JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Надежное управление светочувствительными клетками млекопитающих требует стандартизации оптогенетических методов. Для достижения этой цели в этом исследовании излагается конвейер построения генной цепи, клеточной инженерии, работы оптогенетического оборудования и проверочных анализов для стандартизации изучения экспрессии генов, индуцированной светом, с использованием оптогенетической генной схемы с отрицательной обратной связью в качестве тематического исследования.

Аннотация

Надежный контроль экспрессии генов в клетках млекопитающих требует инструментов с высоким изменением складки, низким уровнем шума и определенными функциями передачи ввода-вывода, независимо от используемого метода. Для достижения этой цели оптогенетические системы экспрессии генов за последнее десятилетие привлекли большое внимание для пространственно-височного контроля уровня белка в клетках млекопитающих. Однако большинство существующих схем, контролирующих экспрессию генов, индуцированных светом, различаются по архитектуре, экспрессируются из плазмид и используют переменное оптогенетическое оборудование, что создает необходимость изучения характеристик и стандартизации оптогенетических компонентов в стабильных клеточных линиях. Здесь исследование предоставляет экспериментальный конвейер надежного построения генной цепи, интеграции и характеристики для контроля экспрессии генов, индуцируемой светом, в клетках млекопитающих, используя в качестве примера оптогенетическую схему с отрицательной обратной связью. Протоколы также иллюстрируют, как стандартизация оптогенетического оборудования и режимов освещения может надежно выявить особенности генной цепи, такие как шум экспрессии генов и величина экспрессии белка. Наконец, эта статья может быть полезна для лабораторий, незнакомых с оптогенетикой, которые хотят принять такую технологию. Описанный здесь конвейер должен применяться к другим оптогенетическим схемам в клетках млекопитающих, что позволяет более надежно, подробно характеризовать и контролировать экспрессию генов на транскрипционном, протеомном и, в конечном счете, фенотипическом уровне в клетках млекопитающих.

Введение

Подобно другим инженерным дисциплинам, синтетическая биология направлена на стандартизацию протоколов, позволяя использовать инструменты с высоковоспроизводимыми функциями для изучения вопросов, относящихся к биологическим системам1,2. Одной из областей в синтетической биологии, где было построено много систем управления, является область регуляции экспрессии генов3,4. Контроль экспрессии генов может быть нацелен как на уровни белка, так и на изменчивость (шум или коэффициент вариации, CV = σ/μ, измеренный как стандартное отклонение от среднего), которые являются важнейшими клеточными характеристиками из-за их роли в физиологических и патологических клеточных состояниях5,6,7,8. Многие синтетические системы, которые могут контролировать уровень белка и шум4,9,10,11,12, были разработаны, создавая возможности для стандартизации протоколов между инструментами.

Одним из новых инструментов, которые могут контролировать генные сети, которые недавно появились, является оптогенетика, позволяющая использовать свет для контроля экспрессии генов13,14,15,16,17. Подобно своим химическим предшественникам, оптогенетические генные цепи могут быть введены в любой тип клеток, начиная от бактерий и заканчивая млекопитающими, что позволяет экспрессировать любой интересующий ген18,19. Однако из-за быстрого создания новых оптогенетических инструментов появилось много систем, которые различаются по архитектуре генетических схем, механизму экспрессии (например, плазмидная и вирусная интеграция) и светоснабжающему контрольному оборудованию11,16,20,21,22,23,24,25 . Таким образом, это оставляет место для стандартизации оптогенетических особенностей, таких как построение и оптимизация генной цепи, метод использования системы (например, интеграция против переходной экспрессии), экспериментальные инструменты, используемые для индукции, и анализ результатов.

Чтобы добиться прогресса в стандартизации оптогенетических протоколов в клетках млекопитающих, этот протокол описывает экспериментальный конвейер для разработки оптогенетических систем в клетках млекопитающих с использованием генной схемы отрицательной обратной связи (NF), интегрированной в клетки HEK293 (клеточная линия эмбриональной почки человека) в качестве примера. NF является идеальной системой для демонстрации стандартизации, поскольку она очень распространена в природе26,27,28, что позволяет настраивать уровни белка и минимизировать шум. Короче говоря, NF позволяет точно контролировать экспрессию генов с помощью репрессора, уменьшая свою собственную экспрессию достаточно быстро, тем самым ограничивая любое изменение от устойчивого состояния. Устойчивое состояние может быть изменено индуктором, который инактивирует или устраняет репрессор, чтобы обеспечить большую выработку белка до тех пор, пока не будет достигнуто новое устойчивое состояние для каждой концентрации индуктора. Недавно была создана спроектированная оптогенетическая система NF, которая может производить широкодинамический ответ экспрессии генов, поддерживать низкий уровень шума и реагировать на световые стимулы, что позволяет контролировать пространственную экспрессию генов11. Эти инструменты, известные как светоиндуцируемые тюнеры (LITers), были вдохновлены более ранними системами, которые позволяли контролировать экспрессию генов в живых клетках4,10,29,30 и были стабильно интегрированы в клеточные линии человека для обеспечения долгосрочного контроля экспрессии генов.

Здесь, используя LITer в качестве примера, описан протокол для создания светочувствительных генных цепей, индуцирующих экспрессию генов с помощью light Plate Apparatus (LPA, оптогенетическое индукционное оборудование)31, и анализа реакций инженерных, оптогенетически контролируемых клеточных линий на пользовательские световые стимулы. Этот протокол позволяет пользователям использовать инструменты LITer для любого функционального гена, который они хотят исследовать. Он также может быть адаптирован для других оптогенетических систем с различными схемными архитектурами (например, положительная обратная связь, отрицательное регулирование и т. Д.) Путем интеграции методов и оптогенетического оборудования, описанных ниже. Подобно другим протоколам синтетической биологии, видеозаписи и оптогенетические протоколы, изложенные здесь, могут применяться в одноклеточных исследованиях в различных областях, включая, но не ограничиваясь биологией рака, эмбриональным развитием и дифференцировкой тканей.

протокол

1. Проектирование генных схем

  1. Выберите генетические компоненты для объединения в одну генную цепь/плазмиду (например, мотивы последовательности интеграции ДНК млекопитающих32, светочувствительные элементы33 или функциональные гены34).
  2. Используя любое программное обеспечение для генной инженерии и/или молекулярного клонирования, храните последовательности ДНК для последующего использования и ссылки, аннотируйте каждую последовательность и исследуйте все необходимые признаки (например, кодоны START, регуляторные или переведенные последовательности)35.
  3. Разрабатывайте или принимайте детали в соответствии с общей конструкцией генной схемы36. Например, для оптогенетических репрессоров, как в LITers11, объединяют последовательность генов, кодирующих домен, способный к легкоиндуцируемой деградации37,38 или инактивации способности репрессора к связыванию ДНК39, рядом с геном репрессора и в кадре (например, TetR)4.
    1. Для оптогенетических активаторов обеспечьте наличие активаторного домена40 , который способствует экспрессии генов при связывании ДНК, вызванной светом41. Для отрицательной или положительной ауторегуляции обеспечьте наличие регуляторного сайта связывания в промоторе гена-регулятора или вверх по течению от него (например, сайтов tetO в или выше по течению промотора, экспрессирующего TetR)42.
  4. Разработайте праймеры для амплификации последовательности ДНК или секвенирования плазмиды с использованием программного обеспечения молекулярного клонирования для каждой генной цепи.
  5. Проверяйте праймеры вычислительно для построения плазмид с помощью встроенных пирур программного обеспечения для молекулярного клонирования (например, выравнивание последовательностей).
  6. Закажите олигонуклеотидные грунтовки от производителя. Плазмиды, построенные и использованные в этой работе, можно найти в оригинальном несущем материале11 вместе с разработанными и используемыми грунтовками.
  7. Разбавить грунтовки до концентрации запаса 100 мМ в двухдистиллированной воде (ddH2O).
  8. Разбавить запас грунтовок 100 мМ до концентрации 10 мМ для ПЦР.
  9. Готовят смесь ПЦР с 1 мкл прямого праймера, 1 мкл обратного праймера, 1 мкл шаблонной ДНК до общей массы 0,5-500 нг для генома или 0,5 пг-5 нг для плазмидной или вирусной ДНК, 12,5 мкл ДНК-полимеразы 2x мастер-микса (или объема, удовлетворяющего коэффициенту разбавления производителя) и 9,5 мкл ddH2O для общего объема реакции 25 мкл.
  10. Инкубируйте смесь ПЦР в термоциклере при соответствующих настройках в зависимости от выбранного фермента43. Предлагаемые циклы реакции включают:
    Шаг 1: Один цикл начальной стадии денатурации 30 с при 95 °C.
    Шаг 2: 40 циклов по 5 с стадии денатурации при 98 °C.
    Этап 3: Один цикл из 30 с стадии отжига при 65 °C (определяется грунтовками, разработанными ранее).
    Шаг 4: Один цикл 1 мин расширения при 72 °C (~1 килобаз (кб) длины фрагмента шаблона).
    Шаг 5: Один цикл удлинения на 2 минуты при 72 °C.
    Удерживайте реакцию при 4 °C до тех пор, пока она не будет проверена с помощью гелевого электрофореза. Этот протокол будет варьироваться в зависимости от используемых реагентов (например, полимеразы и буферов).
  11. Повторите шаг 1.9, чтобы амплифицировать все фрагменты, которые будут использоваться в реакции сборки ДНК, необходимой для связывания линейных продуктов ПЦР в один круговой вектор ДНК.
  12. Запустите продукты ПЦР на 1% агарозном геле с последующей очисткой полос нужной длины.
  13. Подготовьте мастер-микс для реакции сборки ДНК (таблица 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере материнский вектор разбивается на два фрагмента для повышения эффективности этапов ПЦР, не вызывая существенных изменений в общем результате сборки.
  14. Инкубируют главную смесь реакции сборки ДНК в термоциклере при 50 °C в течение 1 ч (если иное не указано в протоколе реагента сборки ДНК) и сохраняют реакцию при 4 °C для использования продукта реакции для бактериальной трансформации.
  15. Настройте бактериальную трансформацию (химическую или электропорационную) с использованием компетентных клеток E. coli (Escherichia coli) и соответствующего протокола бактериальной трансформации. После трансформации используйте бактериальные агаровые пластины Лурия-Бертани (LB), содержащие выбранный маркер бактериального отбора (например, ампициллин), чтобы покрыть смесь трансформации. Инкубировать пластины при 37 °C в течение ночи44.
  16. Проверьте тарелки на следующий день. Чтобы привить колонии, отбирают отдельные колонии из пластин и повторно суспендируют их в жидком бульоне LB с соответствующим маркером бактериального отбора в культуральных пробирках. Инкубировать в шейкерном инкубаторе при 37 °C, 300 об/мин в течение ночи.
  17. Выполните протокол плазмидного препарата для извлечения плазмидной ДНК из бактериальной культуры.
  18. Проверьте схему в два этапа. Во-первых, выполните тестовое пищеварение с использованием ферментов рестрикции в качестве грубой проверки, чтобы увидеть, был ли получен приблизительный плазмидный продукт. Во-вторых, если тестовое сбраживание пройдено/подтверждено, отправьте плазмиду в установку секвенирования Сэнгера (или процесс с использованием доступного оборудования) для получения точной последовательности ДНК, чтобы сравнить ее позже с ожидаемой последовательностью в программном обеспечении для проектирования.
    1. Чтобы выполнить тестовое пищеварение, выберите по крайней мере два фермента рестрикции, которые производят, по крайней мере, два фрагмента, на основе используемого программного обеспечения молекулярного клонирования. После того, как ферменты выбраны, подготовьте тестовые образцы, добавив 1 мкл каждого фермента, 5 мкл генерируемой ДНК и 13 мкл воды с соответствующими солями и буферами в зависимости от используемых ферментов. Инкубируют реакцию при 37 °C в течение 1 ч, или, как предлагает производитель фермента. Запустите тест продуктов пищеварения на 1% агарозном геле и определите, являются ли полосы правильными.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если полосы правильные, переходите к секвенированию.
    2. Для выполнения секвенирования генерируйте праймеры на основе ДНК, хранящейся в программном обеспечении, так что области отжига праймеров находятся на расстоянии около 500 bp (пары оснований) друг от друга и покрывают интересующий фрагмент (компонент генной цепи) или полную плазмиду. Разбавить праймеры чистой водой без нуклеазы (NF-H2O) до концентрации 10 мМ. Подготовьте образцы секвенирования, добавив 1 мкл 10 нг/мкл ДНК, 1 мкл праймера и 8 мкл NF-H2O в пробирку объемом 0,2 мл. Повторите это для каждой грунтовки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Когда образцы подготовлены, сдайте их на установку секвенирования и сравните результаты с последовательностью плазмид с помощью программного обеспечения для молекулярного клонирования.
  19. На этом этапе генерируют приблизительно 100-1000 нг/мкл образца ДНК для интеграции плазмид, содержащих генные цепи, в соответствующую клеточную линию.

2. Проектирование стабильных клеточных линий

  1. Закажите клеточную линию млекопитающих, предназначенную для быстрой генерации стабильных подлиний, которые обеспечивают высокоуровневую экспрессию интересующего белка из вектора экспрессии млекопитающих. Тип ячейки и простота проектирования клеточных линий могут варьироваться в зависимости от того, что пользователи предпочитают или стремятся достичь.
    1. Например, если пользователи предпочитают проектирование клеточных линий с минимальными промежуточными этапами, упорядочивайте клетки, содержащие один стабильный сайт интеграции (например, FRT), в транскрипционно активном геномном локусе. Если предпочтение отдается более тонкой клеточной инженерии, создайте сайты интеграции в предпочтительных местах с помощью инструментов генной инженерии, таких как CRISPR / Cas9.
  2. Выращивайте клетки в 5% CO2 в увлажненном воздухе при 37 °C. Отрегулируйте условия роста по мере необходимости для типа клеток.
  3. Трансфектируйте генные цепи, разработанные выше, в желаемые клетки, полученные на предыдущих этапах, чтобы начать стабильный процесс генерации клеточной линии. Для этого используют липосомную смесь45 генной цепи ДНК с соответствующей рекомбиназой (например, Flp-рекомбиназы для рекомбинации Flp-FRT) или с помощью других методов, таких как электропорация.
  4. Через два дня после трансфекции расщепляют клетки до 25% конфюляции.
  5. Через шесть часов после расщепления клеток начинают отбор антибиотиков путем обмена среды на свежую среду, содержащую 50 мкг/мл антибиотика гигромицина (или другого антибиотического агента, соответствующего гену устойчивости к антибиотикам млекопитающих, выбранному во время плазмидного строительства).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Существует множество генов устойчивости млекопитающих к антибиотикам, используемых в построении генных цепей, каждый из которых имеет различную кривую уничтожения. Поэтому, какой бы ген устойчивости млекопитающих к антибиотикам ни был выбран для построения схемы, в интересующих клетках должна быть изучена правильная кривая уничтожения. Этот шаг гарантирует, что клетки, содержащие полезную нагрузку генной цепи, обогащены, в то время как клетки, не имеющие системы, будут убиты.
  6. Дайте клеткам расти в средах отбора антибиотиков, переходите на свежие среды каждые 2-3 дня, пока пластина или колба не будет иметь несколько десятков очагов. Проходите адгезивные культуры, когда они находятся в фазе бревна, прежде чем они достигнут слияния.
  7. Как только будет достаточно много очагов, трипсинизируют клетки 1 мл 0,25% трипсина, 0,1% ЭДТА в сбалансированном растворе соли Хэнка (HBSS) без кальция, магния и бикарбоната натрия в течение нескольких минут. Нейтрализируйте трипсин свежими средами и передайте все клетки в свежий контейнер.
  8. Как только клетки в свежем контейнере станут на 80%-100% сливающимися, заморозьте их в смеси 45% старой среды, 45% свежей среды и 10% DMSO. Перенесите оставшиеся клетки в стерильную трубку и выполните одноклеточную сортировку для выделения моноклональных клеток в 96-луночную пластину.
  9. Примерно через 2-3 недели после моноклональной сортировки скважины в пределах 96-луночной плиты должны иметь очаги. Когда примерно 50%-60% сливаются, расщепляют клетки на 12-луночную пластину.
  10. Как только 12-луночная пластина станет на 80%-100% сливающейся, расщепленной на культуру ткани, обработанную колбой Т-25. Как только клетки в колбе Т-25 становятся на 80%-100% сливающимися, клетки замораживаются и сохраняют проход для характеристики и тестирования моноклональных клеточных линий.
    1. Охарактеризуйте моноклональные клеточные линии с помощью микроскопии и анализов проточной цитометрии, чтобы сообщить о профилях экспрессии генов на основе индуцированной продукции флуоресцентного репортера. Проверка функционального производства белка с помощью флуоресцентной маркировки антител и иммунофлуоресцентного анализа. Протестируйте индукцию экспрессии генов на транскрипционном уровне с помощью количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR). Проверка генетической последовательности и точности интеграции с помощью локального и полногеномного секвенирования клонов.

3. Индукционные анализы легких пластинчатых аппаратов

  1. Построить LPA устройство31,46 для использования для световой индукции инженерных ячеек. Короче говоря, несколько широких шагов имеют решающее значение для создания LPA для использования для контроля экспрессии генов. К ним относятся 3D-печать компонентов LPA-фрейма, конструкция печатной платы, программирование схемы с помощью программатора микроконтроллера, сборка компонентов в окончательный LPA, программирование карты памяти с помощью программного обеспечения IRIS и калибровка готового устройства. Для более подробного объяснения обратитесь к приведенным выше ссылкам.
    1. Печать 3D-деталей, как описано в Gerhardt et al. (2016 и 2019)31,46.
    2. Соберите печатную плату, как описано в Gerhardt et al. (2016 и 2019)31,46.
    3. Добавьте прошивку в собранную схему LPA с помощью программы микроконтроллера, как описано в Gerhardt et al. (2016 and 2019)31,46.
    4. Объедините 3D-печатные детали и собранную печатную плату, как описано в Gerhardt et al. (2016 and 2019)31,46. Это включает в себя монтажную пластину, печатную плату, прокладку светодиодов (светодиодов), адаптер пластины, пластинчатую пластину, 24-луночную пластину, крышку пластины, крепежные болты, а также гайки крыла и компоненты штабелирования, как показано на снятом видео и рисунке 2.
    5. Для программирования карты памяти и калибровки устройства выполните действия, описанные ниже.
  2. Используйте программное обеспечение IRIS, доступное на веб-сайте Tabor Lab47 , чтобы запрограммировать SD-карту для устройства Light Plate (LPA)31 и изучить соответствующие условия освещения, необходимые для начала оптогенетического эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение IRIS представляет собой веб-приложение для программирования оптогенетического электронного оборудования, известное как LPA, разработанное Tabor Lab. Программное обеспечение позволяет программировать относительные значения IRIS, которые управляют отдельными светодиодами (светодиодами) в каждой скважине оборудования LPA.
  3. Выберите раскрывающийся список LPA (4 x 6), а затем щелкните соответствующий подход к освещению (Steady-state, Dynamic, Advanced).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой рукописи все анализы будут сосредоточены на стационарных примерах. Тем не менее, расширенные примеры настройки могут быть использованы для длительности импульсов и режимов рабочего цикла.
  4. Выберите, будут ли освещаться верхние или нижние светодиоды, введя значения в ячейки, соответствующие колодцам пластины. Для LPA, использованных в этой работе, во всех экспериментах использовались синие светодиоды, размещенные в верхнем положении. Каждый светодиод, однажды запрограммированный, может обеспечить непрерывное воздействие света с постоянной интенсивностью света. Программное обеспечение IRIS позволяет запрограммировать 4096 уровней интенсивности.
  5. После выбора расположения светодиодов введите значения интенсивности для желаемого экспериментального контура. Например, введите 8 различных интенсивностей света (или длительности импульсов, или рабочих циклов) с тремя техническими репликами на пластину (таблица 2). G.s. относится к единицам оттенков серого - значениям измерения уровня интенсивности света, используемым для программирования LPA в программном обеспечении IRIS.
    1. При разработке экспериментальных файлов IRIS учитывайте краевые эффекты от соседних скважин на устройстве LPA, световую токсичность от увеличения интенсивности воздействия синего света и определение желаемого типа дозы-отклика (например, монотонный или немонотонный).
    2. Если пользователи программируют ячейки в LPA в порядке возрастания / убывания определенного параметра освещения (например, интенсивности), скважины могут производить краевые эффекты перекрестных помех света или даже тепла, которые могут влиять на соседние скважины. Это может непреднамеренно повлиять на результат измеренных результатов после завершения экспериментов. Чтобы облегчить эту проблему, пользователи могут реализовать матрицу рандомизации в программном обеспечении IRIS для скремблирования местоположений скважин, сводя к минимуму граничные эффекты. Пример описан в репрезентативных результатах ниже (рисунок 4A-B).
    3. Кроме того, было обнаружено, что более высокая интенсивность синего света препятствует клеточному росту и жизнеспособности48. Поэтому для смягчения световой токсичности важно создать кривую интенсивности света, длительности импульса или реакции рабочего цикла в зависимости от исследуемой модальности.
      1. Например, программа 8 значений интенсивности света с тремя репликами на 24-луночную пластину, с диапазоном от отсутствия света до максимальной интенсивности LPA. Затем запустите эти образцы на проточном цитометре с затвором SSC-FSC или живым пятном, таким как йодид пропидия, чтобы количественно оценить выживаемость популяционных клеток (живые клетки по сравнению с общими событиями, включая мертвые клетки / клеточный мусор) при каждом световом значении.
      2. Затем определите идеальную величину выживаемости популяции для экспериментальной установки, поскольку любой стимул может отрицательно повлиять на пролиферацию, экспрессию генов или выживаемость (например, установка 80% выживаемости клеток в качестве соответствующего компромисса). Например, в этой работе после калибровки интенсивность не превышала 3000 г.с. единиц (~3/4 максимальной интенсивности прибора LPA). Пример этого описан в репрезентативных результатах ниже.
    4. В дополнение к ограничению значений освещенности из-за токсичности пользователи могут пожелать ограничить значения света для характеристики конкретной части дозы-реакции, такой как диапазон монотонной реакции.
      1. Чтобы достичь этого, первоначально сканируйте широкий диапазон интенсивности света, длительности импульса или рабочих циклов в зависимости от модальности, анализируемой при определении желаемой дозы-ответа (таблица 2), чтобы сузить интересующий режим освещения, например, где экспрессия генов положительно коррелирует с увеличением значений света для монотонной дозы-ответа.
      2. Чтобы определить диапазон освещения, представляющий интерес, запрограммируйте один LPA с 24 скважинами различной интенсивности / длительности импульса / рабочим циклом / и т. Д. Или более скважинами (например, 48, 72, 96 и т. Д.) В зависимости от того, откалиброваны ли несколько LPA для получения эквивалентных количеств света и продолжения работы клеточной культуры или анализов, описанных ниже. Поэтому начинают характеристику оптогенетической системы с широким диапазоном доз световых раздражителей для определения диапазона интервала, дающего желаемую экспрессию гена, и впоследствии проводят эксперименты в этом уточненном диапазоне доз.
      3. Например, в этой работе однажды 3000 г.с. единиц определяли в качестве порога интенсивности токсичного света; этот порог использовался в качестве верхней границы света для анализов, описанных ниже (например, иммунофлуоресценция).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенные выше этапы не зависят от оптической калибровки LPA и относятся к калибровке на молекулярном уровне для каждой оптогенной системы.
  6. После того, как соответствующие значения интенсивности света запрограммированы в IRIS, вставьте карту памяти с розеткой USB 3.0 в LPA для загрузки и передачи файлов.
  7. Если калибровка LPA завершена31, приступают к работе клеточной культуры для начала светоиндукционного анализа. Если калибровка не была выполнена, откалибруйте LPA с помощью метода анализа изображений (шаги 3.7.1-3.7.3) после программирования LPA с помощью программатора микроконтроллера.
    1. Кратко запрограммируйте LPA на тот же уровень IRIS, который описан Gerhardt et al. (2016)31.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для калибровки LPA был запрограммирован на значение 2000 г.с.
    2. После того, как устройство запрограммировано с помощью карты памяти и нажата кнопка сброса (физическая кнопка на LPA), получите изображение всего устройства (например, гелевого тепловизора станции, сканера и т. Д.). Для калибровки получите два изображения с устройством, повернутым на 180°.
    3. Затем используйте программное обеспечение с открытым исходным кодом, разработанное Gerhardt et al. (2016)31 , чтобы показать изменчивость интенсивности светодиодов на пластине LPA и рассчитать значения компенсации светодиодов, чтобы сделать интенсивность равной в скважинах. Пример этого описан в представленных ниже результатах (рисунок 3). Как только эта калибровка будет завершена, приступайте к работе клеточной культуры для начала анализа световой индукции.
  8. Получите колбы сконструированных моноклональных клеток из предыдущего раздела, чтобы исследовать влияние световой индукции на экспрессию генов.
  9. Извлеките старый носитель из колбы.
  10. Добавьте в клетки 1 мл трипсина и инкубируйте в течение 5 мин.
  11. Через 5 мин нейтрализуют трипсин, добавив 4 мл дульбекко-модифицированной среды Eagle's (DMEM или другой желаемой среды), дополненной необходимыми химическими веществами (в этой работе использовали 50 мкг/мл гигромицина, 1% раствор пенициллина/стрептомицина, 10% фетальную бычью сыворотку, FBS).
  12. Добавьте ~75 000 ячеек на скважину в 24-луночную черную пластину общим объемом 500 мкл. Количество посеянных клеток может варьироваться в зависимости от продолжительности желаемого эксперимента и используемого типа клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, обратите внимание, что плотность посева клеток влияет на поддержание культуры и, возможно, на продолжительность эксперимента. Начиная с меньшего количества клеток в лунке, вы обеспечиваете более длительные промежутки времени, прежде чем культура достигнет слияния. Кроме того, тип оптогенетических компонентов, интегрированных в генные схемы, представляющие интерес, будет влиять на то, когда экспрессия генов достигнет устойчивого состояния и, следовательно, повлияет на продолжительность экспериментов. Другими факторами, которые могут быть рассмотрены, являются специфические для клеточной линии темпы роста, состав среды и условные эффекты роста (т. Е. Свет).
  13. После покрытия поместите клетки в увлажненный инкубатор с 5% CO2 , чтобы они осели в течение 2-6 ч.
  14. После инкубации перенесите клетки в вытяжку для культивирования тканей, снимите пластиковую крышку и добавьте полоску клейкой фольги в верхнюю часть пластины (рисунок 2D). Этот шаг обеспечивает минимальный перенос света между скважинами, так как верхняя и боковые стороны скважин покрыты, и свет теперь может проникать только со дна скважины, где размещен светодиод.
  15. Поместите пластину в установленные 3D-части LPA. Затем накройте пластину 3D-печатной крышкой LPA, которая прилегает к винтам устройства на каждом углу.
  16. Подключите устройство к источнику питания и нажмите кнопку сброса на устройстве LPA, чтобы убедиться, что применены обновленные параметры эксперимента LPA.
  17. Инкубируйте клетки в экспериментальной системе в течение соответствующего количества времени, в зависимости от исходной плотности посева, скорости роста клеточной линии и условий роста. В этом примере клеточные линии индуцировались в течение 3 дней непрерывно, чтобы экспрессия генов достигла устойчивого состояния. Однако следует отметить, что многие оптогенетические системы (например, VVD) могут достигать стационарной экспрессии генов гораздо раньше (например, 24 ч), и поэтому время экспериментальной индукции может быть уменьшено или продлено по мере необходимости.
  18. В конце эксперимента по световой индукции используйте образцы для любого из следующих четырех анализов для характеристики инженерных клеточных линий (разделы 4-7).

4. Флуоресцентная микроскопия светоиндуцированных инженерных клеток

  1. Через 24-72 ч после индукции удалите клетки LPA из инкубатора и поместите их в тканевую культуральную вытяжку.
  2. Снимите полоску фольги и оставьте пластину на 1-2 мин. Это предотвращает образование конденсата на пластиковой крышке, если поместить ее сразу на пластину.
  3. После 1-2 мин сидения положите оригинальную пластиковую крышку обратно на тарелку.
  4. Визуализируйте клетки с помощью соответствующего фазового контраста или флуоресцентного микроскопа.
  5. В зависимости от прибора отрегулируйте время экспозиции, интенсивность источника света и коэффициент усиления для отображения инженерных ячеек. В этом эксперименте применялись следующие параметры: 50 мс для времени воздействия источника света FITC/GFP (зеленый флуоресцентный белок) и 1-5 мс для фазово-контрастного воздействия при 100% интенсивности для каждого.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует отметить, что оптимальное время экспозиции, уровни усиления и интенсивность источника света часто выводятся эмпирически из опыта этой работы, чтобы свести к минимуму перенасыщение в флуоресцентном репортере, свести к минимуму повреждение клеток и захватить адекватные изображения для качественного и количественного анализа. При определении уровней каждого из этих параметров следует иметь в виду максимизацию соотношения сигнал/шум, минимизацию фототоксичности, минимизацию перенасыщенности флуоресцентных сигналов и увеличение способности усиливать слабые флуоресцентные сигналы.
    1. Оптимизировать эти параметры грубо ad hoc; однако предыдущие экспериментальные значения (например, интенсивность источника света, вызывающая перенасыщение флуоресцентного репортера) могут направлять будущие экспериментальные установки, когда это применимо. Например, настройки усиления, время экспозиции и начальные значения интенсивности света из одной цепи (LITer1.0) или экспериментальной установки (например, интенсивность света) могут использоваться в качестве отправной точки при переходе к аналогичной, но отличной генной цепи (LITer2.0)11 или другой модальности освещения (например, световой рабочий цикл).
  6. Оптимизируйте визуализацию пластин с помощью шаблона координат, запрограммированного в программном обеспечении для микроскопии, позволяя всему размеру пластины (например, 24 скважины) автоматизировать получение изображений из нескольких мест изображения на скважину.

5. Проточная цитометрия светоиндуцированных инженерных клеток

  1. Через 24-72 ч после индукции удаляют клетки из LPA в инкубаторе или из микроскопа после визуализации и помещают их в тканевую культуральную вытяжку.
  2. Если вы удалены непосредственно из LPA, снимите полоску фольги и дайте пластине постоять минуту или две.
  3. Аспирировать среду из каждой скважины (всей плиты из 24 скважин, если используются все скважины).
  4. Добавьте 100 мкл 0,25% трипсина в каждую лунку, накройте пластину пластиковой крышкой и поместите ее обратно в инкубатор.
  5. Оставьте клетки нетронутыми в инкубаторе на 5 минут.
  6. Через 5 мин снимите пластину и верните ее в вытяжку для культивирования тканей.
  7. Нейтрализуют каждый трипсинизированный хорошо 400 мкл ДМЭМ.
  8. Маркировка 5 мл полистирольной трубки круглого дна с клеточным сетчатым фильтром (или соответствующей проточной цитометрической трубкой, которая может быть отфильтрована для удаления больших скоплений клеток, не полностью трипсинизированных) с именем, соответствующим каждой скважине.
  9. Используйте пипетку P1000 для пипетки содержимого каждой скважины вверх и вниз 6-8 раз, чтобы разбить комки клеток и создать одноклеточные образцы для проточной цитометрии49.
  10. Перенесите все содержимое каждой лунки (~500 мкл) в маркированные пробирки с помощью сетчатого фильтра.
  11. Подведите клетки к соответствующему проточному цитометрическому прибору с помощью лазеров правильных длин волн (может привести трубки с клетками на лед или вне его).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проточный цитометр, используемый в этой работе, был частью основного объекта, расположенного в университетской больнице.
  12. Создайте затвор прямого и бокового рассеяния (FSC и SSC соответственно) для захвата отдельных ячеек соответствующего размера и зернистости, чтобы исключить мусор и клеточные сгустки в программном обеспечении проточной цитометрии.
  13. Как только ворота установлены, захватите около 10 000 ячеек с соответствующими воротами. Отрегулируйте это число в зависимости от объема сотовых данных, которые ищут пользователи. Повторите для каждой трубки, содержащей клетки из эксперимента.
  14. После завершения эксперимента импортируйте данные в доступное программное обеспечение для анализа данных проточной цитометрии.
  15. Создайте затвор FSC-SSC (как и раньше во время сбора) и примените его к каждой партии экспериментальных данных. Эталонный колодец неиндуцированной клеточной популяции используется для создания этих ворот в этой рукописи, но существуют и другие метрики для создания затворов, такие как затворы на основе плотности.
  16. С экспериментальными условиями, закрытыми затвором FSC-SSC, выводите данные проточной цитометрии в виде гистограмм или представляют другими способами для иллюстрации полученных паттернов экспрессии. В этом эксперименте флуоресценция была захвачена каналами GFP/FITC или PE/TexasRed.

6. Экстракция РНК и количественная ПЦР компонентов генной цепи

  1. Через 24-72 ч после индукции удаляют клетки из LPA в инкубаторе или из микроскопа после визуализации и помещают их в тканевую культуральную вытяжку.
  2. Если пластина удалена непосредственно из LPA, снимите полоску фольги и дайте пластине постоять минуту или две.
  3. Аспирировать среду из каждой скважины (всей плиты из 24 скважин, если используются все скважины).
  4. Приступайте к извлечению РНК из клеток с помощью соответствующего набора для экстракции РНК.
  5. Как только экстракция РНК будет завершена, выполните реакцию обратной транскрипции каждого образца (таблица 3).
  6. Далее выполняют количественную ПЦР каждого образца (таблица 4). Используйте ДНК-полимеразу и связанный с ней протокол для создания реакций ПЦР. Для этого шага создайте мультиплексированную реакцию с геном ведения хозяйства и геном, представляющим интерес, или создайте отдельные реакции. В этом примере были исследованы уровни GFP, KRAS и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH). После завершения эксперимента qRT-PCR приступайте к анализу с помощью доступного программного обеспечения, чтобы проиллюстрировать изменение складки генной цепи на уровне РНК.

7. Иммунофлуоресценция компонентов генной цепи

  1. Используйте ледяную ванну или морозильную камеру для охлаждения метанола.
  2. Через 24-72 ч после индукции удаляют клетки из LPA в инкубаторе или из микроскопа после визуализации и помещают их в тканевую культуральную вытяжку.
  3. Если пластина удалена непосредственно из LPA, снимите полоску фольги и оставьте пластину на 1-2 мин.
  4. Аспирировать среду из каждой скважины (всей плиты из 24 скважин, если используются все скважины).
  5. Добавьте 100 мкл 0,25% трипсина в каждую лунку, накройте пластину пластиковой крышкой и поместите ее обратно в инкубатор.
  6. Оставьте клетки нетронутыми в инкубаторе на 5 минут.
  7. Через 5 мин снимите пластину и верните ее в вытяжку для культивирования тканей.
  8. Нейтрализуют каждый трипсинизированный хорошо 400 мкл ДМЭМ.
  9. Маркировка мини-центрифужных трубок с названиями, соответствующими каждой скважине.
  10. Используйте пипетку P1000 и пипетку, содержимое каждой лунки вверх и вниз 6-8 раз, чтобы сломать комки клеток.
  11. Перенесите все содержимое каждой лунки (~500 мкл) в маркированные пробирки.
  12. Центрифугировать ячейки в течение 5 мин при 400 х г.
  13. По завершении выбросьте супернатант и переместите образцы в химический вытяжной шкаф.
  14. Повторно суспендируют клетки (используйте пипетку P1000 и пипетку вверх и вниз 6-8 раз в каждой пробирке, чтобы разрушить сгустки клеток) в 750-1000 мкл 4% параформальдегида (разбавленного в фосфатно-буферном физиологическом растворе, PBS).
  15. Дайте ячейкам постоять в течение 15 минут при комнатной температуре.
  16. После инкубации добавляют 750-1000 мкл PBS. Пипетка вверх и вниз несколько раз.
  17. Центрифугировать ячейки в течение 5 мин при 400 х г.
  18. По завершении выбросьте супернатант и переместите образцы в химический вытяжной шкаф.
  19. Повторно суспендируйте клетки (используйте пипетку P1000 и пипетку вверх и вниз 6-8 раз в каждой трубке, чтобы разрушить сгустки клеток) в 750-1000 мкл ледяного метанола.
  20. Дайте ячейкам постоять в течение 30 минут на льду или в морозильной камере при температуре -20 °C.
  21. После инкубации добавляют 750-1000 мкл PBS. Пипетка вверх и вниз несколько раз.
  22. Центрифугировать ячейки в течение 5 мин при 400 х г.
  23. По завершении выбросьте супернатант и переместите образцы в химический вытяжной шкаф.
  24. В зависимости от типа используемых антител, модифицируйте протокол с этого момента. Выполните шаги 7.24.1-7.24.14 или 7.24.15-7.24.22.
    1. При использовании первичного и вторичного антитела повторно суспендируйте клетки с помощью пипетки P1000/P200 и пипетки вверх и вниз 6-8 раз в каждой пробирке, чтобы разрушить сгустки клеток в 100 мкл первичного антитела. В этом случае производили разведение 1:800 для стоковых антител, включая антитела KRAS или антитела ERK, и давали сидеть в течение 1 ч при комнатной температуре. Антитела разбавляли в инкубационном буфере, изготовленном из 1x PBS с 0,5 г BSA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Определите точное разведение антитела эмпирически, создав стандартную кривую разведения антител по отношению к интересующему антигену.
    2. После добавления антител накройте трубки фольгой, чтобы предотвратить световое воздействие на меченые антитела.
    3. После инкубации добавляют 750-1000 мкл инкубационного буфера. Пипетка вверх и вниз несколько раз.
    4. Центрифугировать ячейки в течение 5 мин при 400 х г.
    5. По завершении выбросьте супернатант и переместите образцы в химический вытяжной шкаф.
    6. Повторно суспендируйте клетки с помощью пипетки P1000/P200 и пипетки вверх и вниз 6-8 раз в каждой трубке, чтобы разрушить сгустки клеток в 100 мкл вторичного антитела. В этом случае клетки повторно суспендировали в 100 мкл вторичного антитела в разведении 1:800 для антител KRAS или 1:2000 для антитела ERK и давали посидеть в течение 30 мин при комнатной температуре. Подобно первичным антителам, разбавляют вторичные антитела в инкубационном буфере, как описано выше. Определить разбавления вторичных антител на основе эмпирических данных стандартной кривой.
    7. После добавления антител накройте трубки фольгой, чтобы предотвратить световое воздействие на меченые антитела.
    8. После инкубации добавляют 750-1000 мкл инкубационного буфера. Пипетка вверх и вниз несколько раз.
    9. Центрифугировать ячейки в течение 5 мин при 400 х г.
    10. По завершении выбросьте супернатант и переместите образцы в химический вытяжной шкаф.
    11. Повторно суспендируйте клетки с помощью пипетки P1000 и пипетки вверх и вниз 6-8 раз в каждой трубке, чтобы сломать сгустки клеток в 500 мкл PBS.
    12. Перенесите все содержимое каждой трубки (~500 мкл) на маркированные пробирки с сетчатыми фильтрами.
    13. Доведите клетки до соответствующих инструментов проточной цитометрии с помощью лазеров правильных длин волн (можете привести трубки с клетками на лед или вне его).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следует отметить, что наличие нескольких контрольных элементов важно для прогресса с измерением проточной цитометрии и анализом экспрессии генов инженерных клеток. Например, наличие совершенно неокрашенных клеток, клеток, окрашенных только первичным антителом, и клеток, окрашенных только вторичным антителом, может быть полезно для сравнения результатов с фоновыми сигналами от антител.
    14. Затем приступайте к анализу, как описано в разделе 5.
    15. При использовании только первичного антитела повторно суспендируйте клетки с помощью пипетки P1000/P200 и пипетки вверх и вниз 6-8 раз в каждой пробирке, чтобы разрушить сгустки клеток в 100 мкл меченого первичного антитела. Определяют соответствующее разведение антител и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Определяют разведение антител по стандартной кривой эмпирически.
    16. После добавления антител накройте трубки фольгой, чтобы предотвратить световое воздействие на меченые антитела.
    17. После инкубации добавляют 750-1000 мкл инкубационного буфера. Пипетка вверх и вниз несколько раз.
    18. Центрифугировать ячейки в течение 5 мин при 400 х г.
    19. Повторно суспендируйте клетки с помощью пипетки P1000 и пипетки вверх и вниз 6-8 раз в каждой трубке, чтобы сломать сгустки клеток в 500 мкл PBS.
    20. Перенесите все содержимое каждой трубки (~500 мкл) в маркированные пробирки с сетчатыми фильтрами.
    21. Доведите клетки до соответствующих инструментов проточной цитометрии с помощью лазеров правильных длин волн (можете привести трубки с клетками на лед или вне его).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следует отметить, что наличие нескольких контрольных элементов важно для прогресса с измерением проточной цитометрии и анализом экспрессии генов инженерных клеток. Наличие совершенно неокрашенных клеток и клеток, окрашенных только первичными антителами, полезно для сравнения результатов с фоновыми сигналами от антител.
    22. С этого момента приступайте к анализу, как описано в разделе 5.

Результаты

Сборка генной цепи и генерация стабильной клеточной линии в рамках этой статьи были основаны на коммерческих, модифицированных клетках HEK-293, содержащих транскрипционно активный, один стабильный сайт FRT (рисунок 1). Генные цепи были построены в векторы, которые имели учас...

Обсуждение

Читатели этой статьи могут получить представление о шагах, жизненно важных для характеристики оптогенетических генных цепей (а также других систем экспрессии генов), включая 1) проектирование, построение и валидацию генных схем; 2) клеточная инженерия для введения генных цепей в стабил?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить лабораторию Балажи за комментарии и предложения, доктора Карла. Герхардта и доктора Джеффри Табора за помощь в создании первого LPA и доктора Вильфрида Вебера за то, что они поделились плазмидами LOV2-дегрона. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения [R35 GM122561 и T32 GM008444]; Центр физической и количественной биологии Лауфера; и стипендия для выпускников национальной оборонной науки и техники (NDSEG). Финансирование платы за открытый доступ: NIH [R35 GM122561].

Авторский вклад: M.T.G. и G.B. задумали проект. М.Т.Г., Д.C. и Л.Г. проводили эксперименты. M.T.G., D.C., L.G. и G.B. проанализировали данные и подготовили рукопись. Г.B. и М.Т.Г. руководили проектом.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 mL PCR tubesEppendorf951010006reagent for carrying out PCR
0.25% Trypsin EDTA 1XThermo Fisher ScientificMT25053CIreagent for splitting & harvesting mammalian cells
0.5-10 μL Adjustable Volume PipetteEppendorf3123000020tool used for pipetting reactions
100-1000 μL Adjustable Volume PipetteEppendorf3123000039tool used for pipetting reactions
20-200 μL Adjustable Volume PipetteEppendorf3123000055tool used for pipetting reactions
2-20 μL Adjustable Volume PipetteEppendorf3123000039tool used for pipetting reactions
5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer CapCorning352235reagent for flow cytometry
5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 VEppendorf22628113equipment for mammalian culture work
AgaroseDenville ScientificGR140-500reagent for gel electrophoresis
Aluminum Foils for 96-well PlatesVWR®60941-126tool used for covering plates in light-induction experiments
AmpicillinSigma AldrichA9518-5Greagent for selecting bacteria with correct plasmid
Analog vortex mixerThermo Fisher Scientific02215365PRtool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
Bacto Dehydrated AgarFisher ScientificDF0140010reagent for growing bacteria
BD LSRAriaBD656700tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations
BD LSRFortessaBD649225tool for characterizing engineered cell lines
BSA, Bovine Serum AlbumineGovernment Scientific SourceSIGA4919-1Greagent for IF incubation buffer
Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TCCorning353043plate used for growing monoclonal cells
CentrifugeVWR22628113instrument for mammalian cell culture
Chemical fume hoodN/AN/Ainstrument for carrying out IF reactions
Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lidBD353047plate used for growing monoclonal cells
CytoOne T25 filter cap TC flaskUSA ScientificCC7682-4825container for growing mammalian cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fischer ScientificBP231-100reagent used for freezing down engineered mammalian cells
Ethidium BromideThermo Fisher Scientific15-585-011reagent for gel electrophoresis
Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with LidCorning353072container for growing sorted monoclonal cells
FCS ExpressDe Novo Software:N/Asoftware for characterizing flow cytometry data
Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mLCorning35-010-CVreagent for growing mammalian cells
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mmFisher ScientificFB0875712equipment for growing bacteria
Gibco DMEM, High GlucoseThermo Fisher Scientific11-965-092reagent for growing mammalian cells
Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression AssayLife Technologies4331182qPCR Probe
Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mLLife Technologies10687-010reagent for selecting cells with proper gene circuit integration
iScript Reverse Transcription SupermixBio-Rad Laboratories1708890reagent for converting RNA to cDNA
Laboratory Freezer -20 °CVWR76210-392equipment for storing experimental reagents
Laboratory Freezer -80 °CPanasonicMDF-U74VCequipment for storing experimental reagents
Laboratory Refrigerator +4 °CVWR76359-220equipment for storing experimental reagents
LB Broth (Lennox) , 1 kgSigma-AldrichL3022-250Greagent for growing bacteria
LIPOFECTAMINE 3000Life TechnologiesL3000008reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells
MATLAB 2019MathWorksN/Asoftware for analyzing experimental data
MethanolAcros Organics413775000reagent for immunofluorescence reaction
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mLVWR20170-333plasticware container
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression AssayLife Technologies4331182qPCR Probe
MultiTherm ShakerBenchmark ScientificH5000-HCequipment for bacterial transformation
NanoDrop Lite SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND-NDL-US-CANequipment for DNA/RNA concentration measurement
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master MixNEBM0492Sreagent for PCR of gene circuit fragments
NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency)New England Biolabs (NEB)C3019Hbacterial cells for amplifying gene circuit of interest
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNew England Biolabs (NEB)E2621Lreagent for combining gene circuit fragements
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 cameraNikon Instruments Inc.N/Ainstrument for quantifying gene expression
NIS-ElementsNikon Instruments Inc.N/Asoftware for characterizing fluorescence microscopy data
oligonucleotidesIDTN/Areagent used for PCR of gene circuit components
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 ControlPanasonicMCO-170AICUVHL-PAinstrument for growing mammalian cells
Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy GradeElectron Microscopy Sciences15710-Sreagent
PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x)Invitrogen14190144reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100xFisher Scientific15140-122reagent for growing mammalian cells
primary ERK antibodyCell Signaling Technology4370Sprimary ERK antibody for immunifluorescence
primary KRAS antibodySigma-AldrichWH0003845M1primary KRAS antibody for immunifluorescence
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)Qiagen27106reagent kit for purifying gene circuit plasmids
QIAquick Gel Extraction Kit (50)Qiagen28704reagent kit for purifying gene circuit fragments
QuantStudio 3 Real-Time PCR SystemEppendorfA28137equipment for qRT-PCR
Relative Quantification AppThermo Fisher ScientificN/Asoftware for quantifying RNA/cDNA amplificaiton
RNeasy Plus Mini KitQiagen74134kit for extracting RNA of engineered mammalian cells
Secondary ERK antibodyCell Signaling Technology8889Ssecondary ERK antibody for immunifluorescence
secondary KRAS antibodyInvitrogenA11005secondary KRAS antibody for immunifluorescence
Serological Pipets 5.0 mLOlympus Plastics12-102reagents used for setting up a variety of chemical reactions
SmartView Pro Imager SystemMajor ScienceUVCI-1200tool for imaging correct PCR bands
SnapGene Viewer (free) or SnapGeneSnapGeneN/Asoftware DNA sequence design and analysis
Stage top incubatorTokai HitINU-TIZtool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444557reagent for PCR of gene circuit fragments
TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxnLife Technologies4326317EqPCR Probe
ThermocyclerBio-Rad1851148tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture TreatedPerkinElmer1450-605plate used for light-induction experiments
VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cmVWR14673-010reagent for mammalian cell culture
VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel SystemVWR89032-290equipment for DNA gel electrophoresis
Flp-In 293Thermo Fisher ScientificR75007Engineered cell line with FRT site

Ссылки

  1. Sedlmayer, F., Hell, D., Muller, M., Auslander, D., Fussenegger, M. Designer cells programming quorum-sensing interference with microbes. Nature Communications. 9 (1), 1822 (2018).
  2. Cho, J. H., Collins, J. J., Wong, W. W. Universal chimeric antigen receptors for multiplexed and logical control of T cell responses. Cell. 173 (6), 1426-1438 (2018).
  3. Saxena, P., et al. A programmable synthetic lineage-control network that differentiates human IPSCs into glucose-sensitive insulin-secreting beta-like cells. Nature Communications. 7, 11247 (2016).
  4. Nevozhay, D., Zal, T., Balazsi, G. Transferring a synthetic gene circuit from yeast to mammalian cells. Nature Communications. 4, 1451 (2013).
  5. Chang, H. H., Hemberg, M., Barahona, M., Ingber, D. E., Huang, S. Transcriptome-wide noise controls lineage choice in mammalian progenitor cells. Nature. 453 (7194), 544-547 (2008).
  6. Balazsi, G., van Oudenaarden, A., Collins, J. J. Cellular decision making and biological noise: from microbes to mammals. Cell. 144 (6), 910-925 (2011).
  7. Lee, J., et al. Network of mutually repressive metastasis regulators can promote cell heterogeneity and metastatic transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 364-373 (2014).
  8. Dar, R. D., Hosmane, N. N., Arkin, M. R., Siliciano, R. F., Weinberger, L. S. Screening for noise in gene expression identifies drug synergies. Science. 344 (6190), 1392-1396 (2014).
  9. Becskei, A., Seraphin, B., Serrano, L. Positive feedback in eukaryotic gene networks: cell differentiation by graded to binary response conversion. EMBO Journal. 20 (10), 2528-2535 (2001).
  10. Nevozhay, D., Adams, R. M., Murphy, K. F., Josic, K., Balazsi, G. Negative autoregulation linearizes the dose-response and suppresses the heterogeneity of gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5123-5128 (2009).
  11. Guinn, M. T., Balazsi, G. Noise-reducing optogenetic negative-feedback gene circuits in human cells. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7703-7714 (2019).
  12. Shimoga, V., White, J. T., Li, Y., Sontag, E., Bleris, L. Synthetic mammalian transgene negative autoregulation. Molecular Systems Biology. 9, 670 (2013).
  13. Ye, H., Daoud-El Baba, M., Peng, R. W., Fussenegger, M. A synthetic optogenetic transcription device enhances blood-glucose homeostasis in mice. Science. 332 (6037), 1565-1568 (2011).
  14. Pudasaini, A., El-Arab, K. K., Zoltowski, B. D. LOV-based optogenetic devices: light-driven modules to impart photoregulated control of cellular signaling. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 18 (2015).
  15. Liu, Y., et al. Robust and intensity-dependent synaptic inhibition underlies the generation of non-monotonic neurons in the mouse inferior colliculus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 131 (2019).
  16. Benzinger, D., Khammash, M. Pulsatile inputs achieve tunable attenuation of gene expression variability and graded multi-gene regulation. Nature Communications. 9 (1), 3521 (2018).
  17. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  18. Duan, L., et al. Understanding CRY2 interactions for optical control of intracellular signaling. Nature Communications. 8 (1), 547 (2017).
  19. Kim, N., et al. Spatiotemporal control of fibroblast growth factor receptor signals by blue light. Chemistry & Biology. 21 (7), 903-912 (2014).
  20. Jung, H., et al. Noninvasive optical activation of Flp recombinase for genetic manipulation in deep mouse brain regions. Nature Communications. 10 (1), 314 (2019).
  21. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. Light-inducible gene regulation with engineered zinc finger proteins. Methods in Molecular Biology. 1148, 89-107 (2014).
  22. Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo activities of light-inducible dimers: A cellular optogenetics guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
  23. Lee, D., Hyun, J. H., Jung, K., Hannan, P., Kwon, H. B. A calcium- and light-gated switch to induce gene expression in activated neurons. Nature Biotechnology. 35 (9), 858-863 (2017).
  24. Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
  25. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546 (2016).
  26. Chen, R., et al. Rhythmic PER abundance defines a critical nodal point for negative feedback within the circadian clock mechanism. Molecular Cell. 36 (3), 417-430 (2009).
  27. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  28. Sato, T. K., et al. Feedback repression is required for mammalian circadian clock function. Nature Genetics. 38 (3), 312-319 (2006).
  29. Kramer, B. P., Fischer, C., Fussenegger, M. BioLogic gates enable logical transcription control in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 478-484 (2004).
  30. Madar, D., Dekel, E., Bren, A., Alon, U. Negative auto-regulation increases the input dynamic-range of the arabinose system of Escherichia coli. BMC Systems Biology. 5, 111 (2011).
  31. Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, 35363 (2016).
  32. Szczesny, R. J., et al. Versatile approach for functional analysis of human proteins and efficient stable cell line generation using FLP-mediated recombination system. PLoS One. 13 (3), 0194887 (2018).
  33. Taxis, C. Development of a synthetic switch to control protein stability in eukaryotic cells with light. Methods in Molecular Biology. 1596, 241-255 (2017).
  34. Grav, L. M., et al. Minimizing clonal variation during mammalian cell line engineering for improved systems biology data generation. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2148-2159 (2018).
  35. Brophy, J. A., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nature Methods. 11 (5), 508-520 (2014).
  36. Yeoh, J. W., et al. An automated biomodel selection system (BMSS) for gene circuit designs. ACS Synthetic Biology. 8 (7), 1484-1497 (2019).
  37. Usherenko, S., et al. Photo-sensitive degron variants for tuning protein stability by light. BMC Systems Biology. 8, 128 (2014).
  38. Muller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. An optogenetic upgrade for the Tet-OFF system. Biotechnology and Bioengineering. 112 (7), 1483-1487 (2015).
  39. Klotzsche, M., Berens, C., Hillen, W. A peptide triggers allostery in tet repressor by binding to a unique site. Journal of Biological Chemistry. 280 (26), 24591 (2005).
  40. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  41. Herrou, J., Crosson, S. Function, structure and mechanism of bacterial photosensory LOV proteins. Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 713-723 (2011).
  42. Yao, F., et al. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Human Gene Therapy. 9 (13), 1939-1950 (1998).
  43. Erlich, H. A. . PCR technology : Principles and Applications for DNA Amplification. , (1989).
  44. Sambrook, J., Russell, D. W., Sambrook, J. . The condensed protocols from Molecular cloning : a laboratory manual. , (2006).
  45. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  46. Gerhardt, K. P., Castillo-Hair, S. M., Tabor, J. J. DIY optogenetics: Building, programming, and using the Light Plate Apparatus. Methods in Enzymology. 6224, 197-226 (2019).
  47. Stockley, J. H., et al. Surpassing light-induced cell damage in vitro with novel cell culture media. Scientific Reports. 7 (1), 849 (2017).
  48. Gordon, A., et al. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nature Methods. 4 (2), 175-181 (2007).
  49. Ordovas, L., et al. Efficient recombinase-mediated cassette exchange in hPSCs to study the hepatocyte lineage reveals AAVS1 locus-mediated transgene inhibition. Stem Cell Reports. 5 (5), 918-931 (2015).
  50. Gomez Tejeeda Zanudo, J., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).
  51. Sweeney, K., Moreno Morales, N., Burmeister, Z., Nimunkar, A. J., McClean, M. N. Easy calibration of the Light Plate Apparatus for optogenetic experiments. MethodsX. 6, 1480-1488 (2019).
  52. Ravindran, P. T., Wilson, M. Z., Jena, S. G., Toettcher, J. E. Engineering combinatorial and dynamic decoders using synthetic immediate-early genes. Communications Biology. 3 (1), 436 (2020).
  53. Chen, X., Wang, X., Du, Z., Ma, Z., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression in mammalian cells and in mice using the LightOn system. Current Protocols in Chemical Biology. 5 (2), 111-129 (2013).
  54. Guinn, M. T. Engineering human cells with synthetic gene circuits elucidates how protein levels generate phenotypic landscapes. State University of New York at Stony Brook. , (2020).
  55. Farquhar, K. S., et al. Role of network-mediated stochasticity in mammalian drug resistance. Nature Communications. 10 (1), 2766 (2019).
  56. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemistry & Biology. 11 (3), 198-200 (2015).
  57. Guinn, M. T., et al. Observation and control of gene expression noise: Barrier crossing analogies between drug resistance and metastasis. Frontiers in Genetics. 11, 586726 (2020).
  58. Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342 (6163), 1193-1200 (2013).
  59. Rullan, M., Benzinger, D., Schmidt, G. W., Milias-Argeitis, A., Khammash, M. An optogenetic platform for real-time, single-cell interrogation of stochastic transcriptional regulation. Molecular Cell. 70 (4), 745-756 (2018).
  60. Perkins, M. L., Benzinger, D., Arcak, M., Khammash, M. Cell-in-the-loop pattern formation with optogenetically emulated cell-to-cell signaling. Nature Communications. 11 (1), 1355 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

173

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены