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Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Les effets distincts des différents degrés d’hypothermie sur la protection myocardique n’ont pas été soigneusement évalués. L’objectif de la présente étude était de quantifier les niveaux de mort cellulaire à la suite de différents traitements d’hypothermie dans un modèle humain à base de cardiomyocytes, jetant les bases d’une recherche moléculaire approfondie future.

Résumé

Le dysfonctionnement myocardique ischémie/reperfusion-dérivé est un scénario clinique commun dans les patients après chirurgie cardiaque. En particulier, la sensibilité des cardiomyocytes aux lésions ischémiques est plus élevée que celle des autres populations cellulaires. À l’heure actuelle, l’hypothermie offre une protection considérable contre une insulte ischémique attendue. Cependant, les investigations sur les changements moléculaires induits par l’hypothermie complexes restent limitées. Par conséquent, il est essentiel d’identifier une condition de culture semblable aux conditions in vivo qui peuvent induire des dommages semblables à ceux observés dans l’état clinique d’une manière reproductible. Pour imiter les conditions ischémiques in vitro, les cellules de ces modèles ont été traitées par privation d’oxygène/glucose (OGD). En outre, nous avons appliqué un protocole standard de température de temps utilisé pendant la chirurgie cardiaque. En outre, nous proposons une approche pour employer une méthode simple mais complète pour l’analyse quantitative des dommages myocardiaux. Les niveaux d’apoptose et d’expression des protéines associées à l’apoptose ont été évalués par cytométrie du débit et à l’aide d’un kit ELISA. Dans ce modèle, nous avons testé une hypothèse concernant les effets de différentes conditions de température sur l’apoptose cardiomyocyte in vitro. La fiabilité de ce modèle dépend d’un contrôle strict de la température, de procédures expérimentales contrôlables et de résultats expérimentaux stables. En outre, ce modèle peut être utilisé pour étudier le mécanisme moléculaire de la cardioprotection hypothermique, qui peut avoir des implications importantes pour le développement de thérapies complémentaires pour une utilisation avec hypothermie.

Introduction

Le dysfonctionnement myocardique ischémique/reperfusion-dérivé est un scénario clinique commun dans les patients après chirurgiecardiaque 1,2. Pendant la perfusion de faible débit nonpulsatile et les périodes d’arrestation circulatoire totale, des dommages impliquant tous les types de cellules cardiaques se produisent toujours. En particulier, la sensibilité des cardiomyocytes aux lésions ischémiques est plus élevée que celle des autres populations cellulaires. À l’heure actuelle, l’hypothermie thérapeutique (TH) offre une protection substantielle contre une insulte ischémique prévue chez les patientssubissant une chirurgie cardiaque 3,4. Th est défini comme une température corporelle centrale de 14-34 °C, bien qu’il n’existe aucun consensus concernant une définition du refroidissement pendant lachirurgie cardiaque 5,6,7. En 2013, un groupe international d’experts a proposé un système de déclaration normalisé pour classer diverses plages de température d’arrestation circulatoire hypothermique systémique8. Sur la base d’études d’électroencéphalographie et de métabolisme du cerveau, ils ont divisé l’hypothermie en quatre niveaux : hypothermie profonde (≤ 14 °C), hypothermie profonde (14,1-20 °C), hypothermie modérée (20,1-28 °C) et hypothermie légère (28,1-34 °C). Le consensus des experts a fourni une classification claire et uniforme, permettant aux études d’être plus comparables et d’obtenir des résultats plus pertinents sur le plan clinique. Cette protection offerte par TH est basée sur sa capacité à réduire l’activité métabolique des cellules, limitant encore leur taux de consommation de phosphates à haute énergie9,10. Cependant, le rôle du TH dans la protection myocardique est controversé et peut avoir des effets multiples selon le degré d’hypothermie.

Myocardial I/ R est bien connu pour être accompagné d’une augmentation de l’apoptisiscellulaire 11. Des rapports récents ont observé que la mort programmée de cardiomyocyte augmente pendant la chirurgie à coeur ouvert, et peut coïncider avec la nécrose, augmentant de ce fait le nombre de cellules myocardiquesmortes 12. Par conséquent, la réduction de l’apoptose cardiomyocyte est une approche thérapeutique utile dans la pratique clinique. Dans le modèle atrial de cardiomyocyte de HL-1 de souris, l’hypothermie thérapeutique s’est montrée pour réduire la libération mitochondrique du c cytochrome et du facteur apoptosis-induisant (AIF) pendant la reperfusion13. Cependant, l’effet de la température dans la régulation de l’apoptose est controversé et semble dépendre du degré d’hypothermie. Cooper et ses collègues ont observé que par rapport à un groupe de contrôle cardiopulmonaire normothermique de déviation, le taux d’apoptose du tissu myocardique des porcs avec l’arrêt circulatoire hypothermique profond aété augmenté 14. En outre, les résultats de certaines études ont suggéré que l’hypothermie profonde peut activer la voie de l’apoptose, tandis que l’hypothermie moins agressive semble inhiber lavoie 12,15,16. La raison de ce résultat peut être due à des effets confusionnels associés à des lésions ischémiques et un manque de compréhension des mécanismes par lesquels la température affecte le tissu myocardique. Par conséquent, les limites de température auxquelles l’apoptose est améliorée ou atténuée doivent être définies avec précision.

Pour mieux comprendre les mécanismes associés à l’efficacité de l’hypothermie et fournir une base rationnelle pour sa mise en œuvre chez l’homme, il est essentiel d’identifier une condition de culture similaire aux conditions in vivo qui peuvent produire des dommages similaires à ceux observés pour la condition clinique d’une manière reproductible. Une étape essentielle vers la réalisation de cet objectif est d’établir les conditions optimales pour induire l’apoptose cardiomyocyte. En conséquence, dans la présente étude, nous avons exploré les détails méthodologiques concernant les expériences de privation d’oxygène-glucose avec des cellules de culture, un modèle in vitro facile de l’ischémie-reperfusion. En outre, nous avons évalué l’effet de différents temps hypoxiques-ischémiques sur l’apoptose cardiomyocyte, et vérifié notre hypothèse concernant l’effet des différentes conditions de température sur l’apoptose cellulaire in vitro.

Protocole

Les renseignements concernant les réadageurs commerciaux et les instruments sont énumérés dans le Tableau des matériaux.

La lignée cellulaire de cardiomyocyte humain AC16 a été dérivée de la fusion des cellules primaires du tissu cardiaque ventriculaire adulte avec les fibroblastes humains SV40-transformés17,qui ont été achetés de BLUEFBIO (Changhaï, Chine). La lignée cellulaire développe de nombreuses caractéristiques biochimiques et morphologiques caractéristiques des cardiomyocytes. En outre, la lignée cellulaire est largement utilisée pour évaluer les dommages myocardiaux et la fonction myocardique in vitro18,19.

1. Culture cellulaire

NOTE : Le milieu basal de culture se compose du milieu modifié de l’aigle de Dulbecco (DMEM), du sérum bovin foetal de 10% (FBS), du supplément cardiaque de croissance de myocyte de 1%, et de la solution de 1% de pénicilline/streptomycine. Conserver le milieu à 4 °C et préchamer jusqu’à 37 °C avant utilisation.

  1. Retirer les cellules cryopréservées de cardiomyocyte humain (HCM) de l’azote liquide et les décongeler dans un bain d’eau à 37 °C.
  2. Secouez doucement le flacon (<1 minute) dans un bain d’eau de 37 °C jusqu’à ce qu’il ne reste qu’un petit morceau de glace dans le flacon.
  3. Transférer le flacon dans une hotte stérile d’écoulement laminaire. Essuyer l’extérieur du flacon avec une boule de coton trempée dans 70% d’alcool.
  4. Transférer 4 mL de milieu de croissance complet préchauré dans le tube de centrifugeuse contenant les cellules décongelées.
  5. Centrifuger la suspension cellulaire à 200 × g pendant 10 minutes. Après centrifugation, jeter le supernatant et réutiliser la pastille dans 5 mL de milieu complet.
  6. Maintenir les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié sous une atmosphère avec 95% d’air et 5% de CO2.
    REMARQUE : Avant de récolter les cellules pour des expériences, les cellules sont autorisées à se développer jusqu’à atteindre environ 60-70% de confluence.

2. Mise en place d’un modèle de privation d’oxygène-glucose (OGD)

REMARQUE : Deux heures avant la période d’étude, remplacer le milieu de croissance par un milieu sans sérum, et les cellules ont été réincubées dans un incubateur humidifié pendant 2 h à 37 °C dans une atmosphère avec 5 % de CO2.

  1. Aspirer le milieu à partir d’une plaque de 6 puits et laver délicatement les cellules trois fois avec du phosphate tamponné salin (PBS).
  2. Ajouter 2 mL de DMEM frais sans sucre par puits.
  3. Culture des cellules à température constante dans un incubateur à trois gaz sous une atmosphère avec un mélange de 95% N2, 5% CO2, et 0,1% O2 à 37 °C pour 1, 2, 4, 8, 12, ou 16 h.
  4. Après le traitement par hypoxie, aspirer le milieu de la plaque de 6 puits et laver les cellules avec PBS (pH 7,4) trois fois.
  5. Ajouter 2 mL de DMEM complet par puits.
  6. Maintenir les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié sous une atmosphère avec 95% d’air et 5% de CO2.

3. Protocole de température du temps

REMARQUE : Un protocole standard de température du temps est utilisé pendant la chirurgie cardiaque, tel que décrit précédemment pard’autres 20,21. Traiter les HCM selon le protocole suivant (figure 1) : le point de temps 1 (T1) indique la fin de l’induction, le point de temps 2 (T2) indique la fin de l’entretien et le point de temps 3 (T3) indique la fin du réchaurgissement. Analyser les cellules de contrôle maintenues dans des conditions normothermiques continues (37 °C). Les conditions de température sont créées à l’aide d’un incubateur à trois gaz, ce qui permet une régulation précise de la température.

  1. Deux heures avant les expériences, aspirer le milieu de culture à partir d’une assiette de 6 puits et ajouter 2 mL de DMEM frais sans sérum par puits.
  2. Réincuber les cellules dans un incubateur humidifié pendant 2 h à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de CO2.
  3. Après 2 h, aspirer le milieu de la plaque de 6 puits et laver les cellules avec PBS (pH 7,4) trois fois.
  4. Ajouter 2 mL de DMEM frais sans sérum par puits.
  5. Réincuber les cellules dans l’incubateur à trois gaz.
    REMARQUE : Remplacer le milieu pour enlever les cellules et les débris non attachés.
  6. Changez immédiatement la température en plaçant les plats de culture dans un incubateur à trois gaz.
  7. Après 1 h de refroidissement, aspirez rapidement le milieu de l’assiette de 6 puits et ajoutez 2 mL de DMEM frais sans sucre par puits.
  8. Culture des cellules dans un incubateur de tri-gaz sous une atmosphère comprenant 95% N2,5% CO2, et 0.1% O2 à 37 °C pendant 12 h pour établir l’hypoxie.
  9. Réglez la température décrite ci-dessous.
    REMARQUE : Le protocole commence par 10 h d’un traitement à basse température, suivi d’une phase de réchamage de 2 h jusqu’à 37 °C et de 24 h de normothermie (37 °C). À chaque fois, trois boîtes de Pétri sont enlevées pour analyse.
  10. Après un traitement à basse température, aspirer le milieu de la plaque de 6 puits et laver avec PBS (pH 7,4) trois fois.
  11. Ajouter 2 mL de DMEM complet par puits.
  12. Maintenir les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié sous une atmosphère avec 95% d’air et 5% de CO2.

4. Analyse de viabilité CCK-8

  1. Réchauffer la solution 0,25% trypsine-éthylèneediaminetetraacetic acid (EDTA) et PBS à 37 °C avant utilisation.
  2. Aspirer le milieu, rincer les cellules avec 1 mL de PBS, puis ajouter 0,5 mL de trypsine de 0,25% le long de la paroi du puits. Incuber à 37 °C jusqu’à ce que presque tous les HCM soient détachés (environ 1 min).
  3. Ajouter 1 mL de DMEM milieu complet aux puits pour neutraliser la trypsine.
  4. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 15 mL et granuler les HBM par centrifugation à 500 × g pendant 3 min. Aspirer le surnatant sans déranger la pastille.
  5. Distribuez 100 aliquots μL de la suspension cellulaire (5000 cellules/puits) dans une plaque de 96 puits. Préincuber la plaque pendant 24 h dans un incubateur humidifié (à 37 °C.)
  6. Utilisez les cellules de culture dans les plaques de 96 puits pour générer différents groupes de traitement.
  7. Incuber la plaque pendant une durée appropriée (16 h) dans un incubateur.
  8. Ajouter 10 μL de solution CCK-8 à chaque puits de la plaque.
  9. Incuber la plaque pendant 1 heure dans l’incubateur.
  10. Mesurez l’absorption à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaque.
    ATTENTION : Veillez à ne pas introduire de bulles dans les puits, car elles interfèrent avec les mesures de lecture de la DO.

5. Cytométrie de flux pour l’analyse d’apoptose

  1. Effectuez des étapes de trypsinisation et de centrifugation en suivant les étapes 4.2-4.4.
    REMARQUE : Les cellules sont récoltées avec de la trypsine sans EDTA. Pour évaluer l’apoptose, les cellules flottantes et adhérentes sont collectées.
  2. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 1000 × g. Jetez le supernatant et réutilisez la pastille dans 1 mL de PBS.
  3. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. À l’aide d’une pipette, transférer 100 μL de suspension cellulaire traitée par Trypan Blue à un hémocytomètre. À l’aide d’un compteur de décompte à la main, compter les cellules vivantes non tachées dans un ensemble de 16 carrés, puis utiliser PBS pour générer une suspension cellulaire à 1×107 cellules/ml.
  4. Obtenir 200 μL de la suspension cellulaire (5 × 105 -1 × 106 cellules).
  5. Centrifugeuse pendant 5 min à 1000 g × et resuspendre la pastille dans annexe V-FITC solution de liaison.
  6. Ajouter 5 μL d’Annexe V-FITC pour teindre les cellules.
  7. Ajouter 10 μL d’iodure de propidium dans la suspension cellulaire.
  8. Mélanger délicatement les cellules et les incuber pendant 20 minutes à température ambiante dans l’obscurité.
    REMARQUE : Les cellules sont résuspendus 2-3 fois pendant l’incubation pour améliorer la coloration.
  9. Démarrez le cytomètre d’écoulement et assurez-vous que le logiciel fonctionne correctement.
  10. Ouvrez deux fenêtres de parcelle de point dans le logiciel de cytométrie de flux.
  11. Sélectionnez la lumière dispersée vers l’avant (FSC) sur l’axe X et la lumière dispersée latérale (SSC) sur l’axe Y pour exclure les débris cellulaires et/ou les touffes en termes de taille et de granularité, respectivement.
  12. Sélectionnez le canal de détection PE (590 mm) et le FITC (530 mm), qui est utilisé pour mesurer l’intensité de fluorescence des cellules.
  13. Placez le tube d’échantillon blanc (HHM qui n’a pas été cintré) sur le cytomètre d’écoulement.
  14. Cliquez sur Enregistrer pour recueillir les particules de la suspension dans le tube d’échantillon vierge, puis portez la population cellulaire pour une analyse plus approfondie dans la première parcelle à points.
  15. Placez les échantillons tachés sur le bras de soutien du tube. Cliquez sur Enregistrer pour recueillir les particules de la suspension, puis portez la population cellulaire pour une analyse plus approfondie dans la première parcelle à points.
  16. Recueillir les HCM dans d’autres tubes d’échantillon et optimiser la mesure en ajustant les tensions des canaux de fluorescence.
    REMARQUE : Les échantillons non tachés et tachés sont utilisés comme contrôles de compensation pendant l’expérience.
  17. Affichez les statistiques de chaque tube d’échantillon et calculez le taux d’apoptose de chaque échantillon.

6. Évaluation de la dépolarisation mitochondriale

  1. Effectuez la trypsinisation et la centrifugation en suivant les étapes 4.2-4.4.
  2. Resuspendez les cellules en 500 μL de milieu complet, puis ajustez la densité cellulaire ajustée à 1 × 105 - 6 × 106 cellules
  3. Ajouter 0,5 mL de solution de travail JC-1 à chaque tube.
  4. Incuber les cellules dans un incubateur cellulaire à 37 °C pendant 20 minutes.
    REMARQUE : Pendant la période d’incubation, ajouter 1 mL de tampon de coloration JC-1 de 5 × à 4 mL d’eau distillée pour préparer le tampon de coloration JC-1.
  5. Après incubation, centrifuger les cellules à 600 × g pendant 3 min à 4 °C.
  6. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille dans 1 mL de tampon de coloration JC-1.
  7. Répétez les étapes 6,5 à 6,6 trois fois.
  8. Resuspendez les HCM dans 1 mL de tampon de coloration glacée dans un tube de centrifugeuse de 1,5 mL et utilisez les cellules pour analyse dans les 30 minutes.
  9. Sélectionnez le canal de détection pe (590 nm) et fitc (530 nm) pour mesurer l’intensité de fluorescence du colorant JC-1 dans les cellules.
    REMARQUE : Configurer le cytomètre d’écoulement en suivant les étapes 5.10-5.17.

7. Essai réactif d’espèces d’oxygène

  1. Effectuez la trypsinisation et la centrifugation en suivant les étapes 4.2-4.4.
  2. Tacher les cellules dans le milieu de la culture avec 10 μM DCFDA et ajuster la densité cellulaire à 1 × 106 - 1 × 107 cellules
  3. Incuber pendant 30 minutes à 37 °C.
  4. Pipette doucement les cellules vers le haut / vers le bas toutes les 3-5 min.
  5. Après l’incubation, laver les cellules trois fois avec un milieu de culture cellulaire sans sérum.
  6. Analyser les cellules sur un cytomètre d’écoulement en suivant les étapes 5.10-5.17.
    REMARQUE : Le DCF est excité à 488 nm et l’intensité des émissions mesurée à 530 nm.

8. Mesure de Caspase 3/ Caspase 8 Activité

  1. Effectuez la trypsinisation en suivant les étapes 4.2-4.4.
  2. Recueillir les cellules par centrifugation à 600 × g à 4 °C pendant 5 minutes.
  3. Ajouter 100 μL de tampon lysate par 2 × 106 cellules.
  4. Lyse les cellules pendant 15 minutes sur la glace.
  5. Après avoir incubé pendant 15 min dans un bain de glace, centrifuger l’échantillon à 1,6 × 104 x g à 4 °C pendant 15 minutes.
  6. Transférer le supernatant dans un tube de centrifugeuse glacée pour utilisation.
    REMARQUE : La concentration de protéines dans l’échantillon doit être d’au moins 1-3 mg/mL.
  7. Retirer l’Ac-DEVD-pNA (2 mM) et le placer sur un bain de glace pour utilisation.
  8. Ajouter avec précision 40 μL de solution tampon à la plaque étiquetée enzymatique, ajouter 80 μL de l’échantillon et enfin ajouter 10 μL d’Ac-DEVD-pNA (2 mM).
  9. Incuber l’échantillon à 37 °C pendant 120 minutes.
  10. Mesure de la valeur de l’A405 sur un lecteur de microplaques selon les instructions du fabricant.
    REMARQUE : L’absorption produite par la pNA générée par le caspase-3/caspase-8 est calculée en soustrayant la valeur A405 du contrôle vierge de celle de l’échantillon.

Résultats

L’effet de l’exposition aux DG sur la viabilité des HCM a été déterminé par l’essai CCK-8. Comparativement à celle observée dans le groupe témoin, la viabilité des cellules a été considérablement réduite d’une manière dépendante du temps (figure 2A). Les taux d’apoptose des HHC À différents moments après la reperfusion ont montré une tendance spécifique, où de 0 à 16 h, les taux d’apoptose ont graduellement augmenté et ont atteint le taux maximum au point d...

Discussion

Les complexités des animaux intacts, y compris les interactions entre les différents types de cellules, empêchent souvent des études détaillées de composants spécifiques des lésions I/R. Par conséquent, il est nécessaire d’établir un modèle cellulaire in vitro qui peut refléter avec précision les changements moléculaires après l’ischémie in vivo. La recherche sur les modèles OGD a déjà étérapportée 13,22, et beaucoup de méthodes sophis...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ces travaux ont été financés en partie par la National Natural Science Foundation of China (81970265, 81900281,81700288), la China Postdoctoral Science Foundation (2019M651904); et le National Key Research and Development Program of China (2016YFC1101001, 2017YFC1308105).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Annexin V-FITC cell apoptosis detection kitBio-Technology,ChinaC1062M
Cardiac myocyte growth supplementSciencell,USA6252
Caspase 3 activity assay kitBio-Technology,ChinaC1115
Caspase 8 activity assay kitBio-Technology,ChinaC1151
DMEM, no glucoseGibco,USA11966025
Dulbecco's modified eagle mediumGibco,USA11960044
Fetal bovine serumGibco,USA16140071
Flow cytometryCytoFLEX,USAB49007AF
Human myocardial cellsBLUEFBIO,ChinaBFN60808678
Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1Bio-Technology,ChinaC2006
Penicillin/Streptomycin solutionGibco,USA10378016
Reactive oxygen species assay kitBio-Technology,ChinaS0033S
Three-gas incubatorMemmert,GermanyICO50
Trypsin-EDTA (0.25%)Gibco,USA25200056

Références

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