İnsan Kardiyak Miyosit Modelinde Hipotermi-Önkoşullama Sonrası Miyokard Korumasının İn vitro Değerlendirmesi

Özet

Farklı hipotermi derecelerinin miyokard koruması üzerindeki belirgin etkileri ayrıntılı olarak değerlendirilmemiştir. Bu çalışmanın amacı, insan kardiyomiyosit tabanlı bir modelde farklı hipotermi tedavilerinin ardından hücre ölüm seviyelerini ölçmek ve gelecekteki derinlemesine moleküler araştırmaların temelini atmaktı.

Özet

İskemi/reperfüzyondan türetilmiş miyokard disfonksiyonu kalp cerrahisi sonrası hastalarda sık görülen bir klinik senaryodur. Özellikle, kardiyomiyositlerin iskemik yaralanmaya duyarlılığı diğer hücre popülasyonlarından daha yüksektir. Şu anda hipotermi, beklenen iskemik hakarete karşı önemli bir koruma sağlar. Bununla birlikte, karmaşık hipotermi kaynaklı moleküler değişikliklerle ilgili araştırmalar sınırlı kalmaktadır. Bu nedenle, klinik durumda gözlemlenene benzer hasarlara neden olabilecek in vivo durumlara benzer bir kültür durumunun tekrarlanabilir bir şekilde tanımlanması esastır. İn vitro iskemi benzeri durumları taklit etmek için, bu modellerdeki hücreler oksijen /glikoz yoksunluğu (OGD) ile tedavi edildi. Ayrıca kalp cerrahisi sırasında kullanılan standart bir zaman-sıcaklık protokolü uyguladık. Ayrıca, miyokard hasarının nicel analizi için basit ama kapsamlı bir yöntem kullanmak için bir yaklaşım öneriyoruz. Apoptoz ilişkili proteinlerin apoptoz ve ekspresyon düzeyleri akış sitometrisi ve ELISA kiti kullanılarak değerlendirildi. Bu modelde, farklı sıcaklık koşullarının kardiyomiyosit apoptoz in vitro üzerindeki etkileri ile ilgili bir hipotezi test ettik. Bu modelin güvenilirliği sıkı sıcaklık kontrolüne, kontrol edilebilir deneysel prosedürlere ve istikrarlı deneysel sonuçlara bağlıdır. Ek olarak, bu model hipotermik kardiyoproteksiyonun moleküler mekanizmasını incelemek için kullanılabilir, bu da hipotermi ile kullanılmak üzere tamamlayıcı tedavilerin geliştirilmesi için önemli etkileri olabilir.

Giriş

İskemi/reperfüzyondan türetilmiş miyokard disfonksiyonu kalp cerrahisi sonrası hastalarda sık görülen bir klinik senaryodur^1,2. Zengin olmayan düşük akış perfüzyonu ve toplam dolaşım durması dönemlerinde, her türlü kalp hücresini içeren hasarlar oluşmaya devam eder. Özellikle, kardiyomiyositlerin iskemik yaralanmaya duyarlılığı diğer hücre popülasyonlarından daha yüksektir. Şu anda, terapötik hipotermi (TH), kalp cerrahisi uygulanan hastalarda beklenen iskemik hakarete karşı önemli bir koruma sağlar^3,4. TH, 14-34 ° C çekirdek vücut sıcaklığı olarak tan

Protokol

Ticari reaktifler ve aletlerle ilgili bilgiler Malzeme Tablosundalistelenmiştir.

AC16 insan kardiyomiyosit hücre hattı, yetişkin ventrikül kalp dokusundan birincil hücrelerin BLUEFBIO'dan (Şanghay, Çin) satın alınan SV40 dönüştürülmüş insan fibroblastları¹⁷ile füzyonundan türetilmiştir. Hücre hattı kardiyomiyositlerin karakteristik birçok biyokimyasal ve morfolojik özelliğini geliştirir. Ek olarak, hücre hattı miyokard hasarını ve miyokard fonksiyonunu değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır in vitro^18,19.

1. Hü

Sonuçlar

OGD maruziyetinin HCM'lerin canlılığı üzerindeki etkisi CCK-8 tahlili ile belirlendi. Kontrol grubunda gözlenenlerle karşılaştırıldığında, hücre canlılığı zamana bağlı olarak önemli ölçüde azaldı (Şekil 2A). Reperfüzyondan sonra farklı zamanlarda HCM'lerin apoptoz oranları, 0 ila 16 saat arasında, apoptoz oranlarının kademeli olarak arttığı ve 16 saat zaman noktasında maksimum orana ulaştığı belirli bir eğilim göstermiştir (Şe...

Tartışmalar

Farklı hücre türleri arasındaki etkileşimler de dahil olmak üzere sağlam hayvanların karmaşıklıkları, genellikle I /R yaralanmasının belirli bileşenlerinin ayrıntılı çalışmalarını önler. Bu nedenle, in vivo iskemi sonrası moleküler değişiklikleri doğru bir şekilde yansıtabilecek bir in vitro hücre modeli oluşturmak gerekir. OGD modelleri üzerinde yapılan araştırmalar daha önce^13,22ve birçok sofistike yöntem oluşturulmuştu...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit	Bio-Technology,China	C1062M
Cardiac myocyte growth supplement	Sciencell,USA	6252
Caspase 3 activity assay kit	Bio-Technology,China	C1115
Caspase 8 activity assay kit	Bio-Technology,China	C1151
DMEM, no glucose	Gibco,USA	11966025
Dulbecco's modified eagle medium	Gibco,USA	11960044
Fetal bovine serum	Gibco,USA	16140071
Flow cytometry	CytoFLEX,USA	B49007AF
Human myocardial cells	BLUEFBIO,China	BFN60808678
Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1	Bio-Technology,China	C2006
Penicillin/Streptomycin solution	Gibco,USA	10378016
Reactive oxygen species assay kit	Bio-Technology,China	S0033S
Three-gas incubator	Memmert,Germany	ICO50
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco,USA	25200056