ヒト心臓筋細胞モデルにおける低体温症前処理に対する心筋保護のインビトロ評価

要約

心筋保護に対する低体温の異なる程度の明確な影響は十分に評価されていない。本研究の目的は、ヒト心筋細胞系モデルにおける異なる低体温症治療に続く細胞死のレベルを定量化し、将来の詳細な分子研究の基礎を築くことであった。

要約

虚血/再灌流由来心筋機能障害は、心臓手術後の患者における一般的な臨床シナリオである。特に、虚血性損傷に対する心筋細胞の感受性は、他の細胞集団のそれよりも高い。現在、低体温症は、予想される虚血性侮辱に対してかなりの保護を与える。しかし、複雑な低体温症による分子変化の調査は依然として限定的である。そのため、臨床状態で観察されたような損傷を再現可能な方法で誘導できるin vivo状態と同様の培養条件を特定することが不可欠である。インビトロで虚血様の状態を模倣するために、これらのモデルの細胞は酸素/グルコース欠乏(OGD)によって処理された。また、心臓手術時に使用される標準時間温度プロトコルを適用しました。さらに、心筋損傷の定量的分析に、シンプルかつ包括的な手法を用いたアプローチを提案する。アポトーシス関連タンパク質のアポトーシスおよび発現レベルを、フローサイトメトリーおよびELISAキットを用いて評価した。本モデルでは、異なる温度条件が体外での心筋細胞アポトーシスに及ぼす影響に関する仮説を検証した。このモデルの信頼性は、厳密な温度制御、制御可能な実験手順、および安定した実験結果に依存します。さらに、このモデルは、低体温療法の開発に重要な意味を持つ低体温心保護の分子機構を研究するために使用することができます。

概要

虚血/再灌流由来心筋機能障害は、心臓手術^1、2後の患者における一般的な臨床シナリオである。非パルスタイル低流動灌流および総循環停止期間中に、すべてのタイプの心臓細胞を含む損傷がまだ起こる。特に、虚血性損傷に対する心筋細胞の感受性は、他の細胞集団のそれよりも高い。現在、治療低体温症(TH)は、心臓手術^3、4を受けている患者において予想される虚血性侮辱に対して実質的な保護を与える。THは、心臓手術中の冷却の定義に関するコンセンサスは存在しないが、14-34 °Cのコア体温として定義^{される5、6、7。}2013年、国際的な専門家パネルは、全身低体温循環停止8の様々な温度範囲を分類するための標準化された報告システムを提案^した。脳の脳波と代謝の研究に基づいて、彼らは低体温症を4つのレベルに分けた:深度低体温症(≤14°C)、深い低体温症(14.1-20°C)、中等度の低体温(20.1-28°C)、および軽度の低体温症(28.1-34°C)。専門家のコンセンサスは明確で均一な分類を提供し、研究がより比較可能になり、より臨床的に関連する結果を提供することを可能にした。THによって与えられるこの保護は、細胞の代謝活性を低下させる能力に基づいており、高エネルギーリン酸塩消費の速度をさらに制限する^9,10。しかし、心筋保護におけるTHの役割は議論の余地があり、低体温症の程度に応じて複数の効果を有する可能性がある。

心筋I/Rは、細胞アポプシス¹¹の増加を伴うことはよく知られている。最近の報告では、プログラムされた心筋細胞死が開胸手術中に増加し、壊死と一致し、それによって死んだ心筋細胞の数^が12に増加することが観察されている。従って、心筋細胞アポトーシスの低減は、臨床現場で有用な治療アプローチである。マウス心房HL-1心筋細胞モデルにおいて、治療下垂体は、再灌流中のチトクロムcおよびアポトーシス誘導因子(AIF)のミトコンドリア放出を減少させることが示^{された13。}しかし、アポトーシスの調節における温度の影響は議論の余地があり、低体温症の程度に依存しているように見える。Cooperたちの研究グループは、ノルマンサーミック心肺バイパスコントロール群と比較して、深低体温循環停止を有する豚由来の心筋組織のアポトーシス率が¹⁴増加したことを観察した。さらに、いくつかの研究の結果は、深い低体温がアポトーシス経路を活性化する可能性があることを示唆しているが、あまり積極的な低体温は経路^12、15、16を阻害するように見える。この結果の理由は、虚血性損傷に関連する交核化効果と、温度が心筋組織に影響を与えるメカニズムの理解の欠如に起因する可能性があります。したがって、アポトーシスが増強または減衰する温度制限は正確に定義されるべきである。

低体温症の効力に関連するメカニズムをよりよく理解し、ヒトにおけるその実施の合理的な基礎を提供するためには、臨床状態に対して観察されたような損傷を再現可能なin vivo状態と同様の培養条件を同定することが不可欠である。この目標を達成するための重要なステップは、心筋細胞アポトーシスを誘導するための最適な条件を確立することです。そこで、本研究では、虚血再灌流の容易なインビトロモデルである培養細胞による酸素グルコース欠乏実験に関する方法論的詳細を検討した。さらに、心筋細胞アポトーシスに対する異なる低酸素虚血時間の影響を評価し、インビトロにおける細胞アポトーシスに対する異なる温度条件の影響に関する仮説を検証した。

プロトコル

市販の試薬や器具に関する情報は、 資料表に記載されています。

AC16ヒト心筋細胞株は、BLUEFBIO(上海、中国)から購入したSV40形質転換ヒト線維芽細胞¹⁷と成体心室心臓組織からの初代細胞の融合に由来した。細胞株は、心筋細胞の特徴を多くの生化学的および形態学的特徴を開発する。また、細胞株は、ビトロ^18,19において心筋損傷および心筋機能を評価するために広く用^{いられている}。

1. 細胞培養

注:基底培養培地は、無血清のダルベッコの修飾されたイーグルの培地(DMEM)、10%のウシ胎児血清(FBS)、1%心臓筋細胞増殖サプリメント、および1%ペニシリン/ストレプトマイシン溶液で構成されています。使用前に4°C、前温37°Cで保存してください。

1. 凍結保存されたヒト心筋細胞(HCM)細胞を液体窒素から取り出し、37°Cの水浴で解凍します。
2. バイアルに小さな氷が残るまで、37°Cの水浴でバイアル(<1分)を軽く振ります。
3. バイアルを無菌層流れフードに移します。70%のアルコールを浸した綿のボールでバイアルの外側を拭きます。
4. 解凍した細胞を含む遠心分離管に滴下する4mLの前温成長培地を移す。
5. 200×gで細胞懸濁液を10分間遠心分離する。 遠心分離後、上清を捨て、ペレットを完全培地の5mLに再懸濁します。
6. 95%の空気と5%の_CO2を有する雰囲気の下で加湿インキュベーターで37°Cの細胞を維持する。
   注:実験のために細胞を収穫する前に、細胞は約60〜70%の合流に達するまで増殖することができます。

酸素グルコース欠乏(OGD)モデルの確立

注:研究期間の2時間前に、成長培地を無血清培地に置き換え、細胞を5%CO2の雰囲気下で37°Cで2時間加湿インキュベーターで再インキュベーターに再インキュベーターした。

1. 培地を6ウェルプレートから吸引し、リン酸緩衝生理食塩液(PBS)で細胞を3回軽く洗浄します。
2. 1ウェルあたり2mLの新鮮な無糖DMEMを加えます。
3. 3ガスインキュベーターで、3ガスインキュベーターで、35%N2、5%CO2、および0.1%O2を37°Cで1、2、4、8、12、または16時間の一定温度で培養します。
4. 低酸素処理後、培地を6ウェルプレートから吸引し、PBS(pH7.4)で細胞を3回洗浄する。
5. 井戸ごとに完全なDMEMの2 mLを追加します。
6. 95%の空気と5%の_CO2を有する雰囲気の下で加湿インキュベーターで37°Cの細胞を維持する。

3. 時間温度プロトコル

注: 標準の時間温度プロトコルは、心臓手術中に使用されます。以下のプロトコルに従ってHCMを処理する(図1):タイムポイント1(T1)は誘導の終了を示し、タイムポイント2(T2)はメンテナンスの終了を示し、タイムポイント3(T3)は再温暖化の終了を示す。連続性標準条件下で維持された制御細胞を解析(37°C)。温度条件は、正確な温度調節を可能にする三ガスインキュベーターを使用して作成されます。

1. 実験の2時間前に、培養液を6ウェルプレートから吸引し、1ウェルあたり2mLの新鮮な無血清DMEMを加える。
2. 5%CO2の雰囲気下で37°Cで2時間加湿インキュベーターで細胞を再インキュベートする。
3. 2時間後、培地を6ウェルプレートから吸引し、PBS(pH7.4)で細胞を3回洗浄する。
4. 1ウェルあたり2mLの新鮮な無血清DMEMを加えます。
5. 三ガスインキュベーター内の細胞を再インキュベートします。
   メモ:取り付けられていない細胞や破片を取り除くために、媒体を交換してください。
6. 培養皿を三ガスインキュベーターに置くことにより、直ちに温度を変えます。
7. 1時間の冷却後、6ウェルプレートから培地を素早く吸引し、1ウェルあたり2mLの新鮮な無糖DMEMを加える。
8. 低酸素症を確立するために37°Cで95%N2、5%CO2、および0.1%O2を含む雰囲気下で三ガスインキュベーターで細胞を培養する。
9. 温度を以下のように設定します。
   注:プロトコルは、低温処理の10時間から始まり、2時間から37°Cまでの再温暖化相、ノルメロザミア(37°C)の24時間の再温暖化が続きます。各時点で、3つのペトリ皿が分析のために取り除かれます。
10. 低温処理後、培地を6ウェルプレートから吸引し、PBS(pH7.4)で3回洗浄する。
11. 井戸ごとに完全なDMEMの2 mLを追加します。
12. 95%の空気と5%の_CO2を有する雰囲気の下で加湿インキュベーターで37°Cの細胞を維持する。

4. CCK-8実行可能性アッセイ

1. 0.25%トリプシン-エチレンアミン酢酸(EDTA)溶液とPBSを使用前に37°Cに温めます。
2. 培地を吸引し、1 mLのPBSで細胞をすすい、ウェルの壁に沿って0.25%のトリプシンの0.5 mLを加えます。ほぼすべてのHCMが剥離されるまで37°Cでインキュベート(約1分)
3. トリプシンを中和するためにウェルにDMEM完全培地の1 mLを追加します。
4. 細胞懸濁液を15mL遠心チューブに移し、500×gで遠心分離してHCMを3分間ペレットします。ペレットを邪魔することなく上清を吸引する。
5. 細胞懸濁液(5000細胞/ウェル)の100μLアリコートを96ウェルプレートに分配します。加湿インキュベーターでプレートを24時間前にインキュベートする(37°C)
6. 培養した細胞を96ウェルプレートに使用して、異なる処理群を生成します。
7. インキュベーターでプレートを適当な時間(16時間)インキュベートします。
8. プレートの各ウェルに10 μLのCCK-8溶液を加えます。
9. インキュベーターでプレートを1時間インキュベートします。
10. マイクロプレートリーダーを使用して450 nmで吸光度を測定します。
    注意: 気泡は、ODの読み取り測定を妨げるので、井戸に気泡を導入しないように注意してください。

5. アポトーシス解析のためのフローサイトメトリー

1. ステップ 4.2~4.4 に従って、トリプシン化と遠心化の手順を実行します。
   メモ:細胞はEDTAなしでトリプシンで収穫されます。アポトーシスを評価するために、浮遊細胞と付着細胞の両方が収集される。
2. 1000×gで5分間細胞を遠心分離する。上清を捨て、PBSの1mLでペレットを再懸濁します。
3. ヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。ピペットを使用して、トリパンブルー処理細胞懸濁液の100 μLをヘモサイトメーターに移します。ハンド集計カウンターを使用して、16個の正方形の1組に生きた未染色細胞を数え、PBSを使用して1×10⁷ セル/mlで細胞懸濁液を生成する。
4. 200μLの細胞懸濁液(5×105-1×106細胞)を得る。
5. 遠心分離機は1000×gで5分間、アネキシンV-FITC結合溶液中のペレットを再懸濁します。
6. 5 μLのアネキシンV-FITCを加えて細胞を染色します。
7. 10μLのヨウ化プロピジウムを細胞懸濁液に加えます。
8. 細胞を穏やかに混ぜ、暗闇の中で室温で20分間インキュベートします。
   注:細胞は、染色を改善するために、インキュベーション中に2〜3回再懸濁されます。
9. フローサイトメーターを起動し、ソフトウェアが適切に動作していることを確認します。
10. フローサイトメトリーソフトウェアで2つのドットプロットウィンドウを開きます。
11. X 軸の前方散乱光 (FSC) と Y 軸の側面散乱光 (SSC) を選択して、それぞれサイズと粒度の観点からセルの破片や束を除外します。
12. 細胞の蛍光強度を測定するために使用されるPE(590 mm)検出チャネルおよびFITC(530 mm)を選択します。
13. フローサイトメーターにブランク(染色されていないHCM)サンプルチューブを置きます。
14. [ 記録 ]をクリックして、空のサンプルチューブ内の懸濁液からパーティクルを収集し、最初のドットプロットでさらなる分析のためにセルの母集団をゲートします。
15. 単染色サンプルをチューブサポートアームに配置します。[ レコード ]をクリックして懸濁液からパーティクルを収集し、最初のドット プロットでさらなる解析のためにセルの母集団をゲートします。
16. 他のサンプルチューブにHcMを集め、蛍光チャネルの電圧を調整して測定を最適化します。
    注: 染色されていないサンプルと単染色されたサンプルは、実験中に補正コントロールとして使用されます。
17. 各サンプルチューブの統計を表示し、各サンプルのアポトーシス率を計算します。

6. ミトコンドリア脱分極評価

1. ステップ 4.2-4.4 に従ってトリプシン化と遠心分離を行います。
2. 完全な培地の500 μLで細胞を再懸濁し、1×10⁵ - 6 ×10⁶ 細胞に調整した細胞密度を調整します
3. 各チューブに0.5 mLのJC-1作業溶液を追加します。
4. 細胞インキュベーター中の細胞を37°Cで20分間インキュベートします。
   注:インキュベーション期間中、5×JC-1染色バッファーを4mLの蒸留水に1mL添加し、JC-1染色バッファーを調製します。
5. インキュベーション後、4°Cで3分間600×gで細胞を遠心分離する。
6. 上清を捨て、JC-1染色バッファーの1 mLにペレットを再懸濁します。
7. 手順 6.5 ~ 6.6 を 3 回繰り返します。
8. 1.5 mL遠心分離管内の氷冷染色バッファーの1 mLでHCMを再懸濁し、30分以内に分析するために細胞を使用します。
9. PE(590 nm)検出チャネルとFITC(530 nm)を選択して、細胞内のJC-1色素の蛍光強度を測定します。
   メモ:手順5.10~5.17に従ってフローサイトメーターを設定します。

7. 活性酸素種アッセイ

1. ステップ 4.2-4.4 に従ってトリプシン化と遠心分離を行います。
2. 10 μM DCFDA を用いて培地中の細胞を染色し、細胞密度を 1 × 10⁶ ~ 1 × 10⁷ 細胞に調整する
3. 37°Cで30分間インキュベートする。
4. 3~5分ごとに細胞を上下に軽くピペットします。
5. インキュベーション後、細胞を無血清細胞培養培地で3回洗浄する。
6. フローサイトメーターの細胞を、ステップ 5.10~5.17 に従って分析します。
   注: DCF は 488 nm で励起され、530 nm で測定された発光強度です。

8. カスパーゼ3/カスパーゼ8活性測定

1. ステップ 4.2 から 4.4 に従ってトリプシンを実行します。
2. 4°Cで600×gで5分間遠心分離して細胞を回収する。
3. 2個の×106細胞あたり100μLのライセートバッファーを加えます。
4. 氷の上で15分間細胞をライスします。
5. 氷浴で15分間インキュベートした後、1.6×10⁴ x gでサンプルを遠心分離し、4°Cで15分間遠心します。
6. 上清を氷冷遠心管に移して使用します。
   注:サンプル中のタンパク質濃度は、少なくとも1〜3mg/mLでなければなりません。
7. Ac-DEVD-pNA(2 mM)を取り出し、氷浴に置いて使用してください。
8. 酵素標識プレートに40 μLのバッファー溶液を正確に添加し、サンプルを80 μL添加し、最後に10 μLのAc-DEVD-pNA(2 mM)を加えます。
9. 37°Cで120分間インキュベートします。
10. メーカーの指示に従ってマイクロプレートリーダーでA405値を測定。
    注: caspase-3/caspase-8 によって生成される pNA によって生成される吸光度は、サンプルのブランクコントロールの A405 値を減算して計算されます。

結果

HCMの生存率に対するOGD暴露の効果は、CCK-8アッセイによって決定された。対照群で観察されたものと比較して、細胞生存率は時間依存的に有意に低下した(図2A)。再灌流後の異なる時期におけるHCMのアポトーシス率は、0から16時間までの特定の傾向を示し、アポトーシス率は徐々に増加し、16時間時点で最大速度に達した(図2B)。OGDとして12hの細胞活?...

ディスカッション

異なるタイプの細胞間の相互作用を含む無傷の動物の複雑さは、しばしばI/R傷害の特定の構成要素の詳細な研究を妨げる。そのため、インビボでの虚血後の分子変化を正確に反映できるインビトロ細胞モデルを確立する必要がある。OGDモデルに関する研究は、以前に報告されています^13,22, そして多くの洗練された方法が確立されています

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit	Bio-Technology,China	C1062M
Cardiac myocyte growth supplement	Sciencell,USA	6252
Caspase 3 activity assay kit	Bio-Technology,China	C1115
Caspase 8 activity assay kit	Bio-Technology,China	C1151
DMEM, no glucose	Gibco,USA	11966025
Dulbecco's modified eagle medium	Gibco,USA	11960044
Fetal bovine serum	Gibco,USA	16140071
Flow cytometry	CytoFLEX,USA	B49007AF
Human myocardial cells	BLUEFBIO,China	BFN60808678
Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1	Bio-Technology,China	C2006
Penicillin/Streptomycin solution	Gibco,USA	10378016
Reactive oxygen species assay kit	Bio-Technology,China	S0033S
Three-gas incubator	Memmert,Germany	ICO50
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco,USA	25200056