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요약

광-반응성 포유동물 세포를 안정적으로 제어하려면 광유전학적 방법의 표준화가 필요하다. 이러한 목표를 향하여, 본 연구는 유전자 회로 구축, 세포 공학, 광유전학 장비 운영 및 검증 분석의 파이프라인을 개괄하여 네거티브 피드백 광유전학 유전자 회로를 이용한 광유도 유전자 발현 연구를 사례 연구로 표준화한다.

초록

포유동물 세포에서 신뢰할 수 있는 유전자 발현 조절은 사용된 방법에 관계없이 높은 배수 변화, 낮은 잡음 및 결정된 입출력 전달 기능을 갖는 도구를 필요로 한다. 이 목표를 향해, 광유전학적 유전자 발현 시스템은 지난 십 년 동안 포유동물 세포에서 단백질 수준의 시공간적 조절을 위해 많은 주목을 받았다. 그러나, 광유도 유전자 발현을 조절하는 대부분의 기존 회로는 구조적으로 다양하고, 플라스미드로부터 발현되며, 가변 광유전학 장비를 이용하여, 안정한 세포주에서 광유전학적 성분의 특성화 및 표준화를 탐구할 필요성을 창출한다. 여기서, 본 연구는 사례로서 음성 피드백 광유전학 회로를 이용하여 포유동물 세포에서 광유도성 유전자 발현을 조절하기 위한 신뢰할 수 있는 유전자 회로 구축, 통합 및 특성화의 실험 파이프라인을 제공한다. 이 프로토콜은 또한 광유전학 장비 및 광 정권을 표준화하는 것이 유전자 발현 잡음 및 단백질 발현 크기와 같은 유전자 회로 특징을 어떻게 확실하게 나타낼 수 있는지를 보여줍니다. 마지막으로,이 논문은 그러한 기술을 채택하고자하는 광유전학에 익숙하지 않은 실험실에 유용 할 수 있습니다. 여기에 설명된 파이프라인은 포유동물 세포에서 다른 광유전학 회로를 적용하여, 포유동물 세포에서 전사, 프로테오믹 및 궁극적으로 표현형 수준에서 유전자 발현의 보다 안정적이고 상세한 특성화 및 조절을 허용해야 한다.

서문

다른 공학 분야와 마찬가지로, 합성 생물학은 프로토콜을 표준화하는 것을 목표로하며, 재현성이 높은 기능을 가진 도구를 생물학적 시스템과 관련된 질문을 탐구하는 데 활용할 수 있도록합니다1,2. 많은 조절 시스템이 구축된 합성 생물학의 한 도메인은 유전자 발현 조절3,4의 영역이다. 유전자 발현 조절은 단백질 수준과 가변성 (잡음 또는 변동 계수, CV = σ / μ, 평균에 대한 표준 편차로 측정)을 모두 타겟팅 할 수 있으며, 이는 생리 학적 및 병리학 적 세포 상태에서의 역할로 인해 중요한 세포 특성입니다5,6,7,8. 단백질 수준과 소음4,9,10,11,12을 제어할 수 있는 많은 합성 시스템이 설계되어 여러 도구에서 프로토콜을 표준화할 수 있는 기회를 창출했습니다.

최근에 등장한 유전자 네트워크를 제어 할 수있는 새로운 도구 세트 중 하나는 광유전학으로, 빛을 사용하여 유전자 발현을 제어 할 수 있습니다13,14,15,16,17. 그들의 화학적 전임자들과 유사하게, 광유전학적 유전자 회로는 박테리아에서 포유동물에 이르기까지 모든 세포 유형에 도입될 수 있어, 관심있는 임의의 하류 유전자의 발현을 허용한다18,19. 그러나, 새로운 광유전학적 도구의 급속한 생성으로 인해, 유전 회로 아키텍처, 발현 메카니즘(예를 들어, 플라스미드 기반 대 바이러스 통합) 및 광공급 제어 장비11,16,20,21,22,23,24,25에서 다양한 시스템이 등장하였다. . 따라서 이것은 유전자 회로 구축 및 최적화, 시스템 활용 방법 (예 : 통합 대 일시적인 발현), 유도에 사용되는 실험 도구 및 결과 분석과 같은 광유전 적 기능의 표준화를위한 여지를 남겨 둡니다.

포유동물 세포에서 광유전학 프로토콜의 표준화에 대한 진전을 이루기 위해, 이 프로토콜은 HEK293 세포(인간 배아 신장 세포주)에 통합된 음성 피드백(NF) 유전자 회로를 사용하여 포유동물 세포에서 광유전학 시스템을 엔지니어링하기 위한 실험 파이프라인을 기술한다. NF는 자연 계26,27,28이 매우 풍부하기 때문에 표준화를 입증하기에 이상적인 시스템으로, 단백질 수준을 조정하고 노이즈를 최소화할 수 있습니다. 간단히 말해서, NF는 그 자신의 발현을 충분히 빠르게 감소시키는 리프레서에 의한 정밀한 유전자 발현 조절을 허용하여, 정상 상태로부터 떨어져 있는 임의의 변화를 제한한다. 정상 상태는 각 유도제 농도에 대해 새로운 정상 상태에 도달 할 때까지 더 많은 단백질 생산을 허용하기 위해 리프레서를 비활성화하거나 제거하는 유도제에 의해 변경 될 수 있습니다. 최근에, 유전자 발현의 넓은 동적 반응을 생성하고, 저잡음을 유지하며, 공간 유전자 발현 제어의 잠재력을 허용하는 광 자극에 반응할 수 있는 조작된 NF 광유전학 시스템이 생성되었다11. 광유도성 튜너(LITers)로 알려진 이 도구들은 살아있는 세포4,10,29,30에서 유전자 발현 조절을 허용하고 장기적인 유전자 발현 조절을 보장하기 위해 인간 세포주에 안정적으로 통합된 초기 시스템에서 영감을 얻었다.

여기서, LITer를 일례로 사용하여, 광반응성 유전자 회로를 생성하고, 광플레이트 장치(LPA, 광유전학적 유도 하드웨어)31로 유전자 발현을 유도하고, 맞춤형 광 자극에 대한 조작된, 광유전학적으로 제어가능한 세포주의 반응을 분석하기 위한 프로토콜이 개략적으로 요약된다. 이 프로토콜을 통해 사용자는 탐색하려는 모든 기능 유전자에 대해 LITer 도구를 활용할 수 있습니다. 또한 아래에 요약된 방법 및 광유전학 장비를 통합함으로써 다양한 회로 아키텍처(예를 들어, 포지티브 피드백, 네거티브 조절 등)를 갖는 다른 광유전학 시스템에 적응될 수 있다. 다른 합성 생물학 프로토콜과 유사하게, 여기에 요약된 비디오 기록 및 광유전학 프로토콜은 암 생물학, 배아 발달 및 조직 분화를 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 분야의 단일 세포 연구에 적용될 수 있다.

프로토콜

1. 유전자 회로 설계

  1. 단일 유전자 회로/플라스미드(예를 들어, 포유동물 DNA 통합 서열 모티프32, 광-반응성 요소33, 또는 기능적 유전자34)로 결합할 유전자 성분을 선택한다.
  2. 임의의 유전 공학 및/또는 분자 클로닝 소프트웨어를 사용하여, 추후 사용 및 참조를 위해 DNA 서열을 저장하고, 각 서열에 주석을 달고, 필요한 모든 특징(예를 들어, START 코돈, 조절 또는 번역된 서열)을 검사한다35.
  3. 전체 유전자 회로 설계에 따라 부품을 개발하거나 채택하십시오36. 일례로서, LITers11에서와 같은 광유전학적 억제기의 경우, 광유도성 분해37,38 또는 리프레서의 DNA 결합 능력39의 불활성화가 가능한 도메인을 암호화하는 유전자 서열을 융합시키고, 리프레서 유전자(예를 들어, TetR)4의 프레임에 인접한다.
    1. 광유전학적 활성화제의 경우, 광-유도된 DNA 결합시 유전자 발현을 촉진하는 활성화제 도메인40 의 존재를 보장한다41. 음성 또는 양성 자가조절을 위해, 조절기 유전자의 프로모터 (예를 들어, TetR 발현 프로모터의 또는 상류의 tetO 부위) 내 또는 상류에 조절 결합 부위의 존재를 보장한다42.
  4. 각 유전자 회로에 대한 분자 클로닝 소프트웨어를 사용하여 플라스미드의 DNA 서열 증폭 또는 시퀀싱을 위한 프라이머를 설계한다.
  5. 분자 클로닝 소프트웨어의 내장 잔치(예를 들어, 서열 정렬)를 통해 플라스미드 구축을 위한 프라이머를 계산적으로 검증한다.
  6. 제조업체로부터 올리고뉴클레오티드 프라이머를 주문하십시오. 이 작업에서 구축되고 사용되는 플라스미드는 설계 및 사용된 프라이머와 함께 원래의 지지 물질(11 )에서 발견될 수 있다.
  7. 프라이머를 이중 증류수 (ddH2O)에 100 mM 스톡 농도로 희석한다.
  8. 100 mM 스톡 프라이머의 스톡을 PCR을 위해 10 mM 농도로 희석한다.
  9. 1 μL의 정방향 프라이머, 1 μL의 역방향 프라이머, 1 μL의 주형 DNA를 게놈 또는 바이러스 DNA에 대해 0.5-500 ng의 총 질량으로 또는 플라스미드 또는 바이러스 DNA에 대해 0.5 pg-5 ng, 12.5 μL의 DNA 중합효소 2x 마스터 믹스 (또는 제조자의 희석 인자를 만족시키는 부피), 및 25 μL의 총 반응 부피에 대해 9.5 μL의 ddH2O로 PCR 믹스를 준비한다.
  10. PCR 믹스를 선택된 효소에 따라 적절한 설정으로 열순환기에서 인큐베이션한다43. 제안된 반응 주기에는 다음이 포함됩니다.
    단계 1: 95°C에서 30s 초기 변성 단계의 1 사이클.
    단계 2: 98°C에서 변성 단계의 5초의 40 사이클.
    단계 3: 65°C에서 어닐링 단계의 30 s의 한 사이클 (이전에 설계된 프라이머에 의해 결정됨).
    단계 4: 72°C에서 1분 연장의 1 사이클(∼1 킬로베이스(kb) 주형 단편 길이).
    단계 5: 72°C에서 2분 연장의 한 사이클.
    반응물을 겔 전기영동을 통해 시험할 수 있을 때까지 4°C에서 유지시킨다. 이러한 프로토콜은 사용되는 시약(예를 들어, 중합효소 및 완충제)에 따라 달라질 것이다.
  11. 선형 PCR 산물을 단일 원형 DNA 벡터로 연결하는 데 필요한 DNA 어셈블리 반응에 사용되는 모든 단편을 증폭하기 위해 단계 1.9를 반복한다.
  12. PCR 산물을 1% 아가로스 겔에서 실행한 다음, 원하는 길이의 밴드를 정제하였다.
  13. DNA 조립 반응을 위한 마스터 믹스를 준비한다(표 1).
    참고: 이 예에서 마더 벡터는 전체 어셈블리 결과에 큰 변화를 주지 않으면서 PCR 단계의 효율을 높이기 위해 두 개의 단편으로 분할됩니다.
  14. DNA 어셈블리 반응 마스터 믹스를 50°C의 열순환기에서 1시간 동안 인큐베이션하고(DNA 조립 시약 프로토콜에 달리 명시되지 않는 한) 반응물을 박테리아 형질전환을 위해 반응 생성물을 사용하기 위해 4°C에서 저장한다.
  15. 적격 대장균 (Escherichia coli) 세포 및 상응하는 박테리아 형질전환 프로토콜을 사용하여 박테리아 형질전환(화학적 또는 전기천공)을 설정한다. 형질전환 후, 선택된 박테리아 선택 마커 (예를 들어, 암피실린)를 함유하는 박테리아 루리아-베르타니 (LB) 한천 플레이트를 사용하여 형질전환 믹스를 플레이트화한다. 플레이트를 37°C에서 하룻밤 사이에 인큐베이션한다44.
  16. 다음날 접시를 확인하십시오. 콜로니를 접종하려면 플레이트에서 개별 콜로니를 선택하고 배양 튜브에 해당 박테리아 선택 마커가있는 액체 LB 브로스에 재현탁하십시오. 진탕기 인큐베이터에서 37°C, 300 rpm으로 하룻밤 동안 인큐베이션한다.
  17. 박테리아 배양물로부터 플라스미드 DNA를 추출하기 위해 플라스미드 준비 프로토콜을 수행한다.
  18. 두 단계로 회로의 유효성을 검사합니다. 먼저, 조잡한 검증으로서 제한 효소를 사용하여 소화 시험을 수행하여 대략적인 플라스미드 생성물이 수득되었는지를 확인한다. 둘째, 테스트 소화가 통과 / 확인되면 플라스미드를 Sanger 시퀀싱 시설 (또는 사용 가능한 장비를 사용하는 프로세스)에 제출하여 정확한 DNA 서열을 얻어 나중에 설계 소프트웨어의 예상 서열과 비교하십시오.
    1. 시험 소화를 수행하려면, 사용된 분자 클로닝 소프트웨어를 기반으로 적어도 두 개의 단편을 생산하는 적어도 두 개의 제한 효소를 선택하십시오. 일단 효소가 선택되면, 사용된 효소에 따라 각 효소 1 μL, 생성된 DNA의 5 μL, 및 13 μL의 물을 적절한 염 및 완충액과 함께 첨가하여 시험 샘플을 준비한다. 반응물을 37°C에서 1시간 동안 또는 효소 제조업체가 제안한 대로 인큐베이션한다. 1 % 아가로스 젤에서 소화 생성물 테스트를 실행하고 밴드가 올바른지 확인하십시오.
      참고: 밴드가 정확하면 시퀀싱으로 진행하십시오.
    2. 시퀀싱을 수행하기 위해, 프라이머의 어닐링 영역이 약 500 bp (염기쌍) 떨어져 있고 관심있는 단편 (유전자 회로 성분) 또는 전체 플라스미드를 덮을 수 있도록 소프트웨어에 저장된 DNA를 기반으로 프라이머를 생성하십시오. 프라이머를 순수한 뉴클레아제 무함유 물 (NF-H2O)로 10 mM 농도로 희석한다. 0.2mL 튜브에 10ng/μL DNA, 1μL의 프라이머 및 8μL의 NF-H2O를 첨가하여 시퀀싱 샘플을 준비합니다. 각 프라이머에 대해 이것을 반복하십시오.
      참고: 샘플이 준비되면 시퀀싱 시설에서 샘플을 떨어뜨리고 분자 클로닝 소프트웨어를 사용하여 플라스미드 서열과 결과를 비교하십시오.
  19. 이 단계에서, 유전자 회로를 포함하는 플라스미드를 적절한 세포주에 통합하기 위한 대략 100-1000 ng/μL의 DNA 샘플을 생성한다.

2. 안정되어 있는 세포주 공학

  1. 포유동물 발현 벡터로부터 관심있는 단백질의 높은 수준의 발현을 보장하는 안정한 서브라인의 신속한 생성을 위해 설계된 포유동물 세포주를 주문한다. 세포 유형 및 세포주 공학의 용이성은 사용자가 선호하거나 달성하고자하는 것에 따라 가변적 일 수 있습니다.
    1. 예를 들어, 사용자가 최소한의 중간 단계를 갖는 세포주 엔지니어링을 선호하는 경우, 전사적으로 활성인 게놈 유전자좌에서 단일 안정한 통합 부위 (예를 들어, FRT)를 함유하는 세포를 주문한다. 보다 미묘한 세포 공학이 선호되는 경우 CRISPR / Cas9와 같은 유전 공학 도구를 사용하여 원하는 위치에 통합 사이트를 만듭니다.
  2. 37°C에서 가습된 공기 중 5% CO2 에서 세포를 성장시킵니다. 세포 유형에 따라 필요에 따라 성장 조건을 조정한다.
  3. 이전 단계로부터 수득된 목적하는 세포에 상기 설계된 유전자 회로를 트랜스펙션하여 안정한 세포주 생성 과정을 시작한다. 이를 달성하기 위해, 유전자 회로 DNA의 리포솜 혼합물(45 )을 적절한 재조합효소(예를 들어, Flp-FRT 재조합을 위한 Flp-재조합효소) 또는 전기천공과 같은 다른 방법을 통해 사용한다.
  4. 형질감염 이틀 후, 세포를 25% 컨플루언시로 분할한다.
  5. 세포를 분할 한 후 여섯 시간 후, 50 μg / mL의 하이그로마이신 항생제 (또는 플라스미드 건설 중에 선택된 포유류 항생제 내성 유전자에 상응하는 다른 항생제)를 함유 한 신선한 배지로 배지를 교환하여 항생제 선택을 시작하십시오.
    참고 : 유전자 회로 구축에 사용되는 다양한 포유류 항생제 내성 유전자가 있으며, 각각은 다른 킬 곡선을 가지고 있습니다. 따라서 회로 구축을 위해 어떤 포유류 항생제 내성 유전자를 선택하든, 관심있는 세포에서 적절한 킬 곡선을 연구해야합니다. 이 단계는 유전자 회로 페이로드를 포함하는 세포가 풍부해지는 동안 시스템이 없는 세포가 사멸되도록 보장한다.
  6. 세포가 항생제 선택 배지에서 성장하도록 허용하고, 플레이트 또는 플라스크에 수십 개의 초점이 생길 때까지 2-3 일마다 신선한 배지로 변경하십시오. 유입 준수 문화가 합류에 도달하기 전에 로그 단계에 있을 때 통과합니다.
  7. 일단 충분히 많은 초점이 생기면, 칼슘, 마그네슘 및 중탄산나트륨이 없는 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)에 0.25% 트립신 1mL, 0.1% EDTA로 세포를 몇 분 동안 트립신화합니다. 트립신을 신선한 배지로 중화시키고 모든 세포를 신선한 용기에 넣으십시오.
  8. 신선한 용기에있는 세포가 80 % -100 % 합류하면 45 % 오래된 배지, 45 % 신선한 배지 및 10 % DMSO를 혼합하여 동결시킵니다. 나머지 세포를 멸균 튜브로 옮기고 단일 세포 분류를 수행하여 단일클론 세포를 96-웰 플레이트로 분리한다.
  9. 모노클로날 분류 후 약 2-3 주, 96-웰 플레이트 내의 웰에는 초점이 있어야합니다. 대략 50%-60%가 합류하면, 세포를 12-웰 플레이트로 분할한다.
  10. 일단 12-웰 플레이트가 80%-100% 합류되면, 조직 배양물을 처리된 T-25 플라스크로 분할한다. 일단 T-25 플라스크의 세포가 80%-100% 합류하면, 세포를 동결시키고 모노클로날 세포주의 특성화 및 시험을 위한 통로를 유지한다.
    1. 모노클로날 세포주를 현미경 및 유세포 분석기 분석법에 의해 특성화하여 유도된 형광 리포터 생산에 기초한 유전자 발현 프로필을 보고한다. 형광 항체 표지 및 면역 형광 분석을 통해 기능적 단백질 생산을 확인합니다. 전사 수준 유전자 발현 유도를 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)을 통해 시험한다. 클론의 국소 및 전체 게놈 시퀀싱을 통해 유전자 서열 및 통합 정확도를 검증한다.

3. 라이트 플레이트 장치 유도 분석

  1. 조작된 세포의 광 유도에 사용될 LPA 장치(31,46)를 구성한다. 간단히 말해서, 유전자 발현을 조절하는 데 사용할 LPA를 만드는 데 몇 가지 광범위한 단계가 중요합니다. 여기에는 3D 인쇄 LPA 프레임 구성 요소, 회로 기판 구성, 마이크로 컨트롤러 프로그래머를 통한 회로 프로그래밍, 구성 요소를 최종 LPA로 조립, IRIS 소프트웨어를 통해 메모리 카드 프로그래밍 및 완성 된 장치 교정이 포함됩니다. 보다 자세한 설명은 위의 참조를 참조하십시오.
    1. Gerhardt et al. (2016 및 2019) 31,46에 설명 된대로 3D 부품을 인쇄하십시오.
    2. Gerhardt et al. (2016 및 2019) 31,46에 설명 된대로 회로 기판을 조립하십시오.
    3. Gerhardt et al. (2016 and 2019) 31,46에 설명 된대로 마이크로 컨트롤러 프로그래머를 사용하여 조립 된 LPA 회로에 펌웨어를 추가하십시오.
    4. Gerhardt et al. (2016 및 2019) 31,46에 설명 된대로 3D 인쇄 된 부품과 조립 된 회로 기판을 결합하십시오. 여기에는 촬영된 비디오 및 그림 2와 같이 장착 플레이트, 회로 기판, LED(발광 다이오드) 스페이서, 플레이트 어댑터, 24웰 플레이트, 플레이트 뚜껑, 장착 볼트, 윙 너트 및 스태킹 구성 요소를 취하는 것이 포함됩니다.
    5. 메모리 카드 프로그래밍 및 장치 교정을 위해 아래에 설명된 단계를 따르십시오.
  2. Tabor Lab 웹 사이트47 에서 사용할 수 있는 IRIS 소프트웨어를 사용하여 LPA(Light Plate Device)31 용 SD 카드를 프로그래밍하고 광유전학 실험을 시작하는 데 필요한 적절한 조명 조건을 탐색합니다.
    참고: IRIS 소프트웨어는 Tabor Lab에서 개발한 LPA로 알려진 광유전학 전자 하드웨어를 프로그래밍하기 위한 웹 기반 응용 프로그램입니다. 이 소프트웨어를 사용하면 LPA 하드웨어의 각 웰에서 개별 발광 다이오드(LED)를 제어하는 상대 IRIS 값을 프로그래밍할 수 있습니다.
  3. LPA(4 x 6) 드롭다운 옵션을 선택한 다음 적절한 조명 방식(정상 상태, 동적, 고급)을 클릭합니다.
    참고 :이 원고의 경우 모든 분석은 정상 상태 예제에 중점을 둡니다. 그러나 고급 설정 예제는 펄스 지속 시간 및 듀티 사이클 체계에 사용할 수 있습니다.
  4. 상단 또는 하단 LED가 플레이트의 웰에 해당하는 셀에 값을 입력하여 조명되는지 여부를 선택합니다. 이 작업에 사용된 LPA의 경우 상단 위치에 배치된 파란색 LED가 모든 실험에 사용되었습니다. 각 LED는 일단 프로그래밍되면 일정한 광도에서 지속적인 광 노출을 제공할 수 있습니다. IRIS 소프트웨어는 프로그래밍할 수 있는 4096 강도 레벨을 허용합니다.
  5. LED 위치가 선택되면 원하는 실험 윤곽선에 대한 강도 값을 입력합니다. 예를 들어, 플레이트당 세 번의 기술적 반복실험으로 8개의 다른 광 강도(또는 펄스 지속 시간 또는 듀티 사이클)를 입력합니다(표 2). G.s.는 IRIS 소프트웨어에서 LPA 프로그래밍에 사용되는 광도 레벨 측정 값인 회색조 단위를 나타냅니다.
    1. IRIS 실험 파일을 설계할 때는 LPA 장치에 대한 인접한 웰로부터의 엣지 효과, 청색광 노출의 강도 증가로 인한 광 독성, 원하는 용량-반응의 유형(예를 들어, 단조로움 대 비단조로움)을 결정해야 합니다.
    2. 사용자가 LPA에서 셀을 특정 광 파라미터(예를 들어, 강도)의 오름차순/내림차순으로 프로그래밍하는 경우, 웰은 인접한 웰에 영향을 줄 수 있는 광 누화 또는 심지어 열의 에지 효과를 생성할 수 있다. 이는 실험이 완료될 때 측정된 결과의 결과에 실수로 영향을 줄 수 있습니다. 이를 완화하기 위해 사용자는 IRIS 소프트웨어에 무작위화 매트릭스를 구현하여 위치를 스크램블하여 에지 효과를 최소화할 수 있습니다. 예를 아래의 대표 결과에 설명되어 있습니다 (그림 4A-B).
    3. 또한, 청색광의 더 높은 강도는 세포 성장 및 생존을 방해하는 것으로 밝혀졌다48. 따라서, 광독성을 완화시키기 위해, 조사되는 양상에 따라 광강도, 펄스 지속시간, 또는 듀티 사이클 반응 곡선을 생성하는 것이 중요하다.
      1. 예를 들어, 24웰 플레이트당 세 번의 반복실험으로 8개의 광도 값을 프로그래밍하고, LPA의 최대 강도 범위까지 범위를 지정합니다. 그런 다음 SSC-FSC 게이트가 있는 유세포 분석기 또는 요오드화 프로피듐과 같은 살아있는 염색을 사용하여 각 조명 값에서 집단 세포 생존률(죽은 세포/세포 파편을 포함한 총 사건과 비교하여 살아있는 세포)을 정량화합니다.
      2. 이어서, 임의의 자극이 증식, 유전자 발현 또는 생존에 악영향을 미칠 수 있기 때문에 실험 셋업을 위한 이상적인 집단 생존량을 결정한다(예를 들어, 80% 세포 생존을 적절한 트레이드오프로서 설정). 예를 들어,이 작업에서 일단 보정되면 강도는 3000g.s. 단위 (LPA 장치의 최대 강도 ~ 3/4)를 초과하지 않았습니다. 이에 대한 예는 아래의 대표 결과에 설명되어 있습니다.
    4. 독성으로 인해 광 값을 제한하는 것 외에도, 사용자는 모노톤 반응의 범위와 같은 용량-반응의 특정 부분을 특성화하기 위해 광 값을 제한하고자 할 수 있다.
      1. 이를 달성하기 위해, 초기에 원하는 용량-반응을 결정할 때 분석되는 양식에 따라 광범위한 광강도, 펄스 지속시간 또는 듀티 사이클을 스캔하고(표 2), 관심 있는 광 정권 상에서 좁히기 위해, 예를 들어, 유전자 발현이 단조로운 용량-반응에 대한 증가된 광 값과 긍정적으로 상관관계가 있다.
      2. 관심 있는 광범위를 결정하기 위해, 다수의 LPA가 동등한 광량을 전달하도록 교정되고 아래에 요약된 세포 배양 작업 또는 분석을 진행하는지에 따라 상이한 강도/펄스 지속기간/듀티 사이클/등보다 더 많은 웰(예를 들어, 48, 72, 96 등)의 최대 24개의 웰로 단일 LPA를 프로그래밍한다. 따라서, 광유전학적 시스템의 특성화를 시작하여 광자극의 넓은 용량 범위를 갖는 광유전학적 시스템의 특성화를 시작하여 원하는 유전자 발현을 부여하는 범위 간격을 결정하고, 이어서 그 정제된 용량 범위에서 실험을 수행한다.
      3. 예를 들어,이 작업에서 일단 3000 g.s. 단위가 독성 광 강도의 임계 값으로 결정되었습니다. 이 역치는 아래에 요약된 검정을 위한 광의 상한선(예를 들어, 면역형광)으로서 사용되었다.
        참고: 위의 단계는 LPA의 광학 교정과 무관하며 각 광유전학 시스템에 대한 분자 수준 교정을 참조합니다.
  6. IRIS에 적절한 광도 값이 프로그래밍되면 USB 3.0 콘센트가 있는 메모리 카드를 LPA에 삽입하여 파일을 다운로드하고 전송합니다.
  7. LPA의 교정이 완료되면31, 광유도 분석의 개시를 위한 세포 배양 작업을 진행한다. 보정이 수행되지 않은 경우 LPA가 마이크로 컨트롤러 프로그래머로 프로그래밍된 후 이미지 분석 방법(단계 3.7.1-3.7.3)을 사용하여 LPA를 보정합니다.
    1. 간단히 LPA가 Gerhardt et al. (2016)31에 의해 기술된 것과 동일한 IRIS 레벨을 갖도록 프로그램한다.
      참고: 교정을 위해 LPA는 2000g.s의 값을 갖도록 프로그래밍되었습니다.
    2. 장치가 메모리 카드로 프로그래밍되고 리셋 버튼(LPA의 물리적 버튼)을 누르면 전체 장치(예: 젤 스테이션 이미저, 스캐너 장치 등)의 이미지를 획득합니다. 보정을 위해 장치가 180° 회전한 상태에서 두 개의 이미지를 획득합니다.
    3. 그런 다음 Gerhardt et al. (2016) 31 에 의해 설계된 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 LPA 플레이트의 LED 강도의 변동성을 보여주고 LED 보정 값을 계산하여 웰에서 강도를 동일하게 만듭니다. 이에 대한 예가 아래에 표시된 결과에 설명되어 있습니다(그림 3). 이 교정이 완료되면 광 유도 분석의 개시를 위한 세포 배양 작업을 진행하십시오.
  8. 유전자 발현에 대한 광유도 효과를 조사하기 위해 이전 섹션에서 조작된 모노클로날 세포의 플라스크를 수득한다.
  9. 플라스크에서 오래된 미디어를 제거하십시오.
  10. 세포에 트립신 1mL를 첨가하고 5분 동안 배양한다.
  11. 5 분 후, 필요한 화학 물질로 보충 된 Dulbecco-modified Eagle 's 배지 (DMEM 또는 기타 원하는 배지) 4 mL를 첨가하여 트립신을 중화시킵니다 (이 작업은 하이그로 마이신 50 μg / mL, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 용액, 10 % 태아 소 혈청, FBS를 사용함).
  12. 웰당 ∼75,000개의 세포를 24웰 블랙 플레이트에 500 μL의 총 부피로 첨가한다. 시딩된 세포의 수는 원하는 실험 기간 및 사용된 세포 유형에 따라 달라질 수 있다.
    참고: 추가적으로, 세포 시딩 밀도는 배양 유지 및 잠재적으로 실험 기간에 영향을 미친다는 점에 유의하십시오. 웰 당 더 낮은 수의 세포에서 시작하여 배양이 합류에 도달하기 전에 더 긴 시간 지속 시간을 보장합니다. 또한, 관심있는 유전자 회로에 통합 된 광유전 적 구성 요소의 유형은 유전자 발현이 정상 상태에 도달 할 때 영향을 미치므로 실험 기간에 영향을 미칩니다. 고려될 수 있는 다른 인자는 세포주-특이적 성장 속도, 배지 조성, 및 조건부 성장 효과(즉, 광)이다.
  13. 도금 후, 세포를 5 % CO2 가있는 가습 인큐베이터에 넣어 2-6 시간 동안 정착 할 수 있도록하십시오.
  14. 배양 후, 세포를 조직 배양 후드로 옮기고, 플라스틱 뚜껑을 제거하고, 플레이트의 상부에 접착성 호일 스트립을 첨가한다(도 2D). 이 단계는 웰의 상단과 측면이 코팅되어 있기 때문에 웰 사이의 광 전달을 최소화하며, 이제 LED가 배치된 웰의 바닥에서만 빛이 들어올 수 있습니다.
  15. 플레이트를 LPA의 장착된 3D 부품에 넣습니다. 그런 다음 각 모서리의 장치 나사 위에 맞는 3D 인쇄 LPA 뚜껑으로 플레이트를 덮으십시오.
  16. 장치를 전원에 연결하고 LPA 장치의 재설정 단추를 눌러 업데이트된 LPA 실험 설정이 적용되는지 확인합니다.
  17. 세포를 원래의 시딩 밀도, 세포주 특이적 성장 속도, 및 성장 조건에 따라 적절한 시간 동안 실험 시스템 내에서 인큐베이션한다. 이 예에서, 세포주는 유전자 발현이 정상 상태에 도달하도록 3일 동안 연속적으로 유도되었다. 그러나, 많은 광유전학적 시스템(예를 들어, VVD)이 훨씬 더 빨리(예를 들어, 24시간) 정상 상태 유전자 발현에 도달할 수 있고, 따라서 실험 유도 시간이 필요에 따라 감소되거나 연장될 수 있다는 점에 유의해야 한다.
  18. 광 유도 실험이 끝날 때, 조작된 세포주를 특성화하기 위해 다음의 4개의 분석 중 임의의 것에 대한 샘플을 활용한다(섹션 4-7).

4. 광유도 조작된 세포의 형광 현미경 검사

  1. 24-72시간 유도 후, LPA 내의 세포를 인큐베이터로부터 제거하고 이를 조직 배양 후드에 넣는다.
  2. 호일 스트립을 제거하고 플레이트를 1-2 분 동안 그대로 두십시오. 이렇게 하면 플레이트에 바로 놓으면 플라스틱 뚜껑에 결로가 형성되는 것을 방지할 수 있습니다.
  3. 1-2 분 동안 앉은 후 원래의 플라스틱 뚜껑을 접시에 다시 올려 놓습니다.
  4. 세포를 적절한 위상차 또는 형광 현미경으로 이미지화한다.
  5. 장비에 따라 노출 시간, 광원 강도 및 엔지니어링 셀을 표시하기 위한 게인을 조정합니다. 이 실험에서는 FITC/GFP(녹색 형광 단백질) 광원 노출 시간의 경우 50ms, 위상차 노출 시간에는 각각 100% 강도로 1-5ms의 경우 다음과 같은 매개 변수가 적용되었습니다.
    참고 : 최적의 노출 시간, 이득 수준 및 광원 강도는 형광 리포터의 과포화를 최소화하고 세포 손상을 최소화하며 정성 및 정량 분석을 위해 적절한 이미지를 캡처하기 위해이 작업의 경험에서 경험적으로 파생되는 경우가 많습니다. 이러한 각 파라미터의 레벨을 결정할 때 명심해야 할 측면에는 신호 대 잡음비 극대화, 광독성 최소화, 형광 신호의 과포화 최소화, 약한 형광 신호 증폭 능력 증가 등이 있습니다.
    1. 이러한 매개 변수를 크게 애드혹으로 최적화하십시오. 그러나, 이전의 실험 값들(예를 들어, 형광 리포터의 과포화를 야기하는 광원 강도)은 적용가능한 경우 미래의 실험 설정을 안내할 수 있다. 예를 들어, 하나의 회로(LITer1.0) 또는 실험 셋업(예를 들어, 광도)으로부터의 이득 설정, 노광 시간, 및 광도 초기 값들은 유사하지만 상이한 유전자 회로(LITer2.0)11 또는 상이한 광 양상(예를 들어, 광 듀티 사이클)으로 이동할 때 시작점으로서 사용될 수 있다.
  6. 현미경 소프트웨어에 프로그래밍된 좌표 템플릿에 의한 플레이트 이미징을 간소화하여 전체 플레이트 크기(예: 24웰)가 웰당 여러 이미지 위치로부터 이미지 수집을 자동화할 수 있도록 합니다.

5. 광유도 조작된 세포의 유세포 분석

  1. 24-72시간 유도 후, LPA로부터 세포를 인큐베이터 또는 이미징 후 현미경으로부터 제거하고 이를 조직 배양 후드에 배치한다.
  2. LPA에서 직접 제거한 경우 호일 스트립을 제거하고 플레이트를 잠시 또는 두 분 동안 그대로 두십시오.
  3. 각 웰에서 배지를 흡인하십시오 (모든 웰이 사용되는 경우 전체 24 웰 플레이트 중).
  4. 각 웰에 0.25% 트립신 100μL를 넣고 플레이트를 플라스틱 뚜껑으로 덮은 다음 인큐베이터에 다시 넣습니다.
  5. 세포를 5분 동안 인큐베이터에 방해받지 않고 방치한다.
  6. 5분 후, 플레이트를 제거하고 이를 조직 배양 후드로 복귀시킨다.
  7. 각 트립신화된 웰을 400 μL의 DMEM으로 중화시킨다.
  8. 5 mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브에 세포 스트레이너 (또는 완전히 트립신화되지 않은 큰 세포 덩어리를 제거하기 위해 여과 할 수있는 적절한 유세포 분석기 튜브)를 각 웰에 해당하는 이름으로 라벨링하십시오.
  9. P1000 피펫을 사용하여 각 웰의 내용물을 6-8회 위아래로 피펫하여 세포 덩어리를 부수고 유세포 분석기를 위한 단일 세포 샘플을 만듭니다49.
  10. 각 웰(~500 μL)의 전체 내용물을 스트레이너와 함께 라벨링된 튜브로 옮긴다.
  11. 세포를 올바른 파장의 레이저로 적절한 유세포 분석기 장비로 가져 오십시오 (얼음 위 또는 꺼짐에 세포가있는 튜브를 가져올 수 있음).
    참고 :이 작업에 사용 된 유세포 분석기는 대학 병원에 위치한 핵심 시설의 일부였습니다.
  12. 순방향 및 측면 산란 게이트(각각 FSC 및 SSC)를 생성하여 유세포 분석 소프트웨어 상에서 파편 및 세포 덩어리를 배제하기 위해 적절한 크기 및 세분성의 단일 세포를 포획한다.
  13. 게이트가 설정되면 적절한 게이트로 약 10,000개의 셀을 캡처합니다. 사용자가 찾는 셀룰러 데이터의 양에 따라 이 숫자를 조정합니다. 실험으로부터의 세포를 포함하는 각 튜브에 대해 반복한다.
  14. 실험이 완료되면 분석을 위해 사용 가능한 유세포 분석기 데이터 소프트웨어로 데이터를 가져옵니다.
  15. FSC-SSC 게이트를 생성하고(획득 중 이전과 같이) 실험 데이터의 각 배치에 적용합니다. 유도되지 않은 세포 집단의 참조 우물은이 원고에서이 게이트를 만드는 데 사용되지만 밀도 기반 게이트와 같은 게이트 생성을위한 다른 메트릭이 존재합니다.
  16. FSC-SSC 게이트로 게이팅된 실험 조건으로, 유세포 분석 데이터를 히스토그램으로 플롯하거나 수득된 발현 패턴을 설명하기 위해 다른 방식으로 나타낸다. 이 실험에서, 형광은 GFP/FITC 또는 PE/TexasRed 채널에 의해 포획되었다.

6. 유전자 회로 성분의 RNA 추출 및 정량적 PCR

  1. 24-72시간 유도 후, LPA로부터 세포를 인큐베이터 또는 이미징 후 현미경으로부터 제거하고 이를 조직 배양 후드에 배치한다.
  2. LPA에서 직접 제거한 경우 호일 스트립을 제거하고 플레이트를 잠시 또는 두 분 동안 그대로 두십시오.
  3. 각 웰에서 배지를 흡인하십시오 (모든 웰이 사용되는 경우 전체 24 웰 플레이트 중).
  4. 적절한 RNA 추출 키트를 사용하여 세포로부터 RNA 추출을 진행한다.
  5. RNA 추출이 완료되면 각 시료의 역전사 반응을 수행한다(표 3).
  6. 또한, 각 시료의 정량적 PCR을 수행한다(표 4). DNA 중합효소 및 관련 프로토콜을 활용하여 PCR 반응을 설정합니다. 이 단계에서는 하우스 키핑 유전자 및 관심있는 유전자로 다중화 반응을 설정하거나 별도의 반응을 만듭니다. 이 예에서, GFP, KRAS, 및 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제 (GAPDH) 수준을 프로빙하였다. qRT-PCR 실험을 완료한 후, RNA 수준에서 유전자 회로 폴드 변화를 설명하기 위해 사용 가능한 소프트웨어를 통해 분석을 진행한다.

7. 유전자회로 성분의 면역형광

  1. 얼음 욕조 또는 냉동고를 사용하여 메탄올을 식히십시오.
  2. 24-72시간 유도 후, LPA로부터 세포를 인큐베이터 또는 이미징 후 현미경으로부터 제거하고 이를 조직 배양 후드에 배치한다.
  3. LPA에서 직접 제거한 경우 호일 스트립을 제거하고 플레이트를 1-2 분 동안 그대로 두십시오.
  4. 각 웰에서 배지를 흡인하십시오 (모든 웰이 사용되는 경우 전체 24 웰 플레이트 중).
  5. 각 웰에 0.25% 트립신 100μL를 넣고 플레이트를 플라스틱 뚜껑으로 덮은 다음 인큐베이터에 다시 넣습니다.
  6. 세포를 5분 동안 인큐베이터에 방해받지 않고 방치한다.
  7. 5분 후, 플레이트를 제거하고 이를 조직 배양 후드로 복귀시킨다.
  8. 각 트립신화된 웰을 400 μL의 DMEM으로 중화시킨다.
  9. 미니 원심분리기 튜브에 각 웰에 해당하는 이름을 붙이십시오.
  10. P1000 피펫과 피펫을 사용하여 각 웰의 내용물을 6-8 번 위아래로 사용하여 세포 덩어리를 부수십시오.
  11. 각 웰(~500 μL)의 전체 내용물을 표지된 튜브로 옮긴다.
  12. 세포를 400 x g에서 5분 동안 원심분리한다.
  13. 완료되면 상청액을 버리고 샘플을 화학 흄 후드로 옮깁니다.
  14. 세포를 750-1000 μL의 4% 파라포름알데히드 (포스페이트 완충 식염수, PBS에 희석)에 재현탁시킨다 (P1000 피펫 및 피펫을 각 튜브에서 6-8회 상하로 사용하여 세포 덩어리를 부수어라).
  15. 세포를 실온에서 15 분 동안 앉히십시오.
  16. 인큐베이션 후, 750-1000 μL의 PBS를 첨가한다. 피펫을 여러 번 위아래로 피펫하십시오.
  17. 세포를 400 x g에서 5분 동안 원심분리한다.
  18. 완료되면 상청액을 버리고 샘플을 화학 흄 후드로 옮깁니다.
  19. 세포를 750-1000 μL의 빙냉 메탄올에 재현탁(P1000 피펫 및 피펫을 사용하여 세포 덩어리를 부수기 위해 각 튜브에서 6-8회 상하로 사용함).
  20. 세포를 얼음 위 또는 -20°C 냉동고에 30분 동안 앉히십시오.
  21. 인큐베이션 후, 750-1000 μL의 PBS를 첨가한다. 피펫을 여러 번 위아래로 피펫하십시오.
  22. 세포를 400 x g에서 5분 동안 원심분리한다.
  23. 완료되면 상청액을 버리고 샘플을 화학 흄 후드로 옮깁니다.
  24. 사용된 항체의 유형에 따라, 이 시점부터 프로토콜을 수정한다. 7.24.1-7.24.14 또는 7.24.15-7.24.22단계를 수행합니다.
    1. 일차 및 이차 항체를 사용하는 경우, P1000/P200 피펫 및 피펫을 사용하여 세포를 각 튜브에 6-8회 상하로 재현탁시켜 100μL의 일차 항체에서 세포 덩어리를 파괴한다. 이 경우, KRAS 항체 또는 ERK 항체를 포함하는 스톡 항체에 대해 1:800의 희석이 이루어졌으며, 실온에서 1시간 동안 방치하였다. 항체를 0.5 g의 BSA와 함께 1x PBS로부터 만들어진 인큐베이션 완충액에서 희석하였다.
      참고: 관심있는 항원 대 항체 희석의 표준 곡선을 작성하여 경험적으로 항체의 정확한 희석을 결정하십시오.
    2. 항체를 첨가 한 후, 표지 된 항체에 대한 가벼운 영향을 방지하기 위해 호일로 튜브를 덮으십시오.
    3. 인큐베이션 후, 750-1000 μL의 인큐베이션 버퍼를 첨가한다. 피펫을 여러 번 위아래로 피펫하십시오.
    4. 세포를 400 x g에서 5분 동안 원심분리한다.
    5. 완료되면 상청액을 버리고 샘플을 화학 흄 후드로 옮깁니다.
    6. P1000/P200 피펫과 피펫을 사용하여 세포를 각 튜브에 6-8회 상하로 재현탁시켜 100 μL의 이차 항체에서 세포 덩어리를 파괴한다. 이 경우, 세포를 KRAS 항체에 대해 1:800 또는 ERK 항체에 대해 1:2000의 희석액으로 100 μL 이차 항체에 재현탁시키고, 실온에서 30분 동안 앉아두었다. 일차 항체와 유사하게, 상기 기재된 바와 같이 인큐베이션 완충액 중의 이차 항체를 희석한다. 표준 곡선의 경험적 발견에 기초하여 이차 항체의 희석을 결정한다.
    7. 항체를 첨가 한 후, 표지 된 항체에 대한 가벼운 영향을 방지하기 위해 호일로 튜브를 덮으십시오.
    8. 인큐베이션 후, 750-1000 μL의 인큐베이션 완충액을 첨가한다. 피펫을 여러 번 위아래로 피펫하십시오.
    9. 세포를 400 x g에서 5분 동안 원심분리한다.
    10. 완료되면 상청액을 버리고 샘플을 화학 흄 후드로 옮깁니다.
    11. P1000 피펫 및 피펫을 사용하여 세포를 각 튜브에 6-8회 상하로 재현탁시켜 500 μL의 PBS에서 세포 덩어리를 파괴한다.
    12. 각 튜브 (~ 500 μL)의 전체 내용물을 스트레이너가있는 라벨이 붙은 튜브로 옮깁니다.
    13. 세포를 올바른 파장의 레이저로 적절한 유세포 측정 장비로 가져 오십시오 (얼음 위 또는 꺼짐에 세포가있는 튜브를 가져올 수 있음).
      참고: 몇 가지 대조군을 갖는 것은 유세포 측정 및 조작된 세포 유전자 발현의 분석을 진행하는 데 중요하다는 점에 유의해야 한다. 예를 들어, 완전히 염색되지 않은 세포를 갖는, 일차 항체 단독으로 염색된 세포, 및 이차 항체 단독으로 염색된 세포는 항체로부터의 배경 신호와 결과를 비교하는데 유용할 수 있다.
    14. 다음으로, 섹션 5에 설명된 대로 분석을 진행한다.
    15. 일차 항체만을 사용하는 경우, P1000/P200 피펫 및 피펫을 사용하여 세포를 각 튜브에 6-8회 상하로 재현탁시켜 표지된 일차 항체 100μL에서 세포 덩어리를 파괴한다. 적절한 항체 희석을 결정하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 표준 곡선으로부터 항체 희석을 경험적으로 결정한다.
    16. 항체를 첨가 한 후, 표지 된 항체에 대한 가벼운 영향을 방지하기 위해 호일로 튜브를 덮으십시오.
    17. 인큐베이션 후, 750-1000 μL의 인큐베이션 버퍼를 첨가한다. 피펫을 여러 번 위아래로 피펫하십시오.
    18. 세포를 400 x g에서 5분 동안 원심분리한다.
    19. P1000 피펫 및 피펫을 사용하여 세포를 각 튜브에 6-8회 상하로 재현탁시켜 500 μL의 PBS에서 세포 덩어리를 파괴한다.
    20. 각 튜브 (~ 500 μL)의 전체 내용물을 스트레이너가있는 라벨이 붙은 튜브로 옮깁니다.
    21. 세포를 올바른 파장의 레이저로 적절한 유세포 측정 장비로 가져 오십시오 (얼음 위 또는 꺼짐에 세포가있는 튜브를 가져올 수 있음).
      참고: 몇 가지 대조군을 갖는 것은 유세포 측정 및 조작된 세포 유전자 발현의 분석을 진행하는 데 중요하다는 점에 유의해야 한다. 완전히 염색되지 않은 세포 및 일차 항체 단독으로 염색된 세포는 항체로부터의 배경 신호와 결과를 비교하는데 유용하다.
    22. 이 시점부터 섹션 5에 설명된 대로 분석을 진행하십시오.

결과

유전자 회로 어셈블리 및 본 문서 내의 안정한 세포주 생성은 전사 활성, 단일 안정한 FRT 부위를 함유하는 상업적이고 변형된 HEK-293 세포에 기초하였다 (도 1). 유전자 회로는 플라스미드 내에 FRT 부위가 있는 벡터로 구축되어 HEK-293 세포 게놈 내로의 Flp-FRT 통합을 허용하였다. 이 접근법은 FRT 부위가 CRISPR/Cas950과 같은 DNA 편집 기술을 사용하여 게놈의 어느 ?...

토론

이 기사의 독자는 1) 유전자 회로 설계, 구축 및 검증을 포함하여 광유전학 유전자 회로 (및 다른 유전자 발현 시스템)를 특성화하는 데 필수적인 단계에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 2) 안정한 세포주 내로 유전자 회로를 도입하기 위한 세포 공학 (예를 들어, Flp-FRT 재조합); 3) LPA와 같은 광기반 플랫폼을 이용한 조작된 세포의 유도; 4) 형광 현미경을 통한 광 유도 분석의 초기 특성화; 및 5) 유?...

공개

저자들은 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 말

우리는 의견과 제안에 대한 Balázsi 실험실, 첫 번째 LPA를 구성하는 데 도움을 준 Karl P. Gerhardt 박사와 Jeffrey J. Tabor 박사, LOV2-degron 플라스미드를 공유 한 Wilfried Weber 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 보건원 [R35 GM122561 및 T32 GM008444]의 지원을 받았다. The Laufer Center for Physical and Quantitative Biology; 그리고 국방 과학 및 공학 대학원 (NDSEG) 펠로우십. 오픈 액세스 요금에 대한 자금 조달 : NIH [R35 GM122561].

저자 기여도 : M.T.G.와 G.B.가 프로젝트를 구상했습니다. M.T.G., D.C., L.G.는 실험을 수행했다. M.T.G., D..C., L.G., G.B.는 데이터를 분석하고 원고를 준비했습니다. G.B.와 M.T.G.는 프로젝트를 감독했습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 mL PCR tubesEppendorf951010006reagent for carrying out PCR
0.25% Trypsin EDTA 1XThermo Fisher ScientificMT25053CIreagent for splitting & harvesting mammalian cells
0.5-10 μL Adjustable Volume PipetteEppendorf3123000020tool used for pipetting reactions
100-1000 μL Adjustable Volume PipetteEppendorf3123000039tool used for pipetting reactions
20-200 μL Adjustable Volume PipetteEppendorf3123000055tool used for pipetting reactions
2-20 μL Adjustable Volume PipetteEppendorf3123000039tool used for pipetting reactions
5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer CapCorning352235reagent for flow cytometry
5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 VEppendorf22628113equipment for mammalian culture work
AgaroseDenville ScientificGR140-500reagent for gel electrophoresis
Aluminum Foils for 96-well PlatesVWR®60941-126tool used for covering plates in light-induction experiments
AmpicillinSigma AldrichA9518-5Greagent for selecting bacteria with correct plasmid
Analog vortex mixerThermo Fisher Scientific02215365PRtool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
Bacto Dehydrated AgarFisher ScientificDF0140010reagent for growing bacteria
BD LSRAriaBD656700tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations
BD LSRFortessaBD649225tool for characterizing engineered cell lines
BSA, Bovine Serum AlbumineGovernment Scientific SourceSIGA4919-1Greagent for IF incubation buffer
Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TCCorning353043plate used for growing monoclonal cells
CentrifugeVWR22628113instrument for mammalian cell culture
Chemical fume hoodN/AN/Ainstrument for carrying out IF reactions
Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lidBD353047plate used for growing monoclonal cells
CytoOne T25 filter cap TC flaskUSA ScientificCC7682-4825container for growing mammalian cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fischer ScientificBP231-100reagent used for freezing down engineered mammalian cells
Ethidium BromideThermo Fisher Scientific15-585-011reagent for gel electrophoresis
Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with LidCorning353072container for growing sorted monoclonal cells
FCS ExpressDe Novo Software:N/Asoftware for characterizing flow cytometry data
Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mLCorning35-010-CVreagent for growing mammalian cells
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mmFisher ScientificFB0875712equipment for growing bacteria
Gibco DMEM, High GlucoseThermo Fisher Scientific11-965-092reagent for growing mammalian cells
Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression AssayLife Technologies4331182qPCR Probe
Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mLLife Technologies10687-010reagent for selecting cells with proper gene circuit integration
iScript Reverse Transcription SupermixBio-Rad Laboratories1708890reagent for converting RNA to cDNA
Laboratory Freezer -20 °CVWR76210-392equipment for storing experimental reagents
Laboratory Freezer -80 °CPanasonicMDF-U74VCequipment for storing experimental reagents
Laboratory Refrigerator +4 °CVWR76359-220equipment for storing experimental reagents
LB Broth (Lennox) , 1 kgSigma-AldrichL3022-250Greagent for growing bacteria
LIPOFECTAMINE 3000Life TechnologiesL3000008reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells
MATLAB 2019MathWorksN/Asoftware for analyzing experimental data
MethanolAcros Organics413775000reagent for immunofluorescence reaction
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mLVWR20170-333plasticware container
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression AssayLife Technologies4331182qPCR Probe
MultiTherm ShakerBenchmark ScientificH5000-HCequipment for bacterial transformation
NanoDrop Lite SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND-NDL-US-CANequipment for DNA/RNA concentration measurement
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master MixNEBM0492Sreagent for PCR of gene circuit fragments
NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency)New England Biolabs (NEB)C3019Hbacterial cells for amplifying gene circuit of interest
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNew England Biolabs (NEB)E2621Lreagent for combining gene circuit fragements
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 cameraNikon Instruments Inc.N/Ainstrument for quantifying gene expression
NIS-ElementsNikon Instruments Inc.N/Asoftware for characterizing fluorescence microscopy data
oligonucleotidesIDTN/Areagent used for PCR of gene circuit components
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 ControlPanasonicMCO-170AICUVHL-PAinstrument for growing mammalian cells
Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy GradeElectron Microscopy Sciences15710-Sreagent
PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x)Invitrogen14190144reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100xFisher Scientific15140-122reagent for growing mammalian cells
primary ERK antibodyCell Signaling Technology4370Sprimary ERK antibody for immunifluorescence
primary KRAS antibodySigma-AldrichWH0003845M1primary KRAS antibody for immunifluorescence
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)Qiagen27106reagent kit for purifying gene circuit plasmids
QIAquick Gel Extraction Kit (50)Qiagen28704reagent kit for purifying gene circuit fragments
QuantStudio 3 Real-Time PCR SystemEppendorfA28137equipment for qRT-PCR
Relative Quantification AppThermo Fisher ScientificN/Asoftware for quantifying RNA/cDNA amplificaiton
RNeasy Plus Mini KitQiagen74134kit for extracting RNA of engineered mammalian cells
Secondary ERK antibodyCell Signaling Technology8889Ssecondary ERK antibody for immunifluorescence
secondary KRAS antibodyInvitrogenA11005secondary KRAS antibody for immunifluorescence
Serological Pipets 5.0 mLOlympus Plastics12-102reagents used for setting up a variety of chemical reactions
SmartView Pro Imager SystemMajor ScienceUVCI-1200tool for imaging correct PCR bands
SnapGene Viewer (free) or SnapGeneSnapGeneN/Asoftware DNA sequence design and analysis
Stage top incubatorTokai HitINU-TIZtool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444557reagent for PCR of gene circuit fragments
TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxnLife Technologies4326317EqPCR Probe
ThermocyclerBio-Rad1851148tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture TreatedPerkinElmer1450-605plate used for light-induction experiments
VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cmVWR14673-010reagent for mammalian cell culture
VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel SystemVWR89032-290equipment for DNA gel electrophoresis
Flp-In 293Thermo Fisher ScientificR75007Engineered cell line with FRT site

참고문헌

  1. Sedlmayer, F., Hell, D., Muller, M., Auslander, D., Fussenegger, M. Designer cells programming quorum-sensing interference with microbes. Nature Communications. 9 (1), 1822 (2018).
  2. Cho, J. H., Collins, J. J., Wong, W. W. Universal chimeric antigen receptors for multiplexed and logical control of T cell responses. Cell. 173 (6), 1426-1438 (2018).
  3. Saxena, P., et al. A programmable synthetic lineage-control network that differentiates human IPSCs into glucose-sensitive insulin-secreting beta-like cells. Nature Communications. 7, 11247 (2016).
  4. Nevozhay, D., Zal, T., Balazsi, G. Transferring a synthetic gene circuit from yeast to mammalian cells. Nature Communications. 4, 1451 (2013).
  5. Chang, H. H., Hemberg, M., Barahona, M., Ingber, D. E., Huang, S. Transcriptome-wide noise controls lineage choice in mammalian progenitor cells. Nature. 453 (7194), 544-547 (2008).
  6. Balazsi, G., van Oudenaarden, A., Collins, J. J. Cellular decision making and biological noise: from microbes to mammals. Cell. 144 (6), 910-925 (2011).
  7. Lee, J., et al. Network of mutually repressive metastasis regulators can promote cell heterogeneity and metastatic transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 364-373 (2014).
  8. Dar, R. D., Hosmane, N. N., Arkin, M. R., Siliciano, R. F., Weinberger, L. S. Screening for noise in gene expression identifies drug synergies. Science. 344 (6190), 1392-1396 (2014).
  9. Becskei, A., Seraphin, B., Serrano, L. Positive feedback in eukaryotic gene networks: cell differentiation by graded to binary response conversion. EMBO Journal. 20 (10), 2528-2535 (2001).
  10. Nevozhay, D., Adams, R. M., Murphy, K. F., Josic, K., Balazsi, G. Negative autoregulation linearizes the dose-response and suppresses the heterogeneity of gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5123-5128 (2009).
  11. Guinn, M. T., Balazsi, G. Noise-reducing optogenetic negative-feedback gene circuits in human cells. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7703-7714 (2019).
  12. Shimoga, V., White, J. T., Li, Y., Sontag, E., Bleris, L. Synthetic mammalian transgene negative autoregulation. Molecular Systems Biology. 9, 670 (2013).
  13. Ye, H., Daoud-El Baba, M., Peng, R. W., Fussenegger, M. A synthetic optogenetic transcription device enhances blood-glucose homeostasis in mice. Science. 332 (6037), 1565-1568 (2011).
  14. Pudasaini, A., El-Arab, K. K., Zoltowski, B. D. LOV-based optogenetic devices: light-driven modules to impart photoregulated control of cellular signaling. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 18 (2015).
  15. Liu, Y., et al. Robust and intensity-dependent synaptic inhibition underlies the generation of non-monotonic neurons in the mouse inferior colliculus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 131 (2019).
  16. Benzinger, D., Khammash, M. Pulsatile inputs achieve tunable attenuation of gene expression variability and graded multi-gene regulation. Nature Communications. 9 (1), 3521 (2018).
  17. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  18. Duan, L., et al. Understanding CRY2 interactions for optical control of intracellular signaling. Nature Communications. 8 (1), 547 (2017).
  19. Kim, N., et al. Spatiotemporal control of fibroblast growth factor receptor signals by blue light. Chemistry & Biology. 21 (7), 903-912 (2014).
  20. Jung, H., et al. Noninvasive optical activation of Flp recombinase for genetic manipulation in deep mouse brain regions. Nature Communications. 10 (1), 314 (2019).
  21. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. Light-inducible gene regulation with engineered zinc finger proteins. Methods in Molecular Biology. 1148, 89-107 (2014).
  22. Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo activities of light-inducible dimers: A cellular optogenetics guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
  23. Lee, D., Hyun, J. H., Jung, K., Hannan, P., Kwon, H. B. A calcium- and light-gated switch to induce gene expression in activated neurons. Nature Biotechnology. 35 (9), 858-863 (2017).
  24. Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
  25. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546 (2016).
  26. Chen, R., et al. Rhythmic PER abundance defines a critical nodal point for negative feedback within the circadian clock mechanism. Molecular Cell. 36 (3), 417-430 (2009).
  27. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  28. Sato, T. K., et al. Feedback repression is required for mammalian circadian clock function. Nature Genetics. 38 (3), 312-319 (2006).
  29. Kramer, B. P., Fischer, C., Fussenegger, M. BioLogic gates enable logical transcription control in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 478-484 (2004).
  30. Madar, D., Dekel, E., Bren, A., Alon, U. Negative auto-regulation increases the input dynamic-range of the arabinose system of Escherichia coli. BMC Systems Biology. 5, 111 (2011).
  31. Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, 35363 (2016).
  32. Szczesny, R. J., et al. Versatile approach for functional analysis of human proteins and efficient stable cell line generation using FLP-mediated recombination system. PLoS One. 13 (3), 0194887 (2018).
  33. Taxis, C. Development of a synthetic switch to control protein stability in eukaryotic cells with light. Methods in Molecular Biology. 1596, 241-255 (2017).
  34. Grav, L. M., et al. Minimizing clonal variation during mammalian cell line engineering for improved systems biology data generation. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2148-2159 (2018).
  35. Brophy, J. A., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nature Methods. 11 (5), 508-520 (2014).
  36. Yeoh, J. W., et al. An automated biomodel selection system (BMSS) for gene circuit designs. ACS Synthetic Biology. 8 (7), 1484-1497 (2019).
  37. Usherenko, S., et al. Photo-sensitive degron variants for tuning protein stability by light. BMC Systems Biology. 8, 128 (2014).
  38. Muller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. An optogenetic upgrade for the Tet-OFF system. Biotechnology and Bioengineering. 112 (7), 1483-1487 (2015).
  39. Klotzsche, M., Berens, C., Hillen, W. A peptide triggers allostery in tet repressor by binding to a unique site. Journal of Biological Chemistry. 280 (26), 24591 (2005).
  40. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  41. Herrou, J., Crosson, S. Function, structure and mechanism of bacterial photosensory LOV proteins. Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 713-723 (2011).
  42. Yao, F., et al. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Human Gene Therapy. 9 (13), 1939-1950 (1998).
  43. Erlich, H. A. . PCR technology : Principles and Applications for DNA Amplification. , (1989).
  44. Sambrook, J., Russell, D. W., Sambrook, J. . The condensed protocols from Molecular cloning : a laboratory manual. , (2006).
  45. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  46. Gerhardt, K. P., Castillo-Hair, S. M., Tabor, J. J. DIY optogenetics: Building, programming, and using the Light Plate Apparatus. Methods in Enzymology. 6224, 197-226 (2019).
  47. Stockley, J. H., et al. Surpassing light-induced cell damage in vitro with novel cell culture media. Scientific Reports. 7 (1), 849 (2017).
  48. Gordon, A., et al. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nature Methods. 4 (2), 175-181 (2007).
  49. Ordovas, L., et al. Efficient recombinase-mediated cassette exchange in hPSCs to study the hepatocyte lineage reveals AAVS1 locus-mediated transgene inhibition. Stem Cell Reports. 5 (5), 918-931 (2015).
  50. Gomez Tejeeda Zanudo, J., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).
  51. Sweeney, K., Moreno Morales, N., Burmeister, Z., Nimunkar, A. J., McClean, M. N. Easy calibration of the Light Plate Apparatus for optogenetic experiments. MethodsX. 6, 1480-1488 (2019).
  52. Ravindran, P. T., Wilson, M. Z., Jena, S. G., Toettcher, J. E. Engineering combinatorial and dynamic decoders using synthetic immediate-early genes. Communications Biology. 3 (1), 436 (2020).
  53. Chen, X., Wang, X., Du, Z., Ma, Z., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression in mammalian cells and in mice using the LightOn system. Current Protocols in Chemical Biology. 5 (2), 111-129 (2013).
  54. Guinn, M. T. Engineering human cells with synthetic gene circuits elucidates how protein levels generate phenotypic landscapes. State University of New York at Stony Brook. , (2020).
  55. Farquhar, K. S., et al. Role of network-mediated stochasticity in mammalian drug resistance. Nature Communications. 10 (1), 2766 (2019).
  56. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemistry & Biology. 11 (3), 198-200 (2015).
  57. Guinn, M. T., et al. Observation and control of gene expression noise: Barrier crossing analogies between drug resistance and metastasis. Frontiers in Genetics. 11, 586726 (2020).
  58. Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342 (6163), 1193-1200 (2013).
  59. Rullan, M., Benzinger, D., Schmidt, G. W., Milias-Argeitis, A., Khammash, M. An optogenetic platform for real-time, single-cell interrogation of stochastic transcriptional regulation. Molecular Cell. 70 (4), 745-756 (2018).
  60. Perkins, M. L., Benzinger, D., Arcak, M., Khammash, M. Cell-in-the-loop pattern formation with optogenetically emulated cell-to-cell signaling. Nature Communications. 11 (1), 1355 (2020).

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