunzione miocardica derivata da ischemia/riperfusione è uno scenario clinico comune nei pazienti dopo la cardiochirurga^1,2. Durante la perfusione non obbligatoria a basso flusso e i periodi di arresto circolatorio totale, si verificano ancora danni che coinvolgono tutti i tipi di cellule cardiache. In particolare, la sensibilità dei cardiomiociti alle lesioni ischemiche è superiore a quella di altre popolazioni cellulari. Attualmente, l'ipotermia terapeutica (TH) offre una protezione sostanziale contro un insulto ischemico previsto nei pazienti sottoposti a cardiochirurga^3,4. Il TH è definito come una temperatura corporea interna di 14-34 °C, sebbene non esista consenso su una definizione di raffreddamento durante la cardiochirur^5,6,7. Nel 2013, un gruppo internazionale di esperti ha proposto un sistema di segnalazione standardizzato per classificare vari intervalli di temperatura dell'arresto circolatorio ipotermico^{sistemico 8}. Sulla base di studi di elettroencefalografia e metabolismo del cervello, hanno diviso l'ipotermia in quattro livelli: ipotermia profonda (≤ 14 °C), ipotermia profonda (14,1-20 °C), ipotermia moderata (20,1-28 °C) e ipotermia lieve (28,1-34 °C). Il consenso degli esperti ha fornito una classificazione chiara e uniforme, consentendo agli studi di essere più comparabili e fornire risultati più clinicamente rilevanti. Questa protezione offerta dalla TH si basa sulla sua capacità di ridurre l'attività metabolica delle cellule, limitando ulteriormente il loro tasso di consumo di fosfati ad alta^{energia 9,10}. Tuttavia, il ruolo della TH nella protezione del miocardio è controverso e può avere effetti multipli a seconda del grado di ipotermia.

L'I/R miocardico è noto per essere accompagnato da un aumento dell'apoptisi^{cellulare 11}. Recenti rapporti hanno osservato che la morte cardiomiocitaria programmata aumenta durante l'intervento a cuore aperto e può coincidere con la necrosi, aumentando così il numero di cellule miocardiche morte¹². Pertanto, ridurre l'apoptosi cardiomiocita è un utile approccio terapeutico nella pratica clinica. Nel modello cardiomiocitario atriale del topo HL-1, è stata dimostrata che l'ipotermia terapeutica riduce il rilascio mitocondriale del citocromo c e del fattore che induce l'apoptosi (AIF) durante la riperfusione¹³. Tuttavia, l'effetto della temperatura nella regolazione dell'apoptosi è controverso e sembra dipendere dal grado di ipotermia. Cooper e colleghi hanno osservato che rispetto a un gruppo di controllo del bypass cardiopolmonare normotermico, il tasso di apoptosi del tessuto miocardico dei suini con l'arresto circolatorio ipotermico profondo è stato^{aumentato di 14}. Inoltre, i risultati di alcuni studi hanno suggerito che l'ipotermia profonda può attivare la via dell'apoptosi, mentre l'ipotermia meno aggressiva sembra^{inibire la via 12,15,16}. La ragione di questo risultato può essere dovuta a effetti confondenti associati a lesioni ischemiche e alla mancanza di comprensione dei meccanismi con cui la temperatura influisce sul tessuto miocardico. Pertanto, i limiti di temperatura ai quali l'apoptosi è migliorata o attenuata devono essere definiti con precisione.

Per ottenere una migliore comprensione dei meccanismi associati all'efficacia dell'ipotermia e fornire una base razionale per la sua implementazione nell'uomo, è essenziale identificare una condizione di coltura simile a condizioni in vivo che possono produrre danni simili a quello osservato per la condizione clinica in modo riproducibile. Un passo essenziale verso il raggiungimento di questo obiettivo è stabilire le condizioni ottimali per indurre l'apoptosi cardiomiocitaria. Di conseguenza, nel presente studio, abbiamo esplorato i dettagli metodologici riguardanti gli esperimenti di privazione ossigeno-glucosio con cellule coltivate, un facile modello in vitro di ischemia-riperfusione. Inoltre, abbiamo valutato l'effetto di diversi tempi ipossico-ischemici sull'apoptosi cardiomiocitaria e verificato la nostra ipotesi riguardante l'effetto delle diverse condizioni di temperatura sull'apoptosi cellulare in vitro.

Protocollo

Le informazioni relative ai reagenti e agli strumenti commerciali sono elencate nella tabella dei materiali.

La linea cellulare cardiomiocitaria umana AC16 è stata derivata dalla fusione di cellule primarie dal tessuto cardiaco ventricolare adulto con fibroblasti umani trasformati in SV40¹⁷, che sono stati acquistati da BLUEFBIO (Shanghai, Cina). La linea cellulare sviluppa molte caratteristiche biochimiche e morfologiche caratteristiche dei cardiomiociti. Inoltre, la linea cellulare è ampiamente utilizzata per valutare i danni del miocardio e la funzione miocardica in vitro^18,19.

1. Coltura cellulare

NOTA: Il mezzo di coltura basale è costituito dal mezzo di coltura dell'aquila modificato (DMEM) modificato di Dulbecco senza siero, dal 10% dal siero bovino fetale (FBS), dall'1% da integratore per la crescita di miociti cardiaci e dall'1% da penicillina/streptomicina. Conservare il mezzo a 4 °C e prevenirsi a 37 °C prima dell'uso.

1. Rimuovere le cellule cardiomiocitari umane crioconservate (HCM) dall'azoto liquido e scongelarle in un bagno d'acqua a 37 °C.
2. Agitare delicatamente il flaconcino (<1 minuto) in un bagno d'acqua a 37 °C fino a quando nella fiala rimane solo un piccolo pezzo di ghiaccio.
3. Trasferire il flaconcino in una cappa sterile a flusso laminare. Pulire l'esterno della fiala con un batuffolo di cotone immerso nel 70% di alcol.
4. Trasferire 4 ml di crescita completa prebellica in senso medio dropwise nel tubo di centrifuga contenente le celle scongelate.
5. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 × g per 10 minuti. Dopo la centrifugazione, scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 5 mL di mezzo completo.
6. Mantenere le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato sotto un'atmosfera con il 95% di aria e il 5% di CO₂.
   NOTA: Prima di raccogliere le cellule per esperimenti, le cellule possono crescere fino a raggiungere circa il 60-70% di confluenza.

2. Definizione di un modello di deprivazione ossigeno-glucosio (OGD)

NOTA: Due ore prima del periodo di studio, sostituire il mezzo di crescita con un mezzo privo di siero e le cellule sono state reincubate in un incubatore umidificato per 2 ore a 37 °C sotto un'atmosfera con il 5% di CO₂.

1. Aspirare il mezzo da una piastra a 6 pozzi e lavare delicatamente le cellule tre volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
2. Aggiungere 2 mL di DMEM fresco senza zucchero per pozzo.
3. Coltura delle cellule a temperatura costante in un incubatore di tre gas in un'atmosfera con una miscela di 95% N₂, 5% CO₂e 0,1% O₂ a 37 °C per 1, 2, 4, 8, 12 o 16 ore.
4. Dopo il trattamento con ipossia, aspirare il mezzo dalla piastra a 6 pozzi e lavare le cellule con PBS (pH 7.4) tre volte.
5. Aggiungere 2 mL di DMEM completo per pozzo.
6. Mantenere le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato sotto un'atmosfera con il 95% di aria e il 5% di CO₂.

3. Protocollo di temperatura del tempo

NOTA: Durante la cardiochirururga viene utilizzato un protocollo standard di temperatura-tempo, come descritto in^{precedenza da altri 20,21}. Trattare gli HMM secondo il seguente protocollo (Figura 1): il punto di tempo 1 (T1) indica la fine dell'induzione, il punto di tempo 2 (T2) indica la fine della manutenzione e il punto di tempo 3 (T3) indica la fine del riscaldamento. Analizzare le celle di controllo mantenute in condizioni normotermiche continue (37 °C). Le condizioni di temperatura vengono create utilizzando un incubatore di tri-gas, che consente una regolazione precisa della temperatura.

1. Due ore prima degli esperimenti, aspirare il mezzo di coltura da una piastra da 6 porri e aggiungere 2 mL di DMEM fresco senza siero per pozzo.
2. Ridi incubare le cellule in un incubatore umidificato per 2 ore a 37 °C in un'atmosfera con 5% di CO₂.
3. Dopo 2 ore, aspirare il mezzo dalla piastra a 6 pozzi e lavare le celle con PBS (pH 7.4) tre volte.
4. Aggiungere 2 mL di DMEM fresco senza siero per pozzo.
5. Reincubare le cellule nell'incubatore di tri-gas.
   NOTA: Sostituire il mezzo per rimuovere celle e detriti non attaccati.
6. Cambiare immediatamente la temperatura posizionando i piatti di coltura un incubatore di tri-gas.
7. Dopo 1 h di raffreddamento, aspirare rapidamente il mezzo dalla piastra a 6 porri e aggiungere 2 mL di DMEM fresco senza zucchero per pozzo.
8. Coltura delle cellule in un incubatore di tri-gas in un'atmosfera composta per il 95% da N_2,per il 5% da CO₂e per lo 0,1% O₂ a 37 °C per 12 ore per stabilire l'ipossia.
9. Impostare la temperatura come descritto di seguito.
   NOTA: Il protocollo inizia con 10 ore di un trattamento a bassa temperatura, seguito da una fase di riscaldamento per 2 h fino a 37 °C e 24 ore di normotermia (37 °C). In ogni momento, tre piastre di Petri vengono rimosse per l'analisi.
10. Dopo un trattamento a bassa temperatura, aspirare il mezzo dalla piastra a 6 pozzi e lavare con PBS (pH 7.4) tre volte.
11. Aggiungere 2 mL di DMEM completo per pozzo.
12. Mantenere le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato sotto un'atmosfera con il 95% di aria e il 5% di CO₂.

4. Saggio di fattibilità CCK-8

1. Riscaldare la soluzione di acido tritaside-etilendiamminatetraacetico (EDTA) allo 0,25% e pbs a 37 °C prima dell'uso.
2. Aspirare il mezzo, sciacquare le cellule con 1 mL di PBS e quindi aggiungere 0,5 mL di 0,25% di tripside lungo la parete del pozzo. Incubare a 37 °C fino a quando quasi tutti gli HMM non sono staccati (circa 1 min).
3. Aggiungere 1 mL di supporto completo DMEM ai pozzi per neutralizzare la tripina.
4. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo di centrifuga da 15 ml e pelletare gli HMM mediante centrifugazione a 500 × g per 3 min. Aspirare il supernatante senza disturbare il pellet.
5. Distribuire aliquote di 100 μL della sospensione cellulare (5000 celle/pozzo) in una piastra da 96 po' . Preincubare la piastra per 24 ore in un incubatore umidificato (a 37 °C.)
6. Utilizzare le cellule coltivate nelle piastre a 96 pozzi per generare diversi gruppi di trattamento.
7. Incubare la piastra per un periodo di tempo appropriato (16 ore) in un'incubatrice.
8. Aggiungere 10 μL di soluzione CCK-8 ad ogni pozza della piastra.
9. Incubare il piatto per 1 ora nell'incubatrice.
10. Misurare l'assorbanza a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastra.
    ATTENZIONE: Fare attenzione a non introdurre bolle nei pozzi, in quanto interferiscono con le misurazioni di lettura OD.

5. Citometria del flusso per l'analisi dell'apoptosi

1. Eseguire i passaggi di tripsinizzazione e centrifugazione seguendo i passaggi 4.2-4.4.
   NOTA: Le cellule vengono raccolte con tripina senza EDTA. Per valutare l'apoptosi, vengono raccolte sia le cellule galleggianti che le cellule aderenti.
2. Centrifugare le cellule per 5 minuti a 1000 × g. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 1 mL di PBS.
3. Contare le cellule usando un emocitometro. Utilizzando una pipetta, trasferire 100 μL di sospensione cellulare trattata con Tripano Blue in un emocitometro. Utilizzando un contatore di conteggio delle mani, contare le celle vive e non contaminate in un set di 16 quadrati e quindi utilizzare PBS per generare una sospensione cellulare a 1×10⁷ celle/ml.
4. Ottenere 200 μL della sospensione cellulare (5 × 10⁵ -1 × 10⁶ cellule).
5. Centrifugare per 5 min a 1000 × g e rimorsi il pellet nella soluzione legatura V-FITC annexin.
6. Aggiungere 5 μL di annexin V-FITC per tingere le cellule.
7. Aggiungere 10 μL di ioduro di propidio nella sospensione cellulare.
8. Mescolare delicatamente le cellule e incubarle per 20 minuti a temperatura ambiente al buio.
   NOTA: Le cellule vengono rimorsipendate 2-3 volte durante l'incubazione per migliorare la colorazione.
9. Avviare il citometro di flusso e assicurarsi che il software funzioni in modo appropriato.
10. Aprire due finestre di plottaggio a punti nel software di citometria a flusso.
11. Selezionare la luce diffusa in avanti (FSC) sull'asse X e la luce diffusa laterale (SSC) sull'asse Y per escludere detriti cellulari e/o grumi in termini di dimensioni e granularità, rispettivamente.
12. Selezionare il canale di rilevamento PE (590 mm) e FITC (530 mm), utilizzato per misurare l'intensità di fluorescenza delle cellule.
13. Posizionare il tubo campione vuoto (HHCM che non sono stati tinti) sul citometro di flusso.
14. Fate clic su Registra (Record) per raccogliere particelle dalla sospensione nel tubo campione vuoto, quindi selezionate la popolazione cellulare per ulteriori analisi nel primo grafico a punti.
15. Posizionare i campioni macchiati singoli sul braccio di supporto del tubo. Fate clic su Registra (Record) per raccogliere particelle dalla sospensione, quindi gate della popolazione cellulare per ulteriori analisi nel primo grafico a punti.
16. Raccogliere gli HMM in altri tubi campione e ottimizzare la misurazione regolando le tensioni dei canali di fluorescenza.
    NOTA: i campioni non macchiati e macchiati singoli vengono utilizzati come controlli di compensazione durante l'esperimento.
17. Visualizzare le statistiche di ciascun tubo campione e calcolare il tasso di apoptosi di ciascun campione.

6. Valutazione della depolarizzazione mitocondriale

1. Eseguire la tripsinizzazione e la centrifugazione seguendo i passaggi 4.2-4.4.
2. Rimosoppo le cellule in 500 μL di mezzo completo, quindi regolare la densità cellulare regolata a 1 × 10⁵ - 6 × 10⁶ cellule
3. Aggiungere 0,5 ml di soluzione di lavoro JC-1 a ciascun tubo.
4. Incubare le cellule in un'incubatrice cellulare a 37 °C per 20 minuti.
   NOTA: Durante il periodo di incubazione, aggiungere 1 mL di tampone di colorazione JC-1 da 5× a 4 mL di acqua distillata per preparare il tampone di colorazione JC-1.
5. Dopo l'incubazione, centrifugare le cellule a 600 × g per 3 minuti a 4 °C.
6. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 1 mL di tampone di colorazione JC-1.
7. Ripetere i passaggi da 6,5 a 6,6 tre volte.
8. Resuspend gli HCM in 1 ml di tampone di colorazione ghiacciato in un tubo di centrifuga da 1,5 ml e utilizzare le celle per l'analisi entro 30 minuti.
9. Selezionare il canale di rilevamento PE (590 nm) e FITC (530 nm) per misurare l'intensità di fluorescenza del colorante JC-1 nelle cellule.
   NOTA: Impostare il citometro di flusso seguendo i passaggi 5.10-5.17.

7. Saggio reattivo delle specie di ossigeno

1. Eseguire la tripsinizzazione e la centrifugazione seguendo i passaggi 4.2-4.4.
2. Modificare le cellule nel mezzo di coltura con 10 μM DCFDA e regolare la densità cellulare a 1 × 10⁶ - 1 × 10⁷ cellule
3. Incubare per 30 minuti a 37 °C.
4. Pipettare delicatamente le celle su / giù ogni 3-5 minuti.
5. Dopo l'incubazione, lavare le cellule tre volte con un mezzo di coltura cellulare privo di siero.
6. Analizzare le cellule su un citometro di flusso seguendo i passaggi 5.10-5.17.
   NOTA: DCF è eccitato a 488 nm e l'intensità di emissione misurata a 530 nm.

8. Misurazione dell'attività della Caspasi 3/ Caspasi 8

1. Eseguire la tripsinizzazione seguendo i passaggi 4.2-4.4.
2. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 600 × g a 4 °C per 5 minuti.
3. Aggiungere 100 μL di tampone di glisato per 2 × 10⁶ cellule.
4. Lyse le cellule per 15 minuti sul ghiaccio.
5. Dopo aver incubato per 15 minuti in un bagno di ghiaccio, centrifugare il campione a 1,6 × 10⁴ x g a 4 °C per 15 minuti.
6. Trasferire il supernatante in un tubo di centrifuga ghiacciato per l'uso.
   NOTA: La concentrazione proteica nel campione deve essere di almeno 1-3 mg/mL.
7. Rimuovere Ac-DEVD-pNA (2 mM) e posizionarlo su un bagno di ghiaccio per l'uso.
8. Aggiungere con precisione 40 μL di soluzione tampone alla piastra etichettata enzimatica, aggiungere 80 μL del campione e infine aggiungere 10 μL di Ac-DEVD-pNA (2 mM).
9. Incubare il campione a 37 °C per 120 minuti.
10. Misurato il valore A405 su un lettore di micropiatte secondo le istruzioni del produttore.
    NOTA: L'assorbanza prodotta dal pNA generato dalla caspasi-3/caspasi-8 viene calcolata sottraendo il valore A405 del controllo vuoto da quello del campione.

Risultati

L'effetto dell'esposizione all'OGD sulla vitalità degli HMM è stato determinato dal saggio CCK-8. Rispetto a quella osservata nel gruppo di controllo, la vitalità cellulare è stata significativamente diminuita in modo dipendente dal tempo (figura 2A). I tassi di apoptosi degli HMM in momenti diversi dopo la riperfusione hanno mostrato una tendenza specifica, dove da 0 a 16 ore, i tassi di apoptosi sono gradualmente aumentati e hanno raggiunto il tasso massimo al momento di 16 ore

Discussione

Le complessità degli animali intatti, comprese le interazioni tra diversi tipi di cellule, spesso impediscono studi dettagliati su componenti specifici della lesione da I/R. Pertanto, è necessario stabilire un modello cellulare in vitro in grado di riflettere accuratamente i cambiamenti molecolari dopo l'ischemia in vivo. La ricerca sui modelli OGD è stata^{precedentemente riportata 13,22}e molti metodi sofisticati sono stati stabiliti²³

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit	Bio-Technology,China	C1062M
Cardiac myocyte growth supplement	Sciencell,USA	6252
Caspase 3 activity assay kit	Bio-Technology,China	C1115
Caspase 8 activity assay kit	Bio-Technology,China	C1151
DMEM, no glucose	Gibco,USA	11966025
Dulbecco's modified eagle medium	Gibco,USA	11960044
Fetal bovine serum	Gibco,USA	16140071
Flow cytometry	CytoFLEX,USA	B49007AF
Human myocardial cells	BLUEFBIO,China	BFN60808678
Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1	Bio-Technology,China	C2006
Penicillin/Streptomycin solution	Gibco,USA	10378016
Reactive oxygen species assay kit	Bio-Technology,China	S0033S
Three-gas incubator	Memmert,Germany	ICO50
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco,USA	25200056