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要約

光応答性哺乳動物細胞を確実に制御するには、光遺伝学的方法の標準化が必要です。この目標に向けて、本研究では、ネガティブフィードバック光遺伝学遺伝子回路を用いた光誘導遺伝子発現の研究を標準化するための遺伝子回路構築、細胞工学、光遺伝学的装置操作、検証アッセイのパイプラインをケーススタディとして概説する。

要約

哺乳動物細胞における信頼性の高い遺伝子発現制御には、使用される方法に関係なく、高いフォールド変化、低ノイズ、および決定された入力-出力伝達関数を備えたツールが必要です。この目標に向けて、哺乳類細胞におけるタンパク質レベルの時空間制御のために、光遺伝学的遺伝子発現系が過去10年間に多くの注目を集めてきた。しかし、光誘導遺伝子発現を制御する既存の回路のほとんどは、構造が異なり、プラスミドから発現され、可変光遺伝学的装置を利用するため、安定した細胞株における光遺伝学的構成要素の特性評価および標準化を検討する必要性が生じている。ここで、本研究は、事例例としてネガティブフィードバック光遺伝学回路を使用して、哺乳動物細胞における光誘導性遺伝子発現を制御するための信頼性の高い遺伝子回路構築、統合、および特性評価の実験パイプラインを提供する。また、これらのプロトコルは、光遺伝学的装置と光レジームを標準化することで、遺伝子発現ノイズやタンパク質発現の大きさなどの遺伝子回路の特徴を確実に明らかにする方法も示しています。最後に、この論文は、光遺伝学に不慣れな研究室で、そのような技術を採用したいと考えている人にとっては役に立つかもしれません。ここで説明するパイプラインは、哺乳動物細胞における他の光遺伝学的回路に適用され、哺乳動物細胞における転写、プロテオミクス、そして最終的には表現型レベルでの遺伝子発現のより信頼性が高く、詳細な特徴付けおよび制御を可能にするべきである。

概要

他の工学分野と同様に、合成生物学はプロトコルを標準化し、再現性の高い機能を持つツールを生物学的システムに関連する質問の探求に利用できるようにすることを目指しています1,2。多くの制御システムが構築されてきた合成生物学の1つの領域は、遺伝子発現調節の領域です3,4。遺伝子発現制御は、生理学的および病理学的細胞状態におけるそれらの役割のために重要な細胞特性であるタンパク質レベルおよび変動性(ノイズまたは変動係数、CV = σ/μ、平均に対する標準偏差として測定)の両方を標的とすることができる5,6,7,8。タンパク質レベルとノイズを制御できる多くの合成システム4,9,10,11,12が設計されており、ツール間でプロトコルを標準化する機会を生み出しています。

最近出現した遺伝子ネットワークを制御できる新しいツールセットの1つは光遺伝学であり、光を使用して遺伝子発現を制御することを可能にします13,14,15,16,17。それらの化学的前任者と同様に、光遺伝学的遺伝子回路は、細菌から哺乳動物に至るまで、あらゆる細胞型に導入することができ、目的の任意の下流遺伝子の発現を可能にする18,19。しかしながら、新規な光遺伝学的ツールの急速な生成により、遺伝子回路アーキテクチャ、発現機構(例えば、プラスミドベース対ウイルス統合)、および光供給制御装置において変化する多くのシステムが出現している11、16、20、21、22、23、24、25.そのため、遺伝子回路の構築や最適化、システム利用方法(統合と一過性発現など)、誘導に用いる実験ツール、結果解析など、光遺伝学的特徴の標準化の余地が残されています。

哺乳動物細胞における光遺伝学的プロトコルの標準化を進めるために、このプロトコルは、HEK293細胞(ヒト胚性腎臓細胞株)に組み込まれた負帰還(NF)遺伝子回路を用いて哺乳動物細胞における光遺伝学的システムを工学的にエンジニアリングする実験パイプラインを例に記述している。NFは、本質的に非常に豊富であるため、標準化を実証するのに理想的なシステムです26,27,28、タンパク質レベルを調整し、ノイズを最小限に抑えることができます。要するに、NFは、リプレッサーがそれ自身の発現を十分に速く減少させることによって正確な遺伝子発現制御を可能にし、それによって定常状態から離れるあらゆる変化を制限する。定常状態は、リプレッサーを不活性化または排除するインデューサーによって変更され、各インデューサー濃度に対して新しい定常状態に達するまで、より多くのタンパク質生産を可能にすることができる。最近、遺伝子発現の広い動的応答を生成し、低ノイズを維持し、空間的遺伝子発現制御の可能性を可能にする光刺激に応答することができる、操作されたNF光遺伝学的システムが作成された11。光誘導チューナー(LITers)として知られるこれらのツールは、生細胞における遺伝子発現制御を可能にする以前のシステムに触発され4、10、29、30、およびヒト細胞株に安定して統合され、長期的な遺伝子発現制御を確実にした。

ここでは、LITerを例にとり、光応答性遺伝子回路を作成し、ライトプレート装置(LPA、光遺伝学的誘導ハードウェア)31を用いて遺伝子発現を誘導し、操作された光遺伝学的に制御可能な細胞株のカスタム光刺激に対する応答を分析するためのプロトコルを概説する。このプロトコルにより、ユーザーはLITerツールを利用して、探索したい機能遺伝子を使用することができます。また、以下に概説する方法および光遺伝学的装置を統合することによって、多様な回路アーキテクチャ(例えば、正帰還、負調節など)を有する他の光遺伝学的システムに適合させることもできる。他の合成生物学プロトコルと同様に、ここで概説するビデオ録画および光遺伝学的プロトコルは、癌生物学、胚発生、および組織分化を含むがこれらに限定されない、多様な分野の単一細胞研究に適用することができる。

プロトコル

1. 遺伝子回路設計

  1. 単一の遺伝子回路/プラスミドに結合する遺伝的構成要素(例えば、哺乳動物DNA組み込み配列モチーフ32、光応答性エレメント33、または機能遺伝子34)を選択する。
  2. 遺伝子工学および/または分子クローニングソフトウェアを使用して、後で使用するためにDNA配列を保存し、参照し、各配列に注釈を付け、必要なすべての特徴(例えば、STARTコドン、調節、または翻訳配列)を調べる35。
  3. 全体的な遺伝子回路設計に従って部品を開発または採用する36。一例として、LITers11のような光遺伝学的リプレッサーの場合、リプレッサー遺伝子(例えばTetR)4に隣接し、かつフレーム内に、光誘導性分解37、38またはリプレッサーのDNA結合能39の不活性化が可能なドメインをコードする遺伝子配列を融合させる。
    1. 光遺伝学的アクチベーターの場合、光誘導DNA結合時に遺伝子発現を促進するアクチベータードメイン40 の存在を確認する41。陰性または陽性の自己調節のために、調節遺伝子のプロモーター内または上流に調節結合部位(例えば、TetR発現プロモーター内または上流のtetO部位)が存在することを確認する42。
  4. 各遺伝子回路の分子クローニングソフトウェアを使用して、プラスミドのDNA配列増幅または配列決定のためのプライマーを設計します。
  5. 分子クローニングソフトウェアの組み込みのごちそう(配列アライメントなど)を通じて、プラスミド構築のためのプライマーを計算的に検証します。
  6. オリゴヌクレオチドプライマーを製造業者に注文する。本作で構築・使用したプラスミドは、設計・使用したプライマーとともに、元の支持材11 に見出すことができます。
  7. プライマーを二重蒸留水(ddH2O)で100 mMストック濃度に希釈する。
  8. PCRのために100 mMストックプライマーのストックを10 mM濃度に希釈する。
  9. ゲノムの場合は 0.5 ~ 500 ng、プラスミドまたはウイルス DNA の場合は 0.5 pg-5 ng の総質量に対する 1 μL の鋳型 DNA、12.5 μL の DNA ポリメラーゼ 2x マスターミックス (またはメーカーの希釈倍率を満たす容量)、および 9.5 μL の ddH2O (総反応容量 25 μL) で PCR ミックスを調製します。
  10. PCRミックスをサーモサイクラーで、選択した酵素に応じて適切な設定でインキュベートします43。推奨される反応サイクルは次のとおりです。
    工程1:95°Cで30s初期変性工程を1サイクル。
    工程2:98°Cで5sの変性工程を40サイクル。
    工程3:65°Cで30秒のアニーリング工程を1サイクル(先に設計したプライマーにより決定)。
    ステップ4:72°Cで1分間の伸長の1サイクル(〜1キロベース(kb)テンプレート断片長)。
    ステップ5:72°Cで2分間の延長を1サイクル行う。
    ゲル電気泳動で試験できるようになるまで反応物を4°Cに保持する。このプロトコルは、使用される試薬(例えば、ポリメラーゼおよび緩衝液)に応じて変化する。
  11. ステップ 1.9 を繰り返して、リニア PCR 産物を単一の円形 DNA ベクターに連結するために必要な DNA アセンブリ反応に使用するすべてのフラグメントを増幅します。
  12. PCR産物を1%アガロースゲル上で実行し、続いて所望の長さのバンドを精製する。
  13. DNA集合反応用のマスターミックスを調製する(表1)。
    注: この例では、マザーベクターは 2 つのフラグメントに分割され、組み立て結果全体に大きな変化を生じさせることなく、PCR ステップの効率が向上します。
  14. DNA集合反応マスターミックスを50°Cのサーモサイクラー中で1時間インキュベートし(DNA集合試薬プロトコルで特に指定がない限り)、反応物を4°Cで保存して反応生成物を細菌形質転換に使用する。
  15. 有能な大腸菌(大腸菌)細胞および対応する細菌形質転換プロトコルを使用して、細菌形質転換(化学的またはエレクトロポレーション)を設定します。形質転換後、選択した細菌選択マーカー(例えば、アンピシリン)を含む細菌ルリア・ベルタニ(LB)寒天プレートを使用して、形質転換ミックスをプレートします。プレートを37°Cで一晩インキュベートする44。
  16. 翌日プレートを確認してください。コロニーを接種するには、プレートから個々のコロニーをピックアップし、培養チューブ内の対応する細菌選択マーカーを含む液体LBブロスに再懸濁する。シェーカーインキュベーター中で37°C、300rpmで一晩インキュベートする。
  17. プラスミド調製プロトコールを行い、細菌培養物からプラスミドDNAを抽出する。
  18. 回路を 2 つのステップで検証します。まず、粗精製として制限酵素を用いた試験消化を行い、おおよそのプラスミド産物が得られたか否かを確認する。次に、テスト消化に合格/確認された場合は、プラスミドをサンガーシーケンシング施設(または利用可能な機器を使用したプロセス)に提出して正確なDNA配列を取得し、後で設計ソフトウェアで予想される配列と比較します。
    1. テスト消化を実行するには、使用する分子クローニングソフトウェアに基づいて、少なくとも2つのフラグメントを生成する少なくとも2つの制限酵素を選択します。酵素を選択したら、使用する酵素に応じて、各酵素1 μL、生成されたDNA5 μL、および水13 μLと適切な塩とバッファーを加えて、試験サンプルを調製します。反応物を37°Cで1時間、または酵素メーカーが示唆するようにインキュベートする。1%アガロースゲル上で試験消化産物を実行し、バンドが正しいかどうかを判断します。
      メモ: バンドが正しい場合は、シーケンスに進みます。
    2. シーケンシングを行うには、ソフトウェアに保存されたDNAに基づいてプライマーを生成し、プライマーのアニーリング領域が約500 bp(塩基対)離れ、目的のフラグメント(遺伝子回路コンポーネント)またはフルプラスミドをカバーするようにします。プライマーを純粋なヌクレアーゼフリー水(NF-H2O)で10mM濃度に希釈する。1 μL の 10 ng/μL の DNA、1 μL のプライマー、および 8 μL の NF-H2O を 0.2 mL チューブに追加してシーケンシングサンプルを調製します。プライマーごとにこれを繰り返します。
      注:サンプルが調製されたら、シーケンシング施設にサンプルを降ろし、分子クローニングソフトウェアを使用して結果をプラスミド配列と比較します。
  19. このステップでは、遺伝子回路を含むプラスミドを適切な細胞株に組み込むための約100〜1000ng/μLのDNAサンプルを生成します。

2. 安定した細胞株工学

  1. 哺乳動物発現ベクターから目的のタンパク質の高レベル発現を保証する安定したサブラインの迅速な生成のために設計された哺乳動物細胞株を注文する。細胞の種類と細胞株エンジニアリングの容易さは、ユーザーが何を好むか、または達成しようとしているかに応じて可変であり得る。
    1. 例えば、ユーザーが最小限の中間ステップで細胞株エンジニアリングを好む場合、単一の安定な集積部位(例えば、FRT)を含む細胞を転写活性ゲノム遺伝子座で注文する。より微妙な細胞工学が望ましい場合は、CRISPR/Cas9などの遺伝子工学ツールを使用して、好ましい場所に統合サイトを作成します。
  2. 37°Cの加湿空気中の5%CO2 中で細胞を増殖させる。 細胞型に応じて増殖条件を調整します。
  3. 上記のステップから得られた所望の細胞に上記で設計した遺伝子回路をトランスフェクトして、安定した細胞株生成プロセスを開始する。これを達成するために、遺伝子回路DNAのリポソーム混合物45 を適切なリコンビナーゼ(例えば、Flp−FRT組換えのためのFlp−リコンビナーゼ)と共に、またはエレクトロポレーションなどの他の方法を介して使用する。
  4. トランスフェクションの2日後、細胞を25%コンフルエントに分割した。
  5. 細胞を分裂してから6時間後、培地を50μg/mLのハイグロマイシン抗生物質(またはプラスミド構築中に選択された哺乳動物の抗生物質耐性遺伝子に対応する別の抗生物質剤)を含む新鮮な培地に交換することによって抗生物質の選択を開始する。
    注:遺伝子回路構築に利用される哺乳類抗生物質耐性遺伝子には様々なものがあり、それぞれが異なる殺傷曲線を有する。したがって、どの哺乳類の抗生物質耐性遺伝子が回路構築のために選択されても、目的の細胞において適切な死滅曲線が研究されるべきである。このステップにより、遺伝子回路ペイロードを含む細胞が濃縮され、システムを持たない細胞が確実に排除されます。
  6. 細胞が抗生物質選択培地中で増殖するのを許し、プレートまたはフラスコが数十の病巣を有するまで2〜3日ごとに新鮮な培地に交換する。付着した培養物が合流点に達する前に対数段階にあるときの通過。
  7. 病巣が十分に多くなったら、カルシウム、マグネシウム、炭酸水素ナトリウムを含まないハンクス平衡塩溶液(HBSS)中の0.25%トリプシン、0.1%EDTAの1mLで細胞を数分間トリプシン処理します。新鮮な培地でトリプシンを中和し、すべての細胞を新鮮な容器に入れます。
  8. 新鮮な容器内の細胞が80%〜100%コンフルエントになったら、45%の古い培地、45%の新鮮な培地、および10%のDMSOの混合物でそれらを凍結する。残りの細胞を滅菌チューブに移し、単一細胞選別を行い、モノクローナル細胞を96ウェルプレートに単離する。
  9. モノクローナル選別後約2〜3週間で、96ウェルプレート内のウェルは病巣を有するはずである。約50%〜60%コンフルエントになったら、細胞を12ウェルプレートに分割する。
  10. 12穴プレートが80%~100%コンフルエントになったら、組織培養処理したT-25フラスコに分割する。T-25フラスコ内の細胞が80%~100%コンフルエントになったら、細胞を凍結し、モノクローナル細胞株の特性評価および試験のために継代を維持します。
    1. 顕微鏡法およびフローサイトメトリーアッセイによってモノクローナル細胞株を特徴付け、誘導された蛍光レポーター産生に基づいて遺伝子発現プロファイルを報告する。蛍光抗体標識および免疫蛍光アッセイによる機能的タンパク質産生の検証。定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)を介して転写レベルの遺伝子発現誘導を試験する。クローンの局所および全ゲノムシーケンシングを介して遺伝子配列と統合精度を検証します。

3. ライトプレート装置誘導アッセイ

  1. 操作された細胞の光誘導に使用されるLPA装置31、46 を構築する。簡単に言えば、遺伝子発現を制御するために使用するLPAを作成するためには、いくつかの広範なステップが不可欠です。これらには、LPAフレームコンポーネントの3Dプリント、回路基板の構築、マイクロコントローラプログラマによる回路のプログラミング、コンポーネントを最終的なLPAに組み立てること、IRISソフトウェアを介したメモリカードのプログラミング、および完成したデバイスの較正が含まれます。より詳細な説明については、上記の参考文献を参照してください。
    1. Gerhardt et al. (2016 and 2019)31,46 で概説されているように 3D パーツを印刷します。
    2. Gerhardt et al. (2016 and 2019)31,46に概説されているように回路基板を組み立てる。
    3. Gerhardt et al. (2016 and 2019)31,46に概説されているように、マイクロコントローラプログラマを使用してアセンブリされたLPA回路にファームウェアを追加します。
    4. Gerhardt et al. (2016 and 2019)31,46に概説されているように、3Dプリントされた部品と組み立てられた回路基板を組み合わせる。これには、取り付けプレート、回路基板、LED(発光ダイオード)スペーサー、プレートアダプター、24ウェルプレート、プレート蓋、取り付けボルト、およびフィルム化されたビデオおよび図2に示すように、ウィングナットおよび積層部品の撮影が含まれる。
    5. デバイスのメモリカードのプログラミングとキャリブレーションについては、以下の手順に従ってください。
  2. Tabor Lab の Web サイト47 にある IRIS ソフトウェアを使用して、ライト プレート デバイス (LPA)31 用の SD カードをプログラムし、光遺伝学的実験を開始するために必要な適切な光条件を調べます。
    注:IRISソフトウェアは、Tabor Labによって開発されたLPAとして知られる光遺伝学的電子ハードウェアをプログラミングするためのWebベースのアプリケーションです。このソフトウェアでは、LPAハードウェアの各ウェル内の個々の発光ダイオード(LED)を制御する相対IRIS値をプログラミングできます。
  3. LPA(4 x 6)ドロップダウンオプションを選択し、適切な照明アプローチ(定常状態、ダイナミック、アドバンスト)をクリックします。
    注:この原稿では、すべてのアッセイが定常状態の例に焦点を当てます。ただし、高度な設定例は、パルス持続時間とデューティサイクルレジームに使用できます。
  4. プレートのウェルに対応するセルに値を入力して、上部または下部のLEDを点灯させるかどうかを選択します。本研究で使用したLPAについては、全ての実験で最上部に配置した青色LEDを用いた。各LEDは、一度プログラムされると、一定の光強度で連続的な光露光を提供することができます。IRISソフトウェアは、プログラム可能な4096強度レベルを可能にします。
  5. LEDの位置を選択したら、目的の実験アウトラインの強度値を入力します。たとえば、プレートごとに3つの技術反復で8つの異なる光強度(またはパルス持続時間またはデューティサイクル)を入力します(表2)。G.s.はグレースケール単位、つまりIRISソフトウェアのLPAプログラミングに使用される光強度レベルの測定値を指します。
    1. IRIS実験ファイルを設計するときは、LPA装置上の隣接するウェルからのエッジ効果、青色光曝露の強度の増加による光毒性、および所望の用量反応のタイプ(例えば、単調対非単調)の決定に留意してください。
    2. ユーザーがLPA内の細胞を特定の光パラメータ(例えば、強度)の昇順/降順でプログラムする場合、ウェルは光クロストークのエッジ効果または隣接するウェルに影響を与える可能性のある熱さえも生じ得る。これは、実験が完了したときに測定された出力の結果に誤って影響を与える可能性があります。これを軽減するために、ユーザーはIRISソフトウェアにランダム化行列を実装して、適切な位置をスクランブルし、エッジの影響を最小限に抑えることができます。例については、下記の代表結果(図4A-B)で説明します。
    3. さらに、より高い強度の青色光は、細胞の成長および生存率を妨げることが見出されている48。したがって、光毒性を緩和するには、調査対象のモダリティに応じて光強度、パルス持続時間、またはデューティサイクル応答曲線を生成することが重要です。
      1. 例えば、24ウェルプレート当たり3回の反復で8つの光強度値をプログラムし、無光からLPAの最大強度までの範囲を有する。次に、これらのサンプルをSSC-FSCゲートまたはヨウ化プロピジウムなどのライブ染色剤を備えたフローサイトメーターで実行し、各光値で集団細胞の生存(死細胞/細胞破片を含む総事象と比較した生細胞)を定量化します。
      2. 次に、任意の刺激が増殖、遺伝子発現、または生存に悪影響を及ぼす可能性があるため(例えば、適切なトレードオフとして80%の細胞生存率を設定する)、実験セットアップのための理想的な集団生存量を決定する。例えば、この作業では、一旦較正されると、強度は3000g.s.単位(LPA装置の最大強度の約3/4)を超えなかった。その一例については、以下の代表的な結果で説明します。
    4. 毒性のために光値を制限することに加えて、ユーザーは、単調応答の範囲など、用量反応の特定の部分を特徴付けるために光値を制限したい場合があります。
      1. これを達成するために、所望の用量反応を決定する際に分析されるモダリティに応じて広範囲の光強度、パルス持続時間またはデューティサイクルを最初にスキャンし(表2)、目的の光レジームに絞り込む(例えば、遺伝子発現が単調な用量応答のための光値の増加と正の相関する場合)。
      2. 目的の光範囲を決定するには、複数のLPAが同等の光量を供給するように較正され、以下に概説する細胞培養作業またはアッセイを続行するかどうかに応じて、異なる強度/パルス持続時間/デューティサイクル/等またはそれ以上のウェル(例えば、48、72、96など)の最大24ウェルを有する単一のLPAをプログラムする。したがって、広い用量範囲の光刺激による光遺伝学的システムの特性評価を開始して、所望の遺伝子発現を与える範囲間隔を決定し、続いてその洗練された用量範囲で実験を行う。
      3. 例えば、この研究では、3000gs単位が有毒な光強度の閾値として決定されると、この閾値を、以下に概説するアッセイ(例えば、免疫蛍光)のための光の上限として使用した。
        注:上記の手順は、LPAの光学較正とは無関係であり、各光遺伝学系の分子レベルの較正を参照しています。
  6. 適切な光強度の値をIRISでプログラムしたら、USB 3.0コンセント付きのメモリカードをLPAに挿入して、ファイルをダウンロードして転送します。
  7. LPAの較正が完了したら31、光誘導アッセイの開始のための細胞培養作業に進む。キャリブレーションが行われていない場合は、マイクロコントローラプログラマでLPAをプログラムしたら、画像解析方法(ステップ3.7.1~3.7.3)を使用してLPAをキャリブレーションします。
    1. Gerhardt et al. (2016)31 によって記述されたのと同じ IRIS レベルを持つように LPA を簡潔にプログラムします。
      注: 較正のために、LPA は 2000 g.s の値を持つようにプログラムされました。
    2. デバイスがメモリカードでプログラムされ、リセットボタン(LPA上の物理ボタン)が押されたら、デバイス全体(例えば、ゲルステーションイメージャ、スキャナデバイスなど)の画像を取得します。キャリブレーションでは、デバイスを180°回転させた状態で2つの画像を取得します。
    3. 次に、Gerhardt et al. (2016)31 によって設計されたオープンソースソフトウェアを使用して、LPAプレート上のLED強度の変動性を示し、LED補償値を計算してウェル間で強度を等しくします。この例は、以下の表される結果で説明されています(図3)。この較正が完了したら、光誘導アッセイの開始のための細胞培養作業に進む。
  8. 前のセクションから操作されたモノクローナル細胞のフラスコを入手し、遺伝子発現に対する光誘導効果を調べます。
  9. フラスコから古いメディアを取り出します。
  10. 1mLのトリプシンを細胞に加え、5分間インキュベートする。
  11. 5分後、必要な化学物質を添加したダルベッコ修飾イーグル培地(DMEMまたは他の所望の培地)を4mL加えてトリプシンを中和する(この研究は、50μg/mLのハイグロマイシン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン溶液、10%ウシ胎児血清、FBSを使用した)。
  12. 500 μLの総容量で24ウェルの黒色プレートに1ウェルあたり約75,000個の細胞を加える。播種される細胞の数は、所望の実験の持続時間および使用される細胞型に応じて変化し得る。
    注:さらに、細胞播種密度は培養の維持および潜在的に実験の持続時間に影響を及ぼすことに留意されたい。ウェルあたりの細胞数を減らすことで、培養がコンフルエントに達するまでの時間が長くなります。さらに、目的の遺伝子回路に組み込まれた光遺伝学的構成要素の種類は、遺伝子発現が定常状態に達する時期に影響を与え、したがって実験の持続時間に影響を及ぼす。考慮され得る他の因子は、細胞株特異的増殖速度、培地組成、および条件付き増殖効果(すなわち、光)である。
  13. プレーティング後、細胞を5%CO2 の加湿インキュベーターに入れて、2〜6時間沈降させます。
  14. インキュベーション後、細胞を組織培養フードに移し、プラスチック製の蓋を外し、プレートの上部に接着箔ストリップを追加します(図2D)。このステップでは、ウェルの上部と側面がコーティングされているため、ウェル間の光移動を最小限に抑えることができ、LEDが配置されているウェルの下部からのみ光が入るようになりました。
  15. LPA の取り付けられた 3D パーツにプレートを置きます。次に、3D プリントされた LPA の蓋でプレートを覆い、各コーナーのデバイスのネジにフィットします。
  16. デバイスを電源に接続し、LPA デバイスのリセット ボタンを押して、更新された LPA 実験設定が適用されていることを確認します。
  17. 実験系内で細胞を、元の播種密度、細胞株特異的増殖速度、および増殖条件に応じて、適切な時間インキュベートする。この例では、細胞株を、遺伝子発現が定常状態に達するまで3日間連続して誘導した。しかしながら、多くの光遺伝学的システム(例えば、VVD)は、はるかに早く(例えば、24時間)定常状態の遺伝子発現に達する可能性があり、したがって、実験誘導時間は、必要に応じて短縮または延長され得ることに留意すべきである。
  18. 光誘導実験の最後に、以下の4つのアッセイのいずれかにサンプルを利用して、操作された細胞株を特徴付ける(セクション4〜7)。

4. 光誘導操作細胞の蛍光顕微鏡

  1. 誘導後24〜72時間、LPA中の細胞をインキュベーターから取り出し、組織培養フードに入れる。
  2. ホイルストリップを取り外し、プレートを1〜2分間放置します。これにより、プレートにすぐに置いた場合、プラスチック製の蓋に結露が形成されるのを防ぎます。
  3. 1〜2分座った後、元のプラスチック製の蓋をプレートに戻します。
  4. 適切な位相差顕微鏡または蛍光顕微鏡で細胞を画像化する。
  5. 機器に応じて、露光時間、光源強度、および操作されたセルを表示するためのゲインを調整します。この実験では、以下のパラメータを適用した:FITC / GFP(緑色蛍光タンパク質)光源露光時間に対して50ms、およびそれぞれ100%強度での位相コントラスト露光時間に対して1〜5ms。
    注:最適な露光時間、ゲインレベル、および光源強度は、蛍光レポーターの過飽和を最小限に抑え、細胞損傷を最小限に抑え、定性的および定量的分析のための適切な画像をキャプチャするために、この研究の経験から経験的に導出されることが多いことに留意すべきである。これらの各パラメータのレベルを決定する際に留意すべき側面には、信号対雑音比の最大化、光毒性の最小化、蛍光信号の過飽和の最小化、および弱い蛍光信号の増幅能力の増加が含まれる。
    1. これらのパラメータをひどくアドホックに最適化します。しかしながら、以前の実験値(例えば、蛍光レポーターの過飽和を引き起こす光源強度)は、適用可能な場合、将来の実験設定を導くことができる。例えば、1つの回路(LITer1.0)または実験セットアップ(例えば、光強度)からのゲイン設定、露光時間、および光強度初期値は、類似しているが異なる遺伝子回路(LITer2.0)11 または異なる光モダリティ(例えば、光デューティサイクル)に移動する際の出発点として使用することができる。
  6. 顕微鏡ソフトウェアにプログラムされた座標テンプレートによってプレートイメージングを合理化し、プレートサイズ全体(例えば、24ウェル)がウェルごとに複数の画像位置からの画像取得を自動化できるようにします。

5. 光誘導操作細胞のフローサイトメトリー

  1. 誘導後24〜72時間で、インキュベーター内のLPAから細胞を取り出し、またはイメージング後に顕微鏡から細胞を取り出し、組織培養フードに入れる。
  2. LPAから直接取り外す場合は、ホイルストリップを取り外し、プレートを1〜2分間放置します。
  3. 各ウェルから培地を吸引します(すべてのウェルが使用されている場合は、24ウェルプレート全体のうち)。
  4. 各ウェルに100 μLの0.25%トリプシンを加え、プレートをプラスチック製の蓋で覆い、インキュベーターに戻します。
  5. 細胞をインキュベーター内で5分間邪魔されずに放置する。
  6. 5分後、プレートを取り出し、組織培養フードに戻した。
  7. 各トリプシン処理した各DMEMを400 μLでよく中和します。
  8. 5 mL ポリスチレン丸底チューブをセルストレーナー (または、完全にトリプシン処理されていない細胞の大きな凝集塊を除去するためにろ過できる適切なフローサイトメトリーチューブ) で、各ウェルに対応する名前でラベル付けします。
  9. P1000ピペットを使用して、各ウェルの内容物を6~8回上下にピペットでピペットで固定し、細胞凝集塊を分解し、フローサイトメトリー49用の単細胞サンプルを作成します。
  10. 各ウェルの内容物全体(約500μL)をストレーナーで標識チューブに移します。
  11. 正しい波長のレーザーで細胞を適切なフローサイトメトリー装置に持ってきてください(細胞を入れたチューブを氷の上または外に持ち込むことができます)。
    注:本研究で使用したフローサイトメーターは、大学病院の中核施設の一部でした。
  12. 順方向散乱ゲートと側方散乱ゲート(それぞれFSCとSSC)を作成して、適切なサイズと粒度の単一細胞を捕捉し、フローサイトメトリーソフトウェア上の破片や細胞凝集塊を排除します。
  13. ゲートを設定したら、適切なゲートで約 10,000 個のセルをキャプチャします。この数値は、ユーザーが探しているモバイルデータ通信の量に応じて調整します。実験からの細胞を含む各チューブについて繰り返す。
  14. 実験が完了したら、分析のために利用可能なフローサイトメトリーデータソフトウェアにデータをインポートします。
  15. FSC-SSCゲートを作成し(取得中と同様に)、実験データの各バッチに適用します。この原稿では、誘導されていない細胞集団の参照ウェルがこのゲートの作成に使用されていますが、密度ベースのゲートなど、ゲート作成のための他のメトリックが存在します。
  16. FSC-SSCゲートでゲートした実験条件で、フローサイトメトリーデータをヒストグラムとしてプロットするか、または他の方法で表現して、得られた発現パターンを例示する。この実験では、蛍光はGFP/FITCまたはPE/TexasRedチャネルによって捕捉された。

6. 遺伝子回路成分のRNA抽出と定量PCR

  1. 誘導後24〜72時間で、インキュベーター内のLPAから細胞を取り出し、またはイメージング後に顕微鏡から細胞を取り出し、組織培養フードに入れる。
  2. LPA から直接取り外す場合は、ホイルストリップを取り外し、プレートを 1 ~ 2 分間放置します。
  3. 各ウェルから培地を吸引します(すべてのウェルが使用されている場合は、24ウェルプレート全体のうち)。
  4. 適切なRNA抽出キットを用いて細胞からRNAを抽出する。
  5. RNA抽出が完了したら、各試料の逆転写反応を行う(表3)。
  6. また、各試料の定量PCRを行った(表4)。DNAポリメラーゼおよび関連するプロトコルを利用して、PCR反応を設定します。このステップでは、ハウスキーピング遺伝子と目的遺伝子との多重化反応を設定するか、別々の反応を作成します。この例では、GFP、KRAS、およびグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)レベルがプローブされた。qRT-PCR実験を完了した後、利用可能なソフトウェアを介して解析を進め、RNAレベルでの遺伝子回路フォールド変化を例示します。

7. 遺伝子回路構成要素の免疫蛍光

  1. 氷浴または冷凍庫を使用してメタノールを冷却します。
  2. 誘導後24〜72時間で、インキュベーター内のLPAから細胞を取り出し、またはイメージング後に顕微鏡から細胞を取り出し、組織培養フードに入れる。
  3. LPAから直接取り外す場合は、ホイルストリップを取り外し、プレートを1〜2分間放置します。
  4. 各ウェルから培地を吸引します(すべてのウェルが使用されている場合は、24ウェルプレート全体のうち)。
  5. 各ウェルに100 μLの0.25%トリプシンを加え、プレートをプラスチック製の蓋で覆い、インキュベーターに戻します。
  6. 細胞をインキュベーター内で5分間邪魔されずに放置する。
  7. 5分後、プレートを取り出し、組織培養フードに戻した。
  8. 各トリプシン処理した各DMEMを400 μLでよく中和します。
  9. ミニ遠心チューブに各ウェルに対応する名前でラベルを付けます。
  10. P1000ピペットを使用し、各ウェルの内容物を6〜8回上下にピペットして細胞凝集塊を切断する。
  11. 各ウェルの内容物全体(約500μL)を標識チューブに移す。
  12. 細胞を400 x gで5分間遠心分離 する。
  13. 完了したら、上清を捨て、サンプルを化学ヒュームフードに移動します。
  14. 細胞を再懸濁する(P1000ピペットとピペットを各チューブで6〜8回上下させて細胞凝集塊を壊す)750〜1000μLの4%パラホルムアルデヒド(リン酸緩衝生理食塩水、PBSで希釈)。
  15. 細胞を室温で15分間座らせます。
  16. インキュベーション後、750〜1000μLのPBSを添加する。ピペットを数回上下させます。
  17. 細胞を400 x gで5分間遠心分離 する。
  18. 完了したら、上清を捨て、サンプルを化学ヒュームフードに移動します。
  19. 細胞を再懸濁する(P1000ピペットとピペットを各チューブで上下に6〜8回使用して細胞凝集塊を壊す)750〜1000 μLの氷冷メタノール。
  20. 細胞を氷の上または-20°Cの冷凍庫に30分間座らせます。
  21. インキュベーション後、750〜1000μLのPBSを添加する。ピペットを数回上下させます。
  22. 細胞を400 x gで5分間遠心分離 する。
  23. 完了したら、上清を捨て、サンプルを化学ヒュームフードに移動します。
  24. 使用する抗体の種類に応じて、この時点からプロトコルを変更します。ステップ 7.24.1-7.24.14 または 7.24.15-7.24.22 のいずれかを実行します。
    1. 一次抗体と二次抗体を使用する場合は、P1000/P200ピペットとピペットを使用して各チューブで6〜8回上下にピペットを使用して細胞を再懸濁し、100 μLの一次抗体中の細胞凝集塊を切断します。この際、KRAS抗体又はERK抗体を含むストック抗体について1:800の希釈液を作り、室温で1時間座らせた。抗体を、0.5gのBSAと共に1x PBSから作製されたインキュベーション緩衝液中で希釈した。
      注: 抗体希釈率と目的抗原の標準曲線を作成することで、抗体の正確な希釈率を経験的に決定します。
    2. 抗体を加えた後は、チューブをホイルで覆い、標識抗体への軽い影響を防ぎます。
    3. インキュベーション後、750-1000 μLのインキュベーションバッファーを加える。ピペットを数回上下させます。
    4. 細胞を400 x gで5分間遠心分離 する。
    5. 完了したら、上清を捨て、サンプルを化学ヒュームフードに移動します。
    6. P1000/P200ピペットとピペットを使用して細胞を各チューブで6~8回上下に再懸濁し、100 μLの二次抗体中の細胞凝集塊を切断します。このとき、細胞をKRAS抗体の場合は1:800またはERK抗体の場合は1:2000の希釈で100 μLの二次抗体に再懸濁し、室温で30分間座らせた。一次抗体と同様に、二次抗体を上記のようにインキュベーションバッファーで希釈する。標準曲線の経験的知見に基づいて二次抗体の希釈率を決定する。
    7. 抗体を加えた後、チューブをホイルで覆い、標識抗体への軽い影響を防ぎます。
    8. インキュベーション後、750〜1000μLのインキュベーションバッファーを加える。ピペットを数回上下させます。
    9. 細胞を400 x gで5分間遠心分離 する。
    10. 完了したら、上清を捨て、サンプルを化学ヒュームフードに移動します。
    11. P1000ピペットおよびピペットを用いて細胞を各チューブ内で6〜8回上下に再懸濁し、500 μLのPBS中の細胞凝集塊を切断する。
    12. 各チューブの内容物全体(約500μL)をストレーナーで標識チューブに移します。
    13. 正しい波長のレーザーを備えた適切なフローサイトメトリー装置に細胞を持参してください(細胞が入ったチューブを氷の上または氷の外に持ち込むことができます)。
      注:いくつかのコントロールを有することは、操作された細胞遺伝子発現のフローサイトメトリー測定および分析を進めるために重要であることに留意すべきである。例えば、完全に染色されていない細胞、一次抗体のみで染色された細胞、および二次抗体のみで染色された細胞を有することは、結果を抗体からのバックグラウンドシグナルと比較するのに有用であり得る。
    14. 次に、セクション 5 の説明に従って分析を続行します。
    15. 一次抗体のみを使用する場合は、P1000/P200ピペットとピペットを使用して細胞を各チューブ内で6〜8回上下に再懸濁し、標識一次抗体100 μLの細胞凝集塊を切断します。適切な抗体希釈率を決定し、室温で1時間インキュベートする。検量線から抗体希釈率を経験的に求める。
    16. 抗体を加えた後は、チューブをホイルで覆い、標識抗体への軽い影響を防ぎます。
    17. インキュベーション後、750-1000 μLのインキュベーションバッファーを加える。ピペットを数回上下させます。
    18. 細胞を400 x gで5分間遠心分離 する。
    19. P1000ピペットおよびピペットを用いて細胞を各チューブ内で6〜8回上下に再懸濁し、500 μLのPBS中の細胞凝集塊を切断する。
    20. 各チューブの内容物全体(約500μL)をストレーナーで標識されたチューブに移します。
    21. 正しい波長のレーザーを備えた適切なフローサイトメトリー装置に細胞を持参してください(細胞が入ったチューブを氷の上または氷の外に持ち込むことができます)。
      注:いくつかのコントロールを有することは、操作された細胞遺伝子発現のフローサイトメトリー測定および分析を進めるために重要であることに留意すべきである。完全に染色されていない細胞および一次抗体のみで染色された細胞を有することは、抗体からのバックグラウンドシグナルと結果を比較するのに有用である。
    22. この時点から、セクション 5 の説明に従って分析を続行します。

結果

この記事内の遺伝子回路アセンブリおよび安定な細胞株生成は、転写活性で単一の安定FRT部位を含む市販の改変HEK-293細胞に基づいていた(図1)。遺伝子回路は、プラスミド内にFRT部位を有するベクターに構築され、HEK−293細胞ゲノムへのFlp−FRTの統合を可能にした。このアプローチはFlp-In細胞に限定されず、FRT部位はCRISPR/Cas950などのDNA編集技術を使用?...

ディスカッション

この記事の読者は、1)遺伝子回路の設計、構築、および検証を含む、光遺伝学的遺伝子回路(および他の遺伝子発現システム)を特徴付けるために不可欠なステップについての洞察を得ることができます。2)遺伝子回路を安定な細胞株に導入するための細胞工学(例えば、Flp-FRT組換え);3)LPAなどの光ベースのプラットフォームによる操作された細胞の誘導;4)蛍光顕微鏡による光誘導アッセイの初期?...

開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

Balázsi研究室のコメントと提案、最初のLPAの構築を支援してくれたKarl P. Gerhardt博士とJeffrey J. Tabor博士、LOV2-degronプラスミドを共有してくれたWilfried Weber博士に感謝します。この研究は、国立衛生研究所[R35 GM122561およびT32 GM008444]によって支援された。物理的および定量的生物学のためのローファーセンター;国防理工学大学院(NDSEG)フェローシップ。オープンアクセス料金の資金調達:NIH [R35 GM122561]。

著者の貢献:M.T.G.とG.B.がプロジェクトを考案しました。M.T.G.、D.、およびL.G.は、実験を行.Cた。M.T.G.、D.G.、L.G.、およびG..C.は、データを分析し、原稿を準備した.B。G..B.とM.T.G.がプロジェクトを監督した。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 mL PCR tubesEppendorf951010006reagent for carrying out PCR
0.25% Trypsin EDTA 1XThermo Fisher ScientificMT25053CIreagent for splitting & harvesting mammalian cells
0.5-10 μL Adjustable Volume PipetteEppendorf3123000020tool used for pipetting reactions
100-1000 μL Adjustable Volume PipetteEppendorf3123000039tool used for pipetting reactions
20-200 μL Adjustable Volume PipetteEppendorf3123000055tool used for pipetting reactions
2-20 μL Adjustable Volume PipetteEppendorf3123000039tool used for pipetting reactions
5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer CapCorning352235reagent for flow cytometry
5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 VEppendorf22628113equipment for mammalian culture work
AgaroseDenville ScientificGR140-500reagent for gel electrophoresis
Aluminum Foils for 96-well PlatesVWR®60941-126tool used for covering plates in light-induction experiments
AmpicillinSigma AldrichA9518-5Greagent for selecting bacteria with correct plasmid
Analog vortex mixerThermo Fisher Scientific02215365PRtool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
Bacto Dehydrated AgarFisher ScientificDF0140010reagent for growing bacteria
BD LSRAriaBD656700tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations
BD LSRFortessaBD649225tool for characterizing engineered cell lines
BSA, Bovine Serum AlbumineGovernment Scientific SourceSIGA4919-1Greagent for IF incubation buffer
Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TCCorning353043plate used for growing monoclonal cells
CentrifugeVWR22628113instrument for mammalian cell culture
Chemical fume hoodN/AN/Ainstrument for carrying out IF reactions
Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lidBD353047plate used for growing monoclonal cells
CytoOne T25 filter cap TC flaskUSA ScientificCC7682-4825container for growing mammalian cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fischer ScientificBP231-100reagent used for freezing down engineered mammalian cells
Ethidium BromideThermo Fisher Scientific15-585-011reagent for gel electrophoresis
Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with LidCorning353072container for growing sorted monoclonal cells
FCS ExpressDe Novo Software:N/Asoftware for characterizing flow cytometry data
Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mLCorning35-010-CVreagent for growing mammalian cells
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mmFisher ScientificFB0875712equipment for growing bacteria
Gibco DMEM, High GlucoseThermo Fisher Scientific11-965-092reagent for growing mammalian cells
Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression AssayLife Technologies4331182qPCR Probe
Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mLLife Technologies10687-010reagent for selecting cells with proper gene circuit integration
iScript Reverse Transcription SupermixBio-Rad Laboratories1708890reagent for converting RNA to cDNA
Laboratory Freezer -20 °CVWR76210-392equipment for storing experimental reagents
Laboratory Freezer -80 °CPanasonicMDF-U74VCequipment for storing experimental reagents
Laboratory Refrigerator +4 °CVWR76359-220equipment for storing experimental reagents
LB Broth (Lennox) , 1 kgSigma-AldrichL3022-250Greagent for growing bacteria
LIPOFECTAMINE 3000Life TechnologiesL3000008reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells
MATLAB 2019MathWorksN/Asoftware for analyzing experimental data
MethanolAcros Organics413775000reagent for immunofluorescence reaction
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mLVWR20170-333plasticware container
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression AssayLife Technologies4331182qPCR Probe
MultiTherm ShakerBenchmark ScientificH5000-HCequipment for bacterial transformation
NanoDrop Lite SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND-NDL-US-CANequipment for DNA/RNA concentration measurement
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master MixNEBM0492Sreagent for PCR of gene circuit fragments
NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency)New England Biolabs (NEB)C3019Hbacterial cells for amplifying gene circuit of interest
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNew England Biolabs (NEB)E2621Lreagent for combining gene circuit fragements
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 cameraNikon Instruments Inc.N/Ainstrument for quantifying gene expression
NIS-ElementsNikon Instruments Inc.N/Asoftware for characterizing fluorescence microscopy data
oligonucleotidesIDTN/Areagent used for PCR of gene circuit components
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 ControlPanasonicMCO-170AICUVHL-PAinstrument for growing mammalian cells
Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy GradeElectron Microscopy Sciences15710-Sreagent
PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x)Invitrogen14190144reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100xFisher Scientific15140-122reagent for growing mammalian cells
primary ERK antibodyCell Signaling Technology4370Sprimary ERK antibody for immunifluorescence
primary KRAS antibodySigma-AldrichWH0003845M1primary KRAS antibody for immunifluorescence
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)Qiagen27106reagent kit for purifying gene circuit plasmids
QIAquick Gel Extraction Kit (50)Qiagen28704reagent kit for purifying gene circuit fragments
QuantStudio 3 Real-Time PCR SystemEppendorfA28137equipment for qRT-PCR
Relative Quantification AppThermo Fisher ScientificN/Asoftware for quantifying RNA/cDNA amplificaiton
RNeasy Plus Mini KitQiagen74134kit for extracting RNA of engineered mammalian cells
Secondary ERK antibodyCell Signaling Technology8889Ssecondary ERK antibody for immunifluorescence
secondary KRAS antibodyInvitrogenA11005secondary KRAS antibody for immunifluorescence
Serological Pipets 5.0 mLOlympus Plastics12-102reagents used for setting up a variety of chemical reactions
SmartView Pro Imager SystemMajor ScienceUVCI-1200tool for imaging correct PCR bands
SnapGene Viewer (free) or SnapGeneSnapGeneN/Asoftware DNA sequence design and analysis
Stage top incubatorTokai HitINU-TIZtool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444557reagent for PCR of gene circuit fragments
TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxnLife Technologies4326317EqPCR Probe
ThermocyclerBio-Rad1851148tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture TreatedPerkinElmer1450-605plate used for light-induction experiments
VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cmVWR14673-010reagent for mammalian cell culture
VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel SystemVWR89032-290equipment for DNA gel electrophoresis
Flp-In 293Thermo Fisher ScientificR75007Engineered cell line with FRT site

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