Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

שליטה אמינה בתאי יונקים מגיבים לאור דורשת סטנדרטיזציה של שיטות אופטוגנטיות. לקראת מטרה זו, מחקר זה מתאר צינור של בניית מעגלי גנים, הנדסת תאים, פעולת ציוד אופטוגנטי, ובדיקות אימות כדי לתקנן את המחקר של ביטוי גנים המושרה באור באמצעות מעגל גנים אופטוגנטי משוב שלילי כמקרה מבחן.

Abstract

שליטה אמינה בביטוי גנים בתאי יונקים דורשת כלים עם שינוי קיפול גבוה, רעש נמוך ופונקציות העברה נחושות של קלט לפלט, ללא קשר לשיטה שבה נעשה שימוש. לקראת מטרה זו, מערכות ביטוי גנים אופטוגנטיות זכו לתשומת לב רבה בעשור האחרון לשליטה מרחבית ברמות החלבון בתאי היונקים. עם זאת, רוב המעגלים הקיימים השולטים בביטוי גנים הנגרמים על ידי אור משתנים בארכיטקטורה, באים לידי ביטוי מפלסמידים, ומשתמשים בציוד אופטוגנטי משתנה, ויוצרים צורך לחקור אפיון ותקינה של רכיבים אופטוגנטיים בשורות תאים יציבים. כאן, המחקר מספק צינור ניסיוני של בניית מעגלי גנים אמינים, אינטגרציה ואפיון לשליטה בביטוי גנים בלתי חדירים לאור בתאי יונקים, תוך שימוש במעגל אופטוגנטי משוב שלילי כדוגמה למקרה. הפרוטוקולים גם ממחישים כיצד סטנדרטיזציה של ציוד אופטוגנטי ומשטרי אור יכולה לחשוף באופן מהימן תכונות מעגל גנים כגון רעש ביטוי גנים וגודל ביטוי חלבון. לבסוף, מאמר זה עשוי להיות שימושי עבור מעבדות שאינן מוכרות עם אופטוגנטיקה המעוניינים לאמץ טכנולוגיה כזו. הצינור המתואר כאן צריך לחול על מעגלים אופטוגנטיים אחרים בתאי יונקים, המאפשרים אפיון אמין ומפורט יותר ושליטה על ביטוי גנים ברמה התמלולית, הפרוטאומית, ובסופו של דבר פנוטיפית בתאי יונקים.

Introduction

בדומה לדיסציפלינות הנדסיות אחרות, ביולוגיה סינתטית שואפת לתקנן פרוטוקולים, ומאפשרת להשתמש בכלים עם פונקציות רב-תכליתיות לשחזור לחקר שאלות הרלוונטיות למערכות ביולוגיות1,2. תחום אחד בביולוגיה סינתטית שבו נבנו מערכות בקרה רבות הוא תחום ויסות ביטוי הגנים3,4. בקרת ביטוי גנים יכולה למקד הן את רמות החלבון והן את השונות (רעש או מקדם וריאציה, CV = σ/μ, הנמדדים כסטיית התקן על הממוצע), שהם מאפיינים תאיים קריטיים בשל תפקידם במצבים תאיים פיזיולוגיים ופתולוגיים5,6,7,8. מערכות סינתטיות רבות שיכולות לשלוט ברמות החלבון וברעש4,9,10,11,12 תוכננו, מה שיוצר הזדמנויות לתקנן פרוטוקולים בכלים שונים.

קבוצה חדשה אחת של כלים שיכולים לשלוט ברשתות גנים שהתפתחה לאחרונה היא אופטוגנטיקה, המאפשרת שימוש באור כדי לשלוט בביטוי הגנים13,14,15,16,17. בדומה לקודמיהם הכימיים, ניתן להכניס מעגלי גנים אופטוגנטיים לכל סוג תא, החל מחיידקים ועד יונקים, המאפשרים ביטוי של כל גן עניין במורד הזרם18,19. עם זאת, בשל הדור המהיר של כלים אופטוגנטיים חדשניים, התפתחו מערכות רבות המשתנות בארכיטקטורת מעגלים גנטיים, מנגנון הביטוי (למשל, מבוסס פלסמיד לעומת שילוב ויראלי), וציוד בקרת אספקת אור11,16,20,21,22,23,24,25 . לכן, זה משאיר מקום לתקנון של תכונות אופטוגנטיות כגון בניית מעגל גנים ואופטימיזציה, שיטת ניצול המערכת (למשל, אינטגרציה לעומת ביטוי חולף), כלים ניסיוניים המשמשים אינדוקציה וניתוח תוצאות.

כדי להתקדם בתקינון פרוטוקולים אופטוגנטיים בתאי יונקים, פרוטוקול זה מתאר צינור ניסיוני להנדס מערכות אופטוגנטיות בתאי יונקים באמצעות מעגל גנים משוב שלילי (NF) המשולב בתאי HEK293 (קו תאי כליה עובריים אנושיים) כדוגמה. NF היא מערכת אידיאלית להדגמת תקינה מכיוון שהיא שופעת מאוד בטבעה 26,27,28, ומאפשרת כוונון רמות חלבון ומזעור רעש להתרחש. בקצרה, NF מאפשר שליטה מדויקת בביטוי גנים על ידי מדכא המפחית את הביטוי שלו מספיק מהר, ובכך מגביל כל שינוי הרחק ממצב יציב. המצב היציב יכול להשתנות על ידי ממריץ כי מנטרל או מבטל את הדיכוי כדי לאפשר ייצור חלבון יותר עד מצב יציב חדש הוא הגיע עבור כל ריכוז ממריץ. לאחרונה, נוצרה מערכת אופטוגנטית מהונדסת של NF שיכולה לייצר תגובה דינמית רחבה של ביטוי גנים, לשמור על רעש נמוך ולהגיב לגירויים קלים המאפשרים את הפוטנציאל לשליטה בביטוי גנים מרחביים11. כלים אלה, המכונים מקלטים בלתי ניתנים למניעה לאור (LITers), נוצרו בהשראת מערכות קודמות שאפשרו שליטה בביטוי גנים בתאים חיים4,10,29,30 ושולבו ביציבות בקווי תאים אנושיים כדי להבטיח שליטה ארוכת טווח בביטוי הגנים.

כאן, באמצעות LITer כדוגמה, פרוטוקול מתואר ליצירת מעגלי גנים מגיבים לאור, גרימת ביטוי גנים עם מנגנון צלחת אור (LPA, חומרת אינדוקציה אופטוגנטית)31, ולנתח את התגובות של קווי התא המהונדסים, האופטוגנטיים לשליטה לגירויים אור מותאמים אישית. פרוטוקול זה מאפשר למשתמשים להשתמש בכלי LITer עבור כל גן פונקציונלי שהם רוצים לחקור. זה יכול להיות מותאם גם עבור מערכות אופטוגנטיות אחרות עם ארכיטקטורות מעגלים מגוונות (למשל, משוב חיובי, רגולציה שלילית, וכו ') באמצעות שילוב השיטות וציוד אופטוגנטי המתואר להלן. בדומה לפרוטוקולים אחרים של ביולוגיה סינתטית, ניתן ליישם את הקלטות הווידאו והפרוטוקולים האופטוגנטיים המתוארים כאן במחקרים חד-תאיים בתחומים מגוונים, כולל אך לא מוגבל לביולוגיה של סרטן, התפתחות עוברית ובידול רקמות.

Protocol

1. תכנון מעגלי גנים

  1. בחר רכיבים גנטיים לשילוב במעגל גנים/פלסמיד יחיד (לדוגמה, מוטיבים של רצף שילוב DNA של יונקים32, אלמנטים מגיבים לאור33 או גנים פונקציונליים34).
  2. באמצעות כל הנדסה גנטית ו/או תוכנה לשיבוט מולקולרי, אחסן את רצפי הדנ"א לשימוש והפניה מאוחרים יותר, הוסף ביאורים לכל רצף ובחן את כל התכונות הדרושות (לדוגמה, קודונות START, תקינה או רצפים מתורגמים)35.
  3. לפתח או לאמץ חלקים על פי העיצוב הכולל של מעגל הגנים36. לדוגמה, עבור מדכאים אופטוגנטיים כמו LITers11, למזג קידוד רצף גנים עבור תחום המסוגל השפלה בלתי ניתנת לחישה אור37,38 או השבתה של יכולת איגוד DNA של מדכא 39, בסמוך ובמסגרת של גן הדיכוי (למשל, TetR)4.
    1. עבור מפעילים אופטוגנטיים, להבטיח את נוכחותו של domain activator40 המקדם ביטוי גנים על כריכת DNA המושרה אור41. עבור רישום אוטומטי שלילי או חיובי, להבטיח את נוכחותו של אתר מחייב רגולטורי בתוך או במעלה הזרם של מקדם הגן של הרגולטור (למשל, אתרי tetO בתוך או במעלה הזרם של מקדם ביטוי TetR)42.
  4. עצבו את הפריימרים להגברת רצף הדנ"א או לרצף הפלסמיד באמצעות תוכנת השיבוט המולקולרית לכל מעגל גנים.
  5. אמת את הפריימרים באופן חישובי לבנייה פלסמידית באמצעות משתה מובנה של תוכנת שיבוט מולקולרית (למשל, יישור רצף).
  6. להזמין פריימרים oligonucleotide מהיצרן. פלסמידים שנבנו ונמצאו בשימוש בעבודה זו ניתן למצוא בחומר התומך המקורי11 יחד עם הפריימרים שתוכננו ונמצאו בשימוש.
  7. לדלל את הפריימרים לריכוז מלאי של 100 מ"מ במים מזוקקים כפולים (ddH2O).
  8. לדלל את המלאי של פריימרים מניות 100 mM לריכוז 10 mM עבור PCR.
  9. הכן את תערובת ה- PCR עם 1 μL של פריימר קדמי, 1 μL של פריימר הפוך, 1 μL של DNA תבנית למסה כוללת של 0.5-500 ng עבור גנומי או 0.5 pg-5 ng עבור plasmid או DNA ויראלי, 12.5 μL של DNA פולימראז 2x תערובת מאסטר (או הנפח המספק את גורם הדילול של היצרן), ו 9.5 μL של ddH2O עבור נפח תגובה כולל של 25 μL.
  10. דגירה של תערובת PCR בתרמוציקלר בהגדרות המתאימות בהתאם לאנזים שנבחר43. מחזורי התגובה המוצעים כוללים:
    שלב 1: מחזור אחד של 30 s שלב denaturation ראשוני ב 95 °C (60 °F).
    שלב 2: 40 מחזורים של 5 s של שלב denaturation ב 98 °C (60 °F).
    שלב 3: מחזור אחד של 30 s של שלב חישול ב 65 °C (נקבע על ידי פריימרים שתוכננו קודם לכן).
    שלב 4: מחזור אחד של דקה אחת של הרחבה באורך מקטע תבנית של 72 °C (~ 1 קילו-בסיס (kb).
    שלב 5: מחזור אחד של הארכה של 2 דקות ב 72 °C (72 °F).
    החזק את התגובה ב 4 °C (65 °F) עד שהוא יכול להיבדק באמצעות אלקטרופורזה ג'ל. פרוטוקול זה ישתנה בהתאם לריגנטים המשמשים (לדוגמה, פולימראז ומאגרים).
  11. חזור על שלב 1.9 כדי להגביר את כל הקטעים שישמשו בתגובת הרכבת DNA הנדרשת לקישור מוצרי PCR ליניאריים לווקטור DNA מעגלי יחיד.
  12. הפעל את מוצרי PCR על ג'ל אגרוז 1% ואחריו טיהור הרצועות של האורך הרצוי.
  13. הכן את התערובת הראשית לתגובת הרכבת DNA (טבלה 1).
    הערה: בדוגמה זו, וקטור האם מחולק לשני קטעים כדי להגביר את היעילות של שלבי ה- PCR מבלי לגרום לשינויים משמעותיים בתוצאת ההרכבה הכוללת.
  14. דגירה של תערובת אב התגובה של הרכבת ה- DNA בתרמוציקלר בטמפרטורה של 50 °C (50 °C ( 15 °C (אלא אם צוין אחרת בפרוטוקול ריאגנט הרכבה DNA) ולאחסן את התגובה ב 4 °C (60 °F) כדי להשתמש במוצר התגובה עבור טרנספורמציה חיידקית.
  15. הגדר טרנספורמציה חיידקית (כימית או אלקטרופורציה) באמצעות תאי E. coli (Escherichia coli) מוסמכים ופרוטוקול טרנספורמציה חיידקית המתאים. לאחר הטרנספורמציה, השתמשו בלוחות אגר לוריא-ברטאני (LB) חיידקיים המכילים את סמן בחירת החיידקים שנבחר (למשל, אמפיצילין) כדי לכסות את תערובת הטרנספורמציה. לדגור על הצלחות ב 37 °C (50 °F) לילה 44.44 ..
  16. בדוק את הצלחות למחרת. כדי לחסן את המושבות, לבחור מושבות בודדות מן הצלחות resuspend אותם במרק LB נוזלי עם סמן הבחירה החיידקי המתאים צינורות תרבות. דגירה בחממה שייקר ב 37 °C (50 °F), 300 סל"ד לילה.
  17. בצע פרוטוקול הכנת פלסמיד כדי לחלץ את ה- DNA הפלסמיד מתרבות החיידקים.
  18. אמת את המעגל בשני שלבים. ראשית, בצעו בדיקת עיכול באמצעות אנזימי הגבלה כאימות גולמי כדי לראות אם מוצר הפלסמיד המשוער הושג. שנית, אם עיכול הבדיקה מועבר / מאושר, שלח את הפלסמיד למתקן ריצוף סנגר (או תהליך באמצעות הציוד הזמין) כדי להשיג את רצף ה- DNA המדויק כדי להשוות אותו מאוחר יותר לרצף הצפוי בתוכנת העיצוב.
    1. כדי לבצע עיכול בדיקה, בחר לפחות שני אנזימי הגבלה המייצרים לפחות שני שברים, בהתבסס על תוכנת השיבוט המולקולרית המשמשת. לאחר בחירת אנזימים, להכין את דגימות הבדיקה על ידי הוספת 1 μL של כל אנזים, 5 μL של ה- DNA שנוצר, ו 13 μL של מים עם מלחים מתאימים חוצצים בהתאם אנזימים המשמשים. לדגור על התגובה ב 37 °C (50 °F) עבור 1 שעות, או כפי שמציע יצרן האנזים. הפעל את מוצרי העיכול הבדיקה על ג'ל 1% agarose ולקבוע אם הרצועות נכונות.
      הערה: אם הרצועות נכונות, המשך לרצף.
    2. כדי לבצע רצף, ליצור פריימרים המבוססים על ה- DNA המאוחסן בתוכנה, כך אזורי חישול של פריימרים הם כ 500 bp (זוגות בסיס) זה מזה ולכסות את שבר העניין (רכיב מעגל גנים) או plasmid המלא. לדלל את הפריימרים עם מים טהורים ללא נוקלאז (NF-H2O) לריכוז של 10 מ"מ. הכן את דגימות הרצף על ידי הוספת 1 μL של 10 ng / μL DNA, 1 μL של פריימר, ו 8 μL של NF-H2O לצינור 0.2 מ"ל. חזור על פעולה זו עבור כל פריימר.
      הערה: כאשר דגימות מוכנות, שחרר אותן במתקן הריצוף והשווה את התוצאות עם רצף פלסמיד באמצעות תוכנת שיבוט מולקולרית.
  19. בשלב זה, ליצור כ 100-1000 ng/μL של דגימת DNA לשילוב פלסמידים המכילים מעגלי גנים לתוך קו התא המתאים.

2. הנדסת קו תא יציבה

  1. הזמינו קו תאי יונקים המיועד לדור מהיר של תת-קווים יציבים המבטיחים ביטוי ברמה גבוהה של חלבון העניין מווקטור ביטוי יונקים. סוג התא וקלות הנדסת קו התא יכולים להשתנות בהתאם למה שהמשתמשים מעדיפים או שואפים להשיג.
    1. לדוגמה, אם משתמשים מעדיפים הנדסת קו תא עם שלבי ביניים מינימליים, הזמן את התאים המכילים אתר אינטגרציה יציב יחיד (לדוגמה, FRT) בלוקוס גנומי פעיל בתמלול. אם עדיפות על הנדסת תאים מגוונת יותר, צור אתרי אינטגרציה במיקומים מועדפים באמצעות כלי הנדסה גנטית כגון CRISPR/Cas9.
  2. לגדל תאים ב 5% CO2 באוויר לח ב 37 °C (55 °F). התאם את תנאי הצמיחה לפי הצורך עבור סוג התא.
  3. העבר את מעגלי הגנים שתוכננו לעיל בתאים הרצויים המתקבלים מהשלבים הקודמים כדי להתחיל בתהליך ייצור יציב של קו תאים. כדי להשיג זאת, השתמש תערובת ליפוזום45 של ה- DNA מעגל הגן עם רקומבינאז מתאים (לדוגמה, Flp-recombinase עבור Recombination Flp-FRT) או באמצעות שיטות אחרות כגון אלקטרופורציה.
  4. יומיים לאחר ההעברה, לפצל את התאים ל 25% מפגש.
  5. שש שעות לאחר פיצול התאים, להתחיל את בחירת האנטיביוטיקה על ידי החלפת התקשורת למדיה טרייה המכילה 50 מיקרוגרומיצין / מ"ל של אנטיביוטיקה hygromycin (או סוכן אנטיביוטי אחר המתאים לגן עמידות לאנטיביוטיקה יונקים שנבחרו במהלך בניית פלסמיד).
    הערה: ישנם מגוון גנים עמידים לאנטיביוטיקה של יונקים המשמשים בבניית מעגלי גנים, שלכל אחד מהם יש עקומת הרג שונה. לכן, לא משנה איזה גן עמידות לאנטיביוטיקה של יונקים נבחר לבניית מעגלים, יש לחקור עקומת הרג נכונה בתאי העניין. שלב זה מבטיח שתאים המכילים את מטען מעגל הגנים מועשרים בעוד תאים ללא המערכת נהרגים.
  6. אפשר לתאים לגדול במדיית בחירת האנטיביוטיקה, לעבור למדיה טרייה כל 2-3 ימים עד הצלחת או הבקבוק יש כמה עשרות מוקדים. מעבר תרבויות חסיד כאשר הם נמצאים בשלב היומן לפני שהם מגיעים למפגש.
  7. ברגע שיש מספיק מוקדים, טריפסינים התאים עם 1 מ"ל של 0.25% טריפסין, 0.1% EDTA בתמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) ללא סידן, מגנזיום, ונתרן ביקרבונט במשך מספר דקות. לנטרל את הטריפסין עם מדיה טרייה ולהעביר את כל התאים לתוך מיכל טרי.
  8. ברגע שהתאים במיכל הטרי הם 80%-100% יחד, להקפיא אותם בתערובת של 45% מדיה ישנה, 45% מדיה טרייה, ו 10% DMSO. העבר את התאים הנותרים לצינור סטרילי ובצע מיון של תאים חד-תאיים כדי לבודד תאים חד שבטיים לצלחת של 96 בארות.
  9. כ 2-3 שבועות לאחר מיון חד שבטי, בארות בתוך צלחת 96-well צריך להיות foci. כאשר כ 50%-60% מפגש, לפצל את התאים לצלחת 12-well.
  10. ברגע שהצלחת של 12 בארות היא 80%-100% מפגש, לפצל לתוך תרבית רקמות מטופל T-25 בקבוקון. ברגע שהתאים בבקבוקון T-25 הם 80%-100% יחד, להקפיא את התאים ולשמור על מעבר לאפיון ובדיקה של קווי תאים חד שבטיים.
    1. לאפיין את קווי התאים המונו-שבטיים על ידי בדיקות מיקרוסקופיה וציטומטריית זרימה כדי לדווח על פרופילי ביטוי גנים המבוססים על ייצור הכתב הפלואורסצנטי המושרה. ודאו את ייצור החלבון הפונקציונלי באמצעות תיוג נוגדנים פלואורסצנטיים ובדיקת אימונופלואורסצנטיות. בדוק את האינדוקציה של ביטוי הגנים ברמת התמלול באמצעות PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR). אמת את הרצף הגנטי ואת דיוק האינטגרציה באמצעות ריצוף גנום מקומי ומלא של השיבוטים.

3. בדיקות אינדוקציה של מנגנון צלחת אור

  1. בנה התקן LPA31,46 שישמש לגיוס אור של תאים מהונדסים. בקצרה, מספר שלבים רחבים חיוניים ליצירת LPA לשימוש לשליטה בביטוי גנים. אלה כוללים הדפסה תלת-ממדית של רכיבי מסגרת LPA, בניית מעגלים, תכנות המעגל באמצעות מתכנת מיקרו-בקר, הרכבת הרכיבים ל- LPA סופי, תכנות כרטיס הזיכרון באמצעות תוכנת IRIS וכיול ההתקן המוגמר. לקבלת הסבר מעמיק יותר, עיין בהפניות לעיל.
    1. הדפס את החלקים התלת-ממדיים כמפורט ב-Gerhardt ואח' (2016 ו-2019)31,46.
    2. להרכיב את המעגל כפי שמתואר גרהרדט ואח ' (2016 ו 2019)31,46.
    3. הוסף את הקושחה למעגל LPA המורכב באמצעות מתכנת מיקרו-בקר כפי שמתואר ב- Gerhardt et al. (2016 ו-2019)31,46.
    4. שלבו חלקים מודפסים בתלת-ממד ואת לוח המעגלים המורכב כמפורט ב-Gerhardt et al. (2016 ו-2019)31,46. זה כולל לקיחת לוח ההרכבה, לוח המעגלים, מרווח LED (דיודות פולטות אור), מתאם הלוחות, צלחת של 24 בארות, מכסה צלחת, ברגי הרכבה ואגוזי כנף ורכיבי ערימה כפי שמוצג בסרטון המצולם ובאיור 2.
    5. עבור תכנות וכיול של כרטיס זיכרון של ההתקן, בצע את השלבים המתוארים להלן.
  2. השתמש בתוכנת IRIS הזמינה באתר מעבדת תבור47 כדי לתכנת כרטיס SD עבור מנגנון צלחת האור (LPA)31 ולחקור את תנאי האור המתאימים הדרושים כדי להתחיל בניסוי אופטוגנטי.
    הערה: תוכנת IRIS היא יישום מבוסס אינטרנט לתכנות החומרה האלקטרונית האופטוגנטית, המכונה LPA, שפותחה על ידי מעבדת תבור. התוכנה מאפשרת תכנות של ערכי IRIS יחסיים השולטים בדיודות פולטות האור הבודדות (נורות LED) בכל באר של חומרת LPA.
  3. בחר באפשרות הנפתחת LPA (4 x 6), ולאחר מכן לחץ על גישת התאורה המתאימה (מצב יציב, דינמי, מתקדם).
    הערה: עבור כתב יד זה, כל הבדיקות יתמקדו בדוגמאות של מדינה יציבה. עם זאת, ניתן להשתמש בדוגמאות ההגדרה המתקדמות עבור משכי דופק ומשטרי מחזור עבודה.
  4. בחר אם נורות ה-LED העליונות או התחתונות יאירו על-ידי הזנת ערכים בתאים המתאימים לבארות הלוח. עבור LPAs בשימוש בעבודה זו, נוריות כחולות להציב במיקום העליון שימשו בכל הניסויים. כל נורית LED, לאחר שתתוכנתה, יכולה לספק חשיפה רציפה לאור בעוצמה קבועה של אור. תוכנת IRIS מאפשרת רמות עוצמה של 4096 שניתן לתכנת.
  5. לאחר בחירת מיקומי ה- LED, הזן ערכי עוצמה עבור קווי המתאר הניסיוניים הרצויים. לדוגמה, הזן 8 עוצמות אור שונות (או משכי דופק או מחזורי עבודה) עם שלושה שכפולים טכניים לכל צלחת (טבלה 2). G.s. מתייחס ליחידות בגווני אפור - ערכי מדידת רמת עוצמת האור המשמשים לתכנות LPA בתוכנת IRIS.
    1. בעת עיצוב קבצים ניסיוניים של IRIS, יש לזכור השפעות קצה מבארות סמוכות במכשיר LPA, רעילות אור מעוצמות הולכות וגדלות של חשיפה לאור כחול, וקביעת סוג תגובת המינון הרצויה (למשל, מונוטונית לעומת לא מונוטונית).
    2. אם משתמשים מתכנתים תאים ב- LPA בסדר עולה/יורד של פרמטר אור מסוים (לדוגמה, עוצמה), בארות עשויות ליצור השפעות קצה של דיבור צולב אור או אפילו חום שיכול להשפיע על בארות סמוכות. זה יכול להשפיע בשוגג על התוצאה של תפוקות נמדדות כאשר הניסויים הושלמו. כדי להקל על כך, משתמשים יכולים ליישם מטריצת אקראיזציה בתוכנת IRIS כדי לטרוף מיקומים טובים, תוך מזעור אפקטי קצה. דוגמה מתוארת בתוצאות הייצוגיות שלהלן (איור 4A-B).
    3. בנוסף, נמצאו עוצמות גבוהות יותר של אור כחול כמפריעות לצמיחה התאית וליכולת הקיום48. לכן, כדי למתן את רעילות האור, חשוב לייצר עוצמת אור, משך הדופק, או עקומת תגובה מחזור החובה בהתאם למודל הנחקר.
      1. לדוגמה, תוכנית 8 ערכי עוצמת אור עם שלושה עותקים משוכפלים לכל צלחת 24-well, עם טווח מ ללא אור לעוצמה מקסימלית של LPA. לאחר מכן, הפעל דגימות אלה על cytometer זרימה עם שער SSC-FSC או כתם חי כגון יודיד propidium כדי לכמת את הישרדות תאי האוכלוסייה (תאים חיים לעומת סך האירועים כולל תאים מתים / פסולת תאית) בכל ערך אור.
      2. לאחר מכן, לקבוע את הכמות האידיאלית של הישרדות האוכלוסייה עבור ההתקנה הניסיונית, שכן כל גירוי עלול להשפיע לרעה על התפשטות, ביטוי גנים, או הישרדות (למשל, הגדרת 80% הישרדות תאים כהחלפה מתאימה). לדוגמה, בעבודה זו, לאחר כיול, העוצמה לא עלתה על 3000 g.s. יחידות (~ 3/4 העוצמה המרבית של התקן LPA). דוגמה לכך מתוארת בתוצאות הייצוגיות שלהלן.
    4. בנוסף להגבלת ערכי האור בגלל רעילות, משתמשים עשויים לרצות להגביל את ערכי האור כדי לאפיין חלק מסוים של תגובת המינון, כגון טווח התגובה המונוטונית.
      1. כדי להשיג זאת, בתחילה לסרוק מגוון רחב של עוצמות אור, משכי דופק או מחזורי חובה בהתאם למודאליות המנותחת בעת קביעת תגובת המינון הרצויה (טבלה 2) כדי לצמצם על משטר האור של עניין, למשל, שבו ביטוי גנים בקורלציה חיובית עם הגדלת ערכי האור עבור מינון-תגובה מונוטונית.
      2. כדי לקבוע את טווח האור של עניין, תוכנית LPA יחיד עם עד 24 בארות של עוצמה שונה / משך דופק / מחזור החובה / וכו 'או יותר בארות (למשל, 48, 72, 96, וכו ') בהתאם אם LPAs מרובים מכוילים כדי לספק כמויות אור שוות ערך ולהמשיך עם העבודה תרבית התא או בדיקות המפורטות להלן. לכן, התחל אפיון של מערכת אופטוגנטית עם מגוון רחב של גירויים קלים כדי לקבוע את מרווח הטווח שנותן את ביטוי הגנים הרצוי ולאחר מכן לבצע ניסויים בטווח המינון המעודן.
      3. לדוגמה, בעבודה זו, פעם 3000 g.s. יחידות נקבעו כסף לעוצמת אור רעיל; סף זה שימש כגבול העליון של האור עבור בדיקות המתוארות להלן (למשל, אימונופלואורסצנטיות).
        הערה: השלבים לעיל אינם תלויים בכיול האופטי של ה- LPA ומתייחסים לכיול ברמה המולקולרית עבור כל מערכת אופטוגנטית.
  6. לאחר שערכי עוצמת האור המתאימים מתוכנתים במערכת IRIS, הכנס כרטיס זיכרון עם שקע USB 3.0 ל- LPA כדי להוריד ולהעביר את הקבצים.
  7. אם הכיול של LPA הושלם31, המשך לעבודת תרבית התאים עבור ייזום של בדיקת אינדוקציה אור. אם הכיול לא נעשה, כייל את ה- LPA באמצעות שיטת ניתוח תמונה (שלבים 3.7.1-3.7.3) לאחר שה- LPA מתוכנת עם מתכנת המיקרו-בקר.
    1. לתכנת בקצרה את LPA יש את אותה רמת IRIS כפי שתואר על ידי גרהרדט ואח ' (2016)31.
      הערה: לכיול, ה- LPA תוכנת להיות בעל ערך של 2000 גרם.
    2. לאחר שההתקן מתוכנת באמצעות כרטיס הזיכרון ולחצן האיפוס (לחצן פיזי ב- LPA) נלחץ, השג תמונה של ההתקן כולו (לדוגמה, imager תחנת ג'ל, התקן סורק וכו '). לכיול, רכשו שתי תמונות כשההתקן יסתובב ב-180°.
    3. לאחר מכן, השתמש בתוכנת קוד פתוח שתוכננה על ידי גרהרדט ואח ' (2016)31 כדי להראות את השונות בעוצמת ה- LED בלוח LPA ולחשב את ערכי פיצוי ה- LED כדי להפוך את העוצמה לשוויונית בין בארות. דוגמה לכך מתוארת בתוצאות המיוצגות להלן (איור 3). לאחר כיול זה הושלם, להמשיך לעבודת תרבית התאים לייזום של בדיקת אינדוקציה אור.
  8. להשיג צלוחיות של תאים חד שבטיים מהונדסים מהסעיף הקודם כדי לחקור השפעות אור אינדוקציה על ביטוי גנים.
  9. הסר את המדיה הישנה מהבקבוקון.
  10. מוסיפים 1 מ"ל של טריפסין לתאים ודגורים במשך 5 דקות.
  11. לאחר 5 דקות, לנטרל טריפסין על ידי הוספת 4 מ"ל של מדיום הנשר שונה Dulbecco (DMEM או מדיה רצויה אחרת) בתוספת הכימיקלים הדרושים (עבודה זו השתמשה 50 מיקרוגרם / מ"ל של hygromycin, 1% פתרון פניצילין / סטרפטומיצין, 10% סרום בקר עוברי, FBS).
  12. הוסף ~ 75,000 תאים לבאר בלוח שחור של 24 באר בנפח כולל של 500 μL. מספר התאים שנזרעו עשוי להשתנות בהתאם למשך הניסוי הרצוי ולסוג התא בו נעשה שימוש.
    הערה: בנוסף, שים לב כי צפיפות זריעת התאים משפיעה על תחזוקת התרבות ועל משך הניסוי. החל ממספר נמוך יותר של תאים לבאר מבטיח משכי זמן ארוכים יותר לפני שהתרבית מגיעה למפגש. יתר על כן, סוג הרכיבים האופטוגנטיים המשולבים במעגלי הגנים מעניינים ישפיע כאשר ביטוי הגנים יגיע למצב יציב ולכן ישפיע על משך הניסויים. גורמים אחרים שעשויים להיחשב הם שיעורי גדילה ספציפיים לקו התאים, הרכב המדיה, ואפקטי גדילה מותנים (כלומר, אור).
  13. לאחר הציפוי, מניחים את התאים באינקובטור לח עם 5% CO2 כדי לאפשר להם להסתפק 2-6 שעות.
  14. לאחר הדגירה, העבירו את התאים למכסה המנוע של תרבית הרקמות, הסירו את מכסה הפלסטיק והוסיפו רצועת רדיד דבק לחלק העליון של הצלחת (איור 2D). שלב זה מאפשר העברת אור מינימלית בין בארות, שכן החלק העליון והצדדים של הבארות מצופים, והאור יכול כעת להיכנס רק מתחתית הבאר שבה ה- LED ממוקם.
  15. מניחים את הצלחת בחלקים התלת-ממדיים המותאמים של ה- LPA. לאחר מכן, כסו את הצלחת במכסה LPA המודפס בתלת-ממד, שמתאים מעל ברגי ההתקן בכל פינה.
  16. חבר את ההתקן למקור המתח ולחץ על לחצן האיפוס בהתקן LPA כדי להבטיח שהגדרות הניסוי המעודכנות של LPA יוחלו.
  17. דגירה התאים בתוך המערכת הניסיונית למשך פרק זמן מתאים, בהתאם לצפיפות הזריעה המקורית, מהירות הצמיחה הספציפית לקו התאים ותנאי הצמיחה. בדוגמה זו, קווי התא הושרו במשך 3 ימים ברציפות לביטוי גנים כדי להגיע למצב יציב. עם זאת, יש לציין כי מערכות אופטוגנטיות רבות (למשל, VVD) עשויות להגיע לביטוי גנים במצב יציב הרבה יותר מוקדם (למשל, 24 שעות), ולכן זמני אינדוקציה ניסיוניים יכולים להיות מופחתים או ממושכים לפי הצורך.
  18. בסוף ניסוי אינדוקציה אור, לנצל את הדגימות עבור כל אחד מארבע בדיקות הבאות כדי לאפיין את קווי התא מהונדסים (סעיפים 4-7).

4. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאים מהונדסים הנגרמים על ידי אור

  1. 24-72 שעות לאחר אינדוקציה, להסיר את התאים LPA מן האינקובטור ומניחים אותם במכסה המנוע תרבית רקמות.
  2. מוציאים את רצועת נייר הכסף ומניחים לצלחת לשבת 1-2 דקות. זה מונע עיבוי מלהיווצר על מכסה הפלסטיק, אם הניח מיד על הצלחת.
  3. לאחר 1-2 דקות של ישיבה, לשים את מכסה הפלסטיק המקורי בחזרה על הצלחת.
  4. דמיינו את התאים עם ניגוד הפאזה המתאים או מיקרוסקופ פלואורסצנטיות.
  5. בהתאם למכשיר, התאם את זמן החשיפה, את עוצמת מקור האור ואת הרווח להצגת תאים מהונדסים. בניסוי זה הוחלו הפרמטרים הבאים: 50 מילישניות עבור FITC/ GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) זמן חשיפה למקור אור ו-1-5 מילישניות לזמן חשיפה לניגודיות פאזה בעוצמה של 100% עבור כל אחד מהם.
    הערה: יש לציין כי זמני חשיפה אופטימליים, רמות הגבר ועוצמות מקור אור נגזרים לעתים קרובות אמפירית מניסיון עבודה זו כדי למזער את רוויית היתר בכתב הפלואורסצנטיות, למזער את הנזק התאי ולתפוס תמונות נאותות לניתוח איכותי וכמותי. בעת קביעת הרמות של כל אחד מפרמטרים אלה, ההיבטים שיש לזכור כוללים מקסום יחסי אות לרעש, מזעור פוטוטוקסיות, מזעור רוויית יתר של אותות פלואורסצנטיים, והגברת היכולת להגביר אותות פלואורסצנטיים חלשים.
    1. מטב פרמטרים אלה אד-הוק ברוטו; עם זאת, ערכים ניסיוניים קודמים (למשל, עוצמת מקור אור הגורמת להבשלת יתר של כתב פלואורסצנטי) יכולים להנחות הגדרות ניסיוניות עתידיות כאשר הדבר רלוונטי. לדוגמה, הגדרות הרווח, זמני החשיפה והערכים ההתחלתיים של עוצמת האור ממעגל אחד (LITer1.0) או ההתקנה הניסיונית (לדוגמה, עוצמת האור) יכולים לשמש כנקודת התחלה בעת מעבר למעגל גנים דומה אך שונה (LITer2.0)11 או מודאליות אור שונה (לדוגמה, מחזור חובה של אור).
  6. ייעל את הדמיית הלוחות על ידי תבנית קואורדינטות המתוכנתת לתוכנת המיקרוסקופיה ומאפשרת לכל גודל הלוח (למשל, 24 בארות) לקבל רכישת תמונה אוטומטית ממיקומי תמונה מרובים לבאר.

5. ציטומטריית זרימה של תאים מהונדסים הנגרמים על ידי אור

  1. 24-72 שעות לאחר אינדוקציה, להסיר את התאים מן LPA באינקובטור או מן המיקרוסקופ לאחר הדמיה ומניחים אותם במכסה המנוע תרבית הרקמות.
  2. אם הוסר ישירות מן LPA, להסיר את רצועת נייר כסף, ולתת את הצלחת לשבת במשך דקה או שתיים.
  3. שאפו את המדיה מכל באר (של כל צלחת 24-well אם כל הבארות משמשות).
  4. מוסיפים 100 μL של 0.25% טריפסין לכל באר, לכסות את הצלחת במכסה פלסטיק, ולהניח אותו בחזרה באינקובטור.
  5. השאר את התאים ללא הפרעה באינקובטור במשך 5 דקות.
  6. לאחר 5 דקות, להסיר את הצלחת ולהחזיר אותו למכסה המנוע תרבית הרקמה.
  7. לנטרל כל טריפסין היטב עם 400 μL של DMEM.
  8. תווית צינור 5 מ"ל פוליסטירן עגול התחתון עם מסננת התא (או צינור cytometry זרימה מתאים שניתן לסנן כדי להסיר גושים גדולים של תאים לא טריפסין מלא) עם שם המתאים לכל באר.
  9. השתמש פיפטה P1000 כדי pipette התוכן של כל באר למעלה ולמטה 6-8 פעמים כדי לשבור גושי תאים וליצור דגימות חד-תאיות עבור cytometry זרימה49.
  10. העבר את כל התוכן של כל באר (~ 500 μL) לצינורות המסומנים עם המסננת.
  11. להביא תאים למכשיר ציטומטריית הזרימה המתאים עם לייזרים של אורכי הגל הנכונים (יכול להביא צינורות עם תאים על קרח או מחוצה לו).
    הערה: ציטומטר הזרימה ששימש בעבודה זו היה חלק ממתקן ליבה הממוקם בבית החולים האוניברסיטאי.
  12. צור שער פיזור קדמי וצדדי (FSC ו- SSC, בהתאמה) כדי ללכוד את התאים הבודדים בגודל ובגרגירים המתאימים כדי לא לכלול פסולת וגושים תאיים בתוכנת הציטומיה של הזרימה.
  13. ברגע שהשער מוגדר, ללכוד כ -10,000 תאים עם השער המתאים. התאם מספר זה בהתאם לכמות הנתונים הסלולריים שהמשתמשים מחפשים. חזור על הפעולה עבור כל צינור המכיל את התאים מהניסוי.
  14. לאחר השלמת הניסוי, יבא את הנתונים לתוכנת נתוני cytometry הזרימה הזמינה לניתוח.
  15. צור שער FSC-SSC (כמו קודם במהלך הרכישה) והחל אותו על כל אצווה של נתונים ניסיוניים. באר התייחסות של אוכלוסיית התאים שלא הושרה משמשת ליצירת שער זה בכתב יד זה, אך קיימים מדדים אחרים ליצירת שערים, כגון שערים מבוססי צפיפות.
  16. עם התנאים הניסיוניים מגודרים בשער FSC-SSC, להתוות את נתוני cytometry הזרימה כהיסטוגרמה או לייצג בדרכים אחרות כדי להמחיש את דפוסי הביטוי המתקבלים. בניסוי זה, הפלואורסצנטיות נלכדה על ידי ערוצי GFP / FITC או PE / TexasRed.

6. הפקת RNA ו- PCR כמותי של רכיבי מעגל גנים

  1. 24-72 שעות לאחר אינדוקציה, להסיר את התאים מן LPA באינקובטור או מן המיקרוסקופ לאחר הדמיה ומניחים אותם במכסה המנוע תרבית הרקמות.
  2. אם הוסר ישירות מן LPA, להסיר את רצועת רדיד, ולתת את הצלחת לשבת במשך דקה או שתיים.
  3. שאפו את המדיה מכל באר (של כל צלחת 24-well אם כל הבארות משמשות).
  4. המשך לחלץ RNA מהתאים באמצעות ערכת החילוץ המתאימה RNA.
  5. לאחר השלמת הפקת ה- RNA, בצע תגובת שעתוק הפוכה של כל דגימה (טבלה 3).
  6. כמו כן, בצע PCR כמותי של כל דגימה (טבלה 4). השתמש בפולימראז DNA ובפרוטוקול המשויך כדי להגדיר תגובות PCR. עבור שלב זה, להגדיר תגובה מרובת עם גן משק בית גן של עניין, או ליצור תגובות נפרדות. בדוגמה זו, GFP, KRAS, ו גליצרלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH) רמות נחקרו. לאחר השלמת ניסוי qRT-PCR, המשך בניתוח באמצעות תוכנה זמינה כדי להמחיש שינוי קיפול מעגל גנים ברמת ה- RNA.

7. אימונופלואורסצנטיות של רכיבי מעגל הגנים

  1. השתמש באמבט קרח או במקפיא כדי לקרר מתנול.
  2. 24-72 שעות לאחר אינדוקציה, להסיר את התאים מן LPA באינקובטור או מן המיקרוסקופ לאחר הדמיה ומניחים אותם במכסה המנוע תרבית הרקמות.
  3. אם הוסר ישירות מן LPA, להסיר את רצועת רדיד, ולתת את הצלחת לשבת במשך 1-2 דקות.
  4. שאפו את המדיה מכל באר (של כל צלחת 24-well אם כל הבארות משמשות).
  5. מוסיפים 100 μL של 0.25% טריפסין לכל באר, לכסות את הצלחת במכסה פלסטיק, ולהניח אותו בחזרה באינקובטור.
  6. השאר את התאים ללא הפרעה באינקובטור במשך 5 דקות.
  7. לאחר 5 דקות, להסיר את הצלחת ולהחזיר אותו למכסה המנוע תרבית הרקמה.
  8. לנטרל כל טריפסין היטב עם 400 μL של DMEM.
  9. תווית צינורות מיני צנטריפוגה עם שמות המתאימים לכל באר.
  10. השתמשו בפיפטה P1000 ופיפטה את התוכן של כל באר למעלה ולמטה 6-8 פעמים כדי לשבור את גושי התאים.
  11. העבר את כל התוכן של כל באר (~ 500 μL) לצינורות המסומנים.
  12. צנטריפוגה התאים במשך 5 דקות ב 400 x g.
  13. כאשר הושלם, להשליך את supernatant ולהעביר את הדגימות למכסה המנוע אדים כימיים.
  14. Resuspend התאים (להשתמש P1000 פיפטה ופיפטה למעלה ולמטה 6-8 פעמים בכל צינור לשבור גושי תאים) ב 750-1000 μL של 4% paraformaldehyde (מדולל מלוחים חוצצי פוספט, PBS).
  15. אפשר לתאים לשבת במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  16. לאחר הדגירה, להוסיף 750-1000 μL של PBS. פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים.
  17. צנטריפוגה התאים במשך 5 דקות ב 400 x g.
  18. כאשר הושלם, להשליך את supernatant ולהעביר את הדגימות למכסה המנוע אדים כימיים.
  19. Resuspend התאים (להשתמש P1000 פיפטה ופיפטה למעלה ולמטה 6-8 פעמים בכל צינור לשבור גושי תאים) ב 750-1000 μL של מתנול קר כקרח.
  20. אפשר לתאים לשבת במשך 30 דקות על קרח או במקפיא של -20 °C (60 °F).
  21. לאחר הדגירה, להוסיף 750-1000 μL של PBS. פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים.
  22. צנטריפוגה התאים במשך 5 דקות ב 400 x g.
  23. כאשר הושלם, להשליך את supernatant ולהעביר את הדגימות למכסה המנוע אדים כימיים.
  24. בהתאם לסוג הנוגדנים המשמשים, שנה את הפרוטוקול מנקודה זו ואילך. בצע את אחד השלבים 7.24.1-7.24.14 או 7.24.15-7.24.22.
    1. אם משתמשים בנוגדן ראשוני ומשני, סובבו מחדש את התאים באמצעות פיפטה P1000/P200 ופיפטה למעלה ולמטה 6-8 פעמים בכל צינור כדי לשבור גושי תאים ב 100 μL של נוגדן ראשוני. במקרה זה, דילול של 1:800 עבור נוגדני מלאי נעשה, כולל נוגדן KRAS או נוגדן ERK, והורשה לשבת במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר. נוגדנים היו מדוללים במאגר דגירה עשוי 1x PBS עם 0.5 גרם של BSA.
      הערה: לקבוע את הדילול המדויק של הנוגדן אמפירית על ידי יצירת עקומה סטנדרטית של דילול נוגדנים לעומת האנטיגן של עניין.
    2. לאחר הוספת נוגדנים, לכסות את הצינורות בנייר כסף כדי למנוע השפעות אור על נוגדנים מסומנים.
    3. לאחר הדגירה, להוסיף 750-1000 μL של מאגר הדגירה. פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים.
    4. צנטריפוגה התאים במשך 5 דקות ב 400 x g.
    5. כאשר הושלם, להשליך את supernatant ולהעביר את הדגימות למכסה המנוע אדים כימיים.
    6. resuspend התאים באמצעות P1000/P200 פיפטה ופיפטה למעלה ולמטה 6-8 פעמים בכל צינור כדי לשבור גושי תאים ב 100 μL של נוגדן משני. במקרה זה, תאים היו resuspended ב 100 μL נוגדן משני בדילול של 1:800 עבור נוגדן KRAS או 1:2000 עבור נוגדן ERK מותר לשבת במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בדומה לנוגדנים ראשוניים, לדלל את הנוגדנים המשניים במאגר הדגירה כמתואר לעיל. לקבוע את הדילול של הנוגדנים המשניים בהתבסס על הממצאים האמפיריים של עקומה סטנדרטית.
    7. לאחר הוספת נוגדנים, לכסות את הצינורות בנייר כסף כדי למנוע השפעות אור על הנוגדנים המסומנים.
    8. לאחר הדגירה, להוסיף 750-1000 μL של מאגר הדגירה. פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים.
    9. צנטריפוגה התאים במשך 5 דקות ב 400 x g.
    10. כאשר הושלם, להשליך את supernatant ולהעביר את הדגימות למכסה המנוע אדים כימיים.
    11. resuspend התאים באמצעות P1000 פיפטה ופיפטה למעלה ולמטה 6-8 פעמים בכל צינור לשבור גושי תאים ב 500 μL של PBS.
    12. העבר את כל התוכן של כל צינור (~ 500 μL) לצינורות המסומנים עם מסננות.
    13. להביא את התאים למכשירי ציטומטריה זרימה מתאימים עם לייזרים של אורכי הגל הנכונים (יכול להביא צינורות עם תאים על קרח או מחוצה לו).
      הערה: יש לציין כי בעל מספר פקדים חשובים להתקדמות עם מדידה וציטומיטריית זרימה וניתוח של ביטוי גנים תאים מהונדס. לדוגמה, לאחר תאים שאינם מוכתמים לחלוטין, תאים מוכתמים בנוגדנים ראשוניים בלבד, ותאים מוכתמים בנוגדנים משניים בלבד יכולים להיות שימושיים להשוואת תוצאות עם אותות רקע של נוגדנים.
    14. לאחר מכן, המשך בניתוח כמתואר בסעיף 5.
    15. אם משתמשים בנוגדן ראשי בלבד, תוסיפו מחדש את התאים באמצעות פיפטה P1000/P200 ופיפטה למעלה ולמטה 6-8 פעמים בכל צינור כדי לשבור גושי תאים ב 100 μL של נוגדן ראשי שכותרתו. קבעו דילול נוגדנים מתאים ודגרו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. קבעו את דילול הנוגדנים מהעיקול הסטנדרטי בצורה אמפירית.
    16. לאחר הוספת נוגדנים, לכסות את הצינורות בנייר כסף כדי למנוע השפעות אור על נוגדנים מסומנים.
    17. לאחר הדגירה, להוסיף 750-1000 μL של מאגר הדגירה. פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים.
    18. צנטריפוגה התאים במשך 5 דקות ב 400 x g.
    19. resuspend התאים באמצעות P1000 פיפטה ופיפטה למעלה ולמטה 6-8 פעמים בכל צינור לשבור גושי תאים ב 500 μL של PBS.
    20. העבר את כל התוכן של כל צינור (~ 500 μL) לצינורות מסומנים עם מסננות.
    21. להביא את התאים למכשירי ציטומטריה זרימה מתאימים עם לייזרים של אורכי הגל הנכונים (יכול להביא צינורות עם תאים על קרח או מחוצה לו).
      הערה: יש לציין כי בעל מספר פקדים חשובים להתקדמות עם מדידה וציטומיטריית זרימה וניתוח של ביטוי גנים תאים מהונדס. תאים ותאים שאינם מוכתמים לחלוטין בנוגדנים ראשוניים בלבד שימושיים להשוואת תוצאות עם אותות רקע של נוגדנים.
    22. מנקודה זו, המשך עם הניתוח כמתואר בסעיף 5.

תוצאות

הרכבת מעגלי גנים ויצירת קו תאים יציב במאמר זה התבססו על תאי HEK-293 מסחריים שעברו שינוי המכילים אתר FRT פעיל בתמלול ויציב יחיד (איור 1). מעגלי הגנים נבנו לתוך וקטורים שהיו להם אתרי FRT בתוך הפלסמיד, המאפשרים את שילוב Flp-FRT בגנום התא HEK-293. גישה זו אינה מוגבלת לתאי Flp-In, שכן ניתן להוסיף א...

Discussion

קוראי מאמר זה יכולים לקבל תובנה על השלבים החיוניים לאפיון מעגלי גנים אופטוגנטיים (כמו גם מערכות ביטוי גנים אחרות), כולל 1) תכנון מעגלי גנים, בנייה ואימות; 2) הנדסת תאים להכנסת מעגלי גנים לקווי תאים יציבים (למשל, רקומבינציה Flp-FRT); 3) אינדוקציה של התאים המהונדסים עם פלטפורמה מבוססת אור כגון LPA; 4) א...

Disclosures

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

ברצוננו להודות למעבדת Balázsi על הערות והצעות, ד"ר קרל פ גרהרדט וד"ר ג'פרי ג 'תבור על שעזרו לנו לבנות את LPA הראשון, וד"ר וילפריד וובר על שיתוף LOV2-degron plasmids. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות [R35 GM122561 ו- T32 GM0084444]; מרכז לאופר לביולוגיה פיזית וכמותית; ומלגת מדע והנדסה של הביטחון הלאומי (NDSEG). מימון לדמי גישה פתוחה: NIH [R35 GM122561].

תרומות מחבר: M.T.G. ו- G.B. הגה את הפרויקט. M.T.G., D.C., ו L.G., ביצע את הניסויים. M.T.G., D.C., L.G., ו- G.B ניתחו את הנתונים והכינו את כתב היד. ג.B ו-אם.טי.ג'י פיקחו על הפרויקט.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 mL PCR tubesEppendorf951010006reagent for carrying out PCR
0.25% Trypsin EDTA 1XThermo Fisher ScientificMT25053CIreagent for splitting & harvesting mammalian cells
0.5-10 μL Adjustable Volume PipetteEppendorf3123000020tool used for pipetting reactions
100-1000 μL Adjustable Volume PipetteEppendorf3123000039tool used for pipetting reactions
20-200 μL Adjustable Volume PipetteEppendorf3123000055tool used for pipetting reactions
2-20 μL Adjustable Volume PipetteEppendorf3123000039tool used for pipetting reactions
5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer CapCorning352235reagent for flow cytometry
5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 VEppendorf22628113equipment for mammalian culture work
AgaroseDenville ScientificGR140-500reagent for gel electrophoresis
Aluminum Foils for 96-well PlatesVWR®60941-126tool used for covering plates in light-induction experiments
AmpicillinSigma AldrichA9518-5Greagent for selecting bacteria with correct plasmid
Analog vortex mixerThermo Fisher Scientific02215365PRtool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
Bacto Dehydrated AgarFisher ScientificDF0140010reagent for growing bacteria
BD LSRAriaBD656700tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations
BD LSRFortessaBD649225tool for characterizing engineered cell lines
BSA, Bovine Serum AlbumineGovernment Scientific SourceSIGA4919-1Greagent for IF incubation buffer
Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TCCorning353043plate used for growing monoclonal cells
CentrifugeVWR22628113instrument for mammalian cell culture
Chemical fume hoodN/AN/Ainstrument for carrying out IF reactions
Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lidBD353047plate used for growing monoclonal cells
CytoOne T25 filter cap TC flaskUSA ScientificCC7682-4825container for growing mammalian cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fischer ScientificBP231-100reagent used for freezing down engineered mammalian cells
Ethidium BromideThermo Fisher Scientific15-585-011reagent for gel electrophoresis
Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with LidCorning353072container for growing sorted monoclonal cells
FCS ExpressDe Novo Software:N/Asoftware for characterizing flow cytometry data
Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mLCorning35-010-CVreagent for growing mammalian cells
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mmFisher ScientificFB0875712equipment for growing bacteria
Gibco DMEM, High GlucoseThermo Fisher Scientific11-965-092reagent for growing mammalian cells
Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression AssayLife Technologies4331182qPCR Probe
Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mLLife Technologies10687-010reagent for selecting cells with proper gene circuit integration
iScript Reverse Transcription SupermixBio-Rad Laboratories1708890reagent for converting RNA to cDNA
Laboratory Freezer -20 °CVWR76210-392equipment for storing experimental reagents
Laboratory Freezer -80 °CPanasonicMDF-U74VCequipment for storing experimental reagents
Laboratory Refrigerator +4 °CVWR76359-220equipment for storing experimental reagents
LB Broth (Lennox) , 1 kgSigma-AldrichL3022-250Greagent for growing bacteria
LIPOFECTAMINE 3000Life TechnologiesL3000008reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells
MATLAB 2019MathWorksN/Asoftware for analyzing experimental data
MethanolAcros Organics413775000reagent for immunofluorescence reaction
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mLVWR20170-333plasticware container
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression AssayLife Technologies4331182qPCR Probe
MultiTherm ShakerBenchmark ScientificH5000-HCequipment for bacterial transformation
NanoDrop Lite SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND-NDL-US-CANequipment for DNA/RNA concentration measurement
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master MixNEBM0492Sreagent for PCR of gene circuit fragments
NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency)New England Biolabs (NEB)C3019Hbacterial cells for amplifying gene circuit of interest
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNew England Biolabs (NEB)E2621Lreagent for combining gene circuit fragements
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 cameraNikon Instruments Inc.N/Ainstrument for quantifying gene expression
NIS-ElementsNikon Instruments Inc.N/Asoftware for characterizing fluorescence microscopy data
oligonucleotidesIDTN/Areagent used for PCR of gene circuit components
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 ControlPanasonicMCO-170AICUVHL-PAinstrument for growing mammalian cells
Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy GradeElectron Microscopy Sciences15710-Sreagent
PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x)Invitrogen14190144reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100xFisher Scientific15140-122reagent for growing mammalian cells
primary ERK antibodyCell Signaling Technology4370Sprimary ERK antibody for immunifluorescence
primary KRAS antibodySigma-AldrichWH0003845M1primary KRAS antibody for immunifluorescence
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)Qiagen27106reagent kit for purifying gene circuit plasmids
QIAquick Gel Extraction Kit (50)Qiagen28704reagent kit for purifying gene circuit fragments
QuantStudio 3 Real-Time PCR SystemEppendorfA28137equipment for qRT-PCR
Relative Quantification AppThermo Fisher ScientificN/Asoftware for quantifying RNA/cDNA amplificaiton
RNeasy Plus Mini KitQiagen74134kit for extracting RNA of engineered mammalian cells
Secondary ERK antibodyCell Signaling Technology8889Ssecondary ERK antibody for immunifluorescence
secondary KRAS antibodyInvitrogenA11005secondary KRAS antibody for immunifluorescence
Serological Pipets 5.0 mLOlympus Plastics12-102reagents used for setting up a variety of chemical reactions
SmartView Pro Imager SystemMajor ScienceUVCI-1200tool for imaging correct PCR bands
SnapGene Viewer (free) or SnapGeneSnapGeneN/Asoftware DNA sequence design and analysis
Stage top incubatorTokai HitINU-TIZtool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444557reagent for PCR of gene circuit fragments
TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxnLife Technologies4326317EqPCR Probe
ThermocyclerBio-Rad1851148tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture TreatedPerkinElmer1450-605plate used for light-induction experiments
VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cmVWR14673-010reagent for mammalian cell culture
VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel SystemVWR89032-290equipment for DNA gel electrophoresis
Flp-In 293Thermo Fisher ScientificR75007Engineered cell line with FRT site

References

  1. Sedlmayer, F., Hell, D., Muller, M., Auslander, D., Fussenegger, M. Designer cells programming quorum-sensing interference with microbes. Nature Communications. 9 (1), 1822 (2018).
  2. Cho, J. H., Collins, J. J., Wong, W. W. Universal chimeric antigen receptors for multiplexed and logical control of T cell responses. Cell. 173 (6), 1426-1438 (2018).
  3. Saxena, P., et al. A programmable synthetic lineage-control network that differentiates human IPSCs into glucose-sensitive insulin-secreting beta-like cells. Nature Communications. 7, 11247 (2016).
  4. Nevozhay, D., Zal, T., Balazsi, G. Transferring a synthetic gene circuit from yeast to mammalian cells. Nature Communications. 4, 1451 (2013).
  5. Chang, H. H., Hemberg, M., Barahona, M., Ingber, D. E., Huang, S. Transcriptome-wide noise controls lineage choice in mammalian progenitor cells. Nature. 453 (7194), 544-547 (2008).
  6. Balazsi, G., van Oudenaarden, A., Collins, J. J. Cellular decision making and biological noise: from microbes to mammals. Cell. 144 (6), 910-925 (2011).
  7. Lee, J., et al. Network of mutually repressive metastasis regulators can promote cell heterogeneity and metastatic transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 364-373 (2014).
  8. Dar, R. D., Hosmane, N. N., Arkin, M. R., Siliciano, R. F., Weinberger, L. S. Screening for noise in gene expression identifies drug synergies. Science. 344 (6190), 1392-1396 (2014).
  9. Becskei, A., Seraphin, B., Serrano, L. Positive feedback in eukaryotic gene networks: cell differentiation by graded to binary response conversion. EMBO Journal. 20 (10), 2528-2535 (2001).
  10. Nevozhay, D., Adams, R. M., Murphy, K. F., Josic, K., Balazsi, G. Negative autoregulation linearizes the dose-response and suppresses the heterogeneity of gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5123-5128 (2009).
  11. Guinn, M. T., Balazsi, G. Noise-reducing optogenetic negative-feedback gene circuits in human cells. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7703-7714 (2019).
  12. Shimoga, V., White, J. T., Li, Y., Sontag, E., Bleris, L. Synthetic mammalian transgene negative autoregulation. Molecular Systems Biology. 9, 670 (2013).
  13. Ye, H., Daoud-El Baba, M., Peng, R. W., Fussenegger, M. A synthetic optogenetic transcription device enhances blood-glucose homeostasis in mice. Science. 332 (6037), 1565-1568 (2011).
  14. Pudasaini, A., El-Arab, K. K., Zoltowski, B. D. LOV-based optogenetic devices: light-driven modules to impart photoregulated control of cellular signaling. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 18 (2015).
  15. Liu, Y., et al. Robust and intensity-dependent synaptic inhibition underlies the generation of non-monotonic neurons in the mouse inferior colliculus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 131 (2019).
  16. Benzinger, D., Khammash, M. Pulsatile inputs achieve tunable attenuation of gene expression variability and graded multi-gene regulation. Nature Communications. 9 (1), 3521 (2018).
  17. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  18. Duan, L., et al. Understanding CRY2 interactions for optical control of intracellular signaling. Nature Communications. 8 (1), 547 (2017).
  19. Kim, N., et al. Spatiotemporal control of fibroblast growth factor receptor signals by blue light. Chemistry & Biology. 21 (7), 903-912 (2014).
  20. Jung, H., et al. Noninvasive optical activation of Flp recombinase for genetic manipulation in deep mouse brain regions. Nature Communications. 10 (1), 314 (2019).
  21. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. Light-inducible gene regulation with engineered zinc finger proteins. Methods in Molecular Biology. 1148, 89-107 (2014).
  22. Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo activities of light-inducible dimers: A cellular optogenetics guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
  23. Lee, D., Hyun, J. H., Jung, K., Hannan, P., Kwon, H. B. A calcium- and light-gated switch to induce gene expression in activated neurons. Nature Biotechnology. 35 (9), 858-863 (2017).
  24. Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
  25. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546 (2016).
  26. Chen, R., et al. Rhythmic PER abundance defines a critical nodal point for negative feedback within the circadian clock mechanism. Molecular Cell. 36 (3), 417-430 (2009).
  27. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  28. Sato, T. K., et al. Feedback repression is required for mammalian circadian clock function. Nature Genetics. 38 (3), 312-319 (2006).
  29. Kramer, B. P., Fischer, C., Fussenegger, M. BioLogic gates enable logical transcription control in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 478-484 (2004).
  30. Madar, D., Dekel, E., Bren, A., Alon, U. Negative auto-regulation increases the input dynamic-range of the arabinose system of Escherichia coli. BMC Systems Biology. 5, 111 (2011).
  31. Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, 35363 (2016).
  32. Szczesny, R. J., et al. Versatile approach for functional analysis of human proteins and efficient stable cell line generation using FLP-mediated recombination system. PLoS One. 13 (3), 0194887 (2018).
  33. Taxis, C. Development of a synthetic switch to control protein stability in eukaryotic cells with light. Methods in Molecular Biology. 1596, 241-255 (2017).
  34. Grav, L. M., et al. Minimizing clonal variation during mammalian cell line engineering for improved systems biology data generation. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2148-2159 (2018).
  35. Brophy, J. A., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nature Methods. 11 (5), 508-520 (2014).
  36. Yeoh, J. W., et al. An automated biomodel selection system (BMSS) for gene circuit designs. ACS Synthetic Biology. 8 (7), 1484-1497 (2019).
  37. Usherenko, S., et al. Photo-sensitive degron variants for tuning protein stability by light. BMC Systems Biology. 8, 128 (2014).
  38. Muller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. An optogenetic upgrade for the Tet-OFF system. Biotechnology and Bioengineering. 112 (7), 1483-1487 (2015).
  39. Klotzsche, M., Berens, C., Hillen, W. A peptide triggers allostery in tet repressor by binding to a unique site. Journal of Biological Chemistry. 280 (26), 24591 (2005).
  40. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  41. Herrou, J., Crosson, S. Function, structure and mechanism of bacterial photosensory LOV proteins. Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 713-723 (2011).
  42. Yao, F., et al. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Human Gene Therapy. 9 (13), 1939-1950 (1998).
  43. Erlich, H. A. . PCR technology : Principles and Applications for DNA Amplification. , (1989).
  44. Sambrook, J., Russell, D. W., Sambrook, J. . The condensed protocols from Molecular cloning : a laboratory manual. , (2006).
  45. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  46. Gerhardt, K. P., Castillo-Hair, S. M., Tabor, J. J. DIY optogenetics: Building, programming, and using the Light Plate Apparatus. Methods in Enzymology. 6224, 197-226 (2019).
  47. Stockley, J. H., et al. Surpassing light-induced cell damage in vitro with novel cell culture media. Scientific Reports. 7 (1), 849 (2017).
  48. Gordon, A., et al. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nature Methods. 4 (2), 175-181 (2007).
  49. Ordovas, L., et al. Efficient recombinase-mediated cassette exchange in hPSCs to study the hepatocyte lineage reveals AAVS1 locus-mediated transgene inhibition. Stem Cell Reports. 5 (5), 918-931 (2015).
  50. Gomez Tejeeda Zanudo, J., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).
  51. Sweeney, K., Moreno Morales, N., Burmeister, Z., Nimunkar, A. J., McClean, M. N. Easy calibration of the Light Plate Apparatus for optogenetic experiments. MethodsX. 6, 1480-1488 (2019).
  52. Ravindran, P. T., Wilson, M. Z., Jena, S. G., Toettcher, J. E. Engineering combinatorial and dynamic decoders using synthetic immediate-early genes. Communications Biology. 3 (1), 436 (2020).
  53. Chen, X., Wang, X., Du, Z., Ma, Z., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression in mammalian cells and in mice using the LightOn system. Current Protocols in Chemical Biology. 5 (2), 111-129 (2013).
  54. Guinn, M. T. Engineering human cells with synthetic gene circuits elucidates how protein levels generate phenotypic landscapes. State University of New York at Stony Brook. , (2020).
  55. Farquhar, K. S., et al. Role of network-mediated stochasticity in mammalian drug resistance. Nature Communications. 10 (1), 2766 (2019).
  56. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemistry & Biology. 11 (3), 198-200 (2015).
  57. Guinn, M. T., et al. Observation and control of gene expression noise: Barrier crossing analogies between drug resistance and metastasis. Frontiers in Genetics. 11, 586726 (2020).
  58. Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342 (6163), 1193-1200 (2013).
  59. Rullan, M., Benzinger, D., Schmidt, G. W., Milias-Argeitis, A., Khammash, M. An optogenetic platform for real-time, single-cell interrogation of stochastic transcriptional regulation. Molecular Cell. 70 (4), 745-756 (2018).
  60. Perkins, M. L., Benzinger, D., Arcak, M., Khammash, M. Cell-in-the-loop pattern formation with optogenetically emulated cell-to-cell signaling. Nature Communications. 11 (1), 1355 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

173

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved