הכנת רשת מהירה למיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית שנפתרה בזמן

Summary

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לשימוש בהתקן מהיר לייצור רשת הן לייצור רשת מהירה והן לערבוב מהיר והקפאה כדי לבצע ניסויים שנפתרו בזמן.

Abstract

תחום המיקרוסקופיה הקריו-אלקטרונית (cryo-EM) מתפתח במהירות עם אלגוריתמי חומרה ועיבוד חדשים, ומייצר מבנים ברזולוציה גבוהה יותר ומידע על מערכות מאתגרות יותר. הכנה לדוגמה עבור cryo-EM עוברת מהפכה דומה עם גישות חדשות שפותחו כדי מחליף את מערכות הכתמים המסורתיות. אלה כוללים שימוש במתקנים פיזו-חשמליים, הדפסת סיכות וריסוס ישיר. כתוצאה מהתפתחויות אלה, מהירות הכנת הרשת עוברת משניות לאלפיות שניה, ומספקת הזדמנויות חדשות, במיוחד בתחום ה-cryo-EM שנפתר בזמן שבו חלבונים ומצעים יכולים להיות מעורבים במהירות לפני הקפאת הצלילה, לכידת מצבי ביניים קצרי מועד. כאן אנו מתארים בפירוט פרוטוקול סטנדרטי ליצירת רשתות במכשיר ה- EM שלנו שנפתר בזמן הבית הן להכנת רשת מהירה סטנדרטית והן לניסויים שנפתרו בזמן. הפרוטוקול דורש מינימום של כ 50 μL מדגם בריכוזים של ≥ 2 מ"ג / מ"ל להכנת 4 רשתות. העיכוב בין יישום מדגם להקפאה יכול להיות נמוך ככל 10 ms. מגבלה אחת היא עובי קרח מוגבר במהירויות גבוהות יותר בהשוואה לשיטת הכתם. אנו מקווים שפרוטוקול זה יסייע לאחרים לעצב מכשירים משלהם לייצור רשתות ואלה המעוניינים לתכנן ניסויים שנפתרו בזמן.

Introduction

רקע
ההתפתחויות האחרונות במיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית (cryo-EM) אפשרו מחקרים מבניים של מערכות מורכבות יותר ויותר ברזולוציה גבוהה. למעט כמה יוצאים מן הכלל, מחקרים כאלה הוגבלו למקרומולקולים ביולוגיים בשיווי משקל¹ או תגובות איטיות יחסית². תהליכים רבים ב- vivo מתרחשים בציר זמן מהיר יותר (אלפיות שניה) ויש עניין גובר בהקפאה-EM (TrEM) שנפתרה בזמן בלוחות זמנים אלה³. עם זאת, הכנה מדגם cryo-EM קונבנציונאלי על ידי שיטת blotting הוא איטי מדי עבור TrEM אלפית השנייה.

לשיטת הכתמים יש מגבלות אחרות מלבד רזולוציית זמן ירודה. חלבונים ומתחמי חלבון יכולים לסבול דנטורציה או אוריינטציה מועדפת על רשתות⁴. הפחתת זמן החשיפה לממשק מי האוויר במהלך הכנת המדגם הוכח כדי למתן את הכיוון המועדף ואת denaturation חלבון^5,6. לכן, הכנת רשת מהירה לא רק מאפשרת TrEM אלפיות השנייה, אלא גם יכול לשפר את איכות הרשת.

נכון לעכשיו, ישנן שלוש גישות שונות להכנת רשת אוטומטית. הגישה הראשונה משתמשת בסיכה או נימה המכילה כמות קטנה של מדגם. לאחר יצירת מגע בין הנוזל לבין משטח הרשת, המדגם 'כתוב' על הרשת^7,8. תהליך היישום לדוגמה איטי יחסית ונמשך מספר שניות. גישה חלופית משתמשת בדור טיפות מבוקר על ידי מתקן פיזו ורשתות מנדלות עצמיות⁹. זה מאפשר חלוקה מהירה יותר להקפיא את הזמנים, אבל עדיין מוגבל על ידי טיפה ומהירות מנדלות (כרגע מגיע 54 ms). הגישה המהירה ביותר עד כה היא גישת הריסוס הישירה, שבה המדגם אטומ בזרבובית ספריי והטיפות הקטנות (~ 10 - 20 מיקרומטר) ומהירות (> 5 מ'/ש') מתפשטות במגע עם רשת cryo-EM. תרסיס מדגם יכול להיווצר בדרכים שונות כגון אטומיזרים airblast, גלים אקוסטיים פני השטח או מכשירי אדים קוליים^10,11,12,13. מניסיוננו, עובי הקרח עם גישת הריסוס הישיר גדול יותר אך ריסוס ישיר מאפשר להקפיא את זמני < 10 מיליות.

פרוטוקול זה מתאר צעד אחר צעד כיצד ניתן להשתמש בהתקן EM (TED) שנפתר בזמן המצויד בזרבובית ריסוס מיקרופלואידית להכנת רשתות בציר זמן מהיר^14,15. המכשיר שימש להכנת רשתות עם זמן השהיה מינימלי של 6 אלפיות השנייה בין יישום מדגם להקפאה ולערבוב מהיר ולהקפיא שתי דגימות. העיצוב של TED מבוסס על^{גרסה קודמת 16} והוא דומה למכשירי cryo-EM מבוססי ריסוס אחרים^17.

ראשית, ארבעת החלקים העיקריים של הגדרת TED מתוארים. ליבת ה-TED היא יחידת הטיפול בנוזלים, האחראית על שאיפה וחלוקה לדוגמה. בוכנה פנאומטית מעבירה את הרשת דרך התרסיס לתוך האתאן הנוזלי. הדור של התרסיס מושגת עם חרירים ריסוס microfluidic והקפאה נעשית במיכל אתאן נוזלי, אשר מתוארים בקצרה. לבסוף, התכונות הנוספות לשליטה בסביבת הרשת, במיוחד לחות, מסומנות. לאחר מכן יש פרוטוקולים מפורטים להפעלת המכשיר ולביצוע ניסויי TrEM. תוצאות מייצגות ניתנות להכנת רשת מהירה וניסוי TrEM פשוט.

התקנה ניסיונית

יחידת הטיפול בנוזלים
מערכת הטיפול הנוזלי של TED נוצרת על ידי שלוש משאבות כונן מזרק ('משאבות 1 - 3'), כל אחת מצוידת שסתום סיבובי(איור 1). ספק כוח מספק משאבות 1- 3 עם 24 V DC. תקשורת עם תוכנת הבקרה (כתובה ב- Visual Basic ו- C++) מתבצעת באמצעות ממשק RS232 לשאיבה 1. הפקודות מופצות דרך יציאות הרחבת קלט/פלט טוריות ממשאבה 1 למשאבות 2-3. משאבות 1-3 מצוידות במזרקי זכוכית (מזרקים 1-3', אנו משתמשים כאן במזרקי נפח מת μL/אפס). לכל שסתום יש שתי תנוחות, 'עומס' ו'לוותר '. תנוחת ה"עומס" משמשת לשאיפה לדגימה לתוך המזרק. חתיכה קצרה (~ 3 - 4 ס"מ) של 1/16 " O.D., 0.01′′ I.D. צינורות FEP מחובר באמצעות אביזרי FLFE / ETFE flANGELESS למיקום 'עומס' של שסתומים 1-3. פיסת צינורות קצרה זו מגיעה למאגר הדגימה (בדרך כלל צינור פלסטיק 1.5 מ"ל או 0.5 מ"ל). תנוחת ה'מחלק' מובילה לזרבובית הריסוס. החיבור בין שקע 'לוותר' לבין זרבובית ספריי נעשה על ידי צינורות PE (~ 20-30 ס"מ אורך, 0.043 "O.D., 0.015 " I.D.), עם חתיכת קצרה של צינורות שרוול (~ 0.5 ס"מ) ואביזרים ETFE / ETFE flangeless.

הבוכנה הפנאומטית
TED משתמש בוכנה פנאומטית כדי להאיץ את הרשת ולהעביר אותו דרך תרסיס המדגם לתוך מיכל האתאן הנוזלי. פינצטה בלחץ שלילי מחזיקה את הרשת, מוברגת למחזיק ביתי שמותקן על גליל פנאומטי כפול(איור 2A).

הלחץ מסופק מבלון גז חנקן גדול (גודל W), המצויד בווסת רב-שלבי (0 - 10 בר, 'לחץ עיקרי'). צינורות PVC מחוזקים גמישים (12 מ"מ O.D.) מחברים את הרגולטור לסעפת 12 יציאות שבה מועבר חנקן בלחץ לזרבובית ולבוכנה הפנאומטית. זרימת גז דרך הזרבובית קבועה, מווסתת ישירות בצילינדר החנקן (הלחץ העיקרי). החיבור לזרבובית נעשה עם צינורות PU (4 מ"מ O.D., 2.5 מ"מ זהות), חתיכה קצרה של צינורות PE (~ 8 ס"מ אורך, 0.043 "O.D., 0.015 "I.D.) ומחברים מתאימים. לחץ על הבוכנה הפנאומטית נשלט באמצעות שסתום סולנואיד. צינורות PU (4 מ"מ O.D., 2.5 מ"מ זהות) מחבר את שסתום סולנואיד עם מווסת ואת הבוכנה פנאומטית, כדי לאפשר לחץ צלילה מופחת (≤ הלחץ העיקרי). שסתום סולנואיד נשלט על ידי המחשב. מבט כולל סכמטי על ההתקנה ניתן באיור 2B.

שים לב כי עם התקנה זו לחץ הצלילה הוא תמיד שווה או קטן יותר מאשר לחץ גז ספריי (לחץ עיקרי). עם זאת, ההתקנה יכולה להשתנות בקלות על ידי שילוב של וסת שני במעלה הזרם של זרבובית ספריי כדי לאפשר מהירויות צלילה גבוהות יותר בלחץ גז ספריי נמוך. לחצים גבוהים (>> 2 בר) עלולים להזיק לזרבובית ספריי PDMS.

זהירות: זוהי מערכת בלחץ ואת "הלחץ העיקרי" תמיד צריך להיות < 7 בר.

לחצים בין 0.5 ל 2 בר משמשים בדרך כלל עבור הבוכנה פנאומטית ומציגים קשר ליניארי בקירוב בין לחץ ומהירות (במיקום האנכי של התרסיס). מהירויות הצלילה נמדדות באוספילוסקופ, המחוברות בהתאם לפוטנציומטר שקופית (10 kΩ) ובמקביל נגד 2 kΩ (איור 2C). ספק כוח מספק את הפוטנציומטר עם 9 V DC. בעוד מהירות הצלילה המשוערת מוגדרת לפני הניסוי על ידי הגדרת לחץ הצלילה, הפוטנציומטר נותן קריאה מדויקת של המהירות לאחר הניסוי.

חריני ריסוס ומיכל אתאן נוזלי
הייצור וההפעלה של חריקות וירטואליות דינמיות גז עבור משלוח מדגם מבוסס ספריי תוארו במקומות אחרים בפירוט¹⁵. כפי שתואר לעיל, שקעי 'מחלק' של שסתומים 1-3 מחוברים למפרצונים הנוזליים של הזרבובית (איור 3A). גז הריסוס בלחץ מחובר לפצצת הגז של הזרבובית. המפרצונים בזרבוביות ספריי PDMS הן כאלה כי צינורות 0.043 "O.D. PE ניתן להשתמש ישירות ללא צורך אביזרי. עיצוב הזרבובית שלנו מכיל גיאומטריית 'סילון סילון' לערבוב של שתי דוגמאות, בדומה למכשיר המתואר בנציג^18. תרשים של העיצוב מוצג באיור 3B, תמונה מיקרוסקופית של זרבובית מוצגת באיור 3C. הפריסה של המכשיר microfluidic דורש שימוש בשלושה מזרקים לערבב שתי דגימות. זרבובית הריסוס ממוקמת בדרך כלל במרחק של 1-1.5 ס"מ מהרשת (במהלך יישום מדגם).

אנו משתמשים באתאן נוזלי כקריוגן, במיכל אתאן נוזלי/חנקן המשמש לשיטת הכתמים הסטנדרטית. מיקום אנכי של האתאן הנוזלי מושגת עם פלטפורמת הרמת מעבדה.

שליטה בסביבת הריסוס והרשת
הבוכנה וזרבובית הריסוס כלולים בתוך תיבת PMMA (זכוכית אקרילית) שנבנתה בהתאמה אישית עם דלת כפולה(איור 4A). לחות יחסית גבוהה בתוך הקופסה מושגת על ידי מערכת לחות אוויר בחלק האחורי של TED (איור 4B). האוויר מסופק על ידי משאבה ומוזן למיכל הראשון של "10 (המשמש בדרך כלל לטיהור מי כיור). המיכל מלא בגובה מים נמוך (~ 5-10 ס"מ) וגם מכיל יחידת מכשירי אדים. עוצמת החשמל של מכשיר הלחות נשלטת על ידי בקר לחות/טמפרטורה דיגיטלי וחיישן לחות/טמפרטורה הממוקם בתוך קופסת הזכוכית האקרילית. הבקר מוגדר לכבות את המשאבה כאשר הלחות היחסית מגיעה ≥ 90%. אוויר לח מהמיכל הראשון נשאב דרך מפזר, שקוע במים במיכל 10 " שני ולאחר מכן נכנס לקופסת הזכוכית האקרילית.

אזהרה: מכיוון שהדגימה מתרסיס בזרבובית ספריי, דגימה ביולוגית או כימית מסוכנת אינם מתאימים כדגימות.

רצף הריצה
לחצן הפעל Script בתוכנת הבקרה מאתחל את רצף הריצה. ניתן להגדיר מראש רצף פקודות זה בקובץ Script ולשנותו באמצעות התוכנה. המשתנים החשובים ביותר מוסברים כאן:

מהירות ריסוס: מהירות הריסוס קובעת את קצב הזרימה הנוזלי המשמש את משאבת המזרק. ניתן לחשב את קצב הזרימה כדלקמן: למנועי משאבת המזרק המשמשים כאן יש גודל שלב קבוע. הטווח המלא של המשאבה מחולק ל-48,000 צעדים. הגורם החשוב השני הוא נפח המזרק. אנחנו בדרך כלל משתמשים במזרקי μL 250. מהירות הריסוס בתוכנת הבקרה מוגדרת כמספר שלבים/שניה. מהירות ריסוס של 1000 שלבים/שניה תואמת ל:

נפח ריסוס: נפח הריסוס קובע את הנפח הכולל שיש לרסס. לכן, הוא גם קובע את משך התרסיס. עוצמת הקול של הריסוס בתוכנת הבקרה מוגדרת כמספר שלבים. נפח ספריי של 2000 צעדים, במהירות ריסוס של 1000 צעדים לשנייה, מוביל משך ריסוס של 2 s ונפח כולל של 10.4 μL.

זמן קדם ריסוס: משתנה זה מגדיר את הזמן בין ייזום התרסיס לצלילה. חשוב לבחור את זמן ההשהיה כך שלתרסיס יש מספיק זמן לייצב לפני הצלילה ברשת. בדרך כלל, התרסיס ניתן 1.5 - 4 s כדי לייצב לפני הרשת הוא צלל. התרסיס נשמר עד שהרשת עברה. בדרך כלל, זרימת הנוזל (ולכן התרסיס) נעצר 0.5 ל 1 s לאחר הרשת כבר צלל. באמצעות מהירות ריסוס של 1000 צעדים/s ונפח ריסוס של 2000 צעדים, זמן טרום ספריי טיפוסי הוא 1.5 s, למשל.

רצף פקודות למופת מוצג באיור 5A, מיקום הרשת לאורך זמן מומחש באיור 5B.

Protocol

1. הכנת המערכת

הערה: הפרוטוקול הבא מתאר כיצד להכין רשתות של דוגמה אחת. בדרך כלל, מינימום של 2 רשתות לשכפל מוכנים עבור כל מדגם או תנאי. למהירויות צלילה גבוהות יותר (פחות מ- ~ 20 ms זמן השהיית זמן), רשתות 3 או 4 לשכפל מוכנים בדרך כלל להסביר מספר מופחת של אזורי קרח דקים.

1. לדלל את דגימת החלבון לריכוז היעד במאגר הרצוי. בדרך כלל, ריכוזים סופיים ≥ 2 מ"ג / מ"ל לעבוד היטב להכנת רשת עם TED. שים לב כי המדגם יכול להישמר על קרח עד שלב 10, החל בשלב 10 ואילך המדגם יבלה זמן ניכר בטמפרטורת החדר כפי שלוקח כ 20 דקות להכין 3-4 רשתות.
2. תדליק את ה-TED. לאחר מכן הפעל את מחשב הבקרה והפעל את תוכנת הבקרה.
3. אתחל את כל משאבות המזרק על-ידי לחיצה על לחצן Initialize (לחצן שחור תחתון) בכל משאבת מזרק.
4. הפעל את ספק הכוח של פוטנציומטר, הגדר אותו ל- V 9 והפעל את תוכנת בקרת האוסצילוסקופ.
5. ודא כי שסתום הרגולטור של N_{2-צילינדר}סגור. פתח את שסתום הגליל. לאחר מכן, לאט לפתוח את שסתום הרגולטור הגדרת לחץ השקע לערך הרצוי עבור לחץ גז ספריי (בדרך כלל 1-2 בר). עבור חרירים PDMS בשימוש כאן, לא להשתמש בלחצים גבוהים יותר ~ 2.5 בר כדי למנוע נזק לזרבובית. הגז הזורם ברציפות מונע מהנוזל לטפטף ולהצטבר בקצה הזרבובית מה שעלול להוביל לרסס בלתי ניתן לערעור.
6. ודא שכל שסתומי משאבת המזרק נמצאים במצב 'עומס'. זה יכול להיעשות על ידי החלפת כל השסתומים למיקום 'לוותר' בתוכנת הבקרה ולאחר מכן בחזרה "עומס". השאר את כל השסתומים עברו ל'עומס '. הגדר את כל המזרקים לאפס.
7. הסר את כל בועות האוויר הקיימות במערכת בשלב זה. כדי לעשות זאת, ייתכן שיהיה צורך לפתוח את המזרקים, להסיר בועות באופן ידני והמזרקים רכובים שוב כאשר אינם מכילים בועות נוספות.
8. רכיבי הטיפול בנוזל מאוחסנים בדרך כלל ב- H₂O. לפני טעינת הפתרון לדוגמה, יש לתעד את המערכת הנוזלית עם חוצץ על ידי שטיפת הצינורות עם עודף של חוצץ. השתמש בזרימת נוזלים מקסימלית מתאימה כדי למנוע לחץ יתר על זרבובית הריסוס. קצבי זרימה נוזליים > 10 μL/s עלולים לגרום נזק לזרירי PDMS המתוארים כאן.
9. מניחים צינור 1.5 מ"ל המכיל ≥ 200 μL חוצץ על מזרק 1 (החלק העליון חייב להיות פירסינג כדי לצרף צינורות).
   1. ודא שסתום 1 הוא במצב 'עומס'. החלף את תוכנת הבקרה, במידת הצורך.
   2. שאף את הכמות הרצויה (בדרך כלל 50-100 μL) של חוצץ עם מזרק 1, באמצעות תוכנת הבקרה.
   3. החלף שסתום 1 למיקום 'לוותר', באמצעות תוכנת הבקרה.
   4. מחלק את כל הנוזל במזרק 1, באמצעות תוכנת הבקרה.
   5. חזור שסתום כדי 'עומס', לאפס את מיקום המזרק ל '0' בתוכנית ולחץ על אתחול על מזרק 1, כדי להכין את המערכת למחזור הבא.
      הערה: שלבים 1.9.1 - 1.9.5 חוזרים בדרך כלל שלוש פעמים כדי להבטיח כביסה יסודית של הצינורות.
10. טען פינצטה עם רשת EM (אין דרישה לכל סוג מסוים) על ידי שחרור היד צוללת מהדק, הצבת פינצטה מהדק והידוק המהדק.
11. הזז ידנית את זרוע הצלילה כך שהרשת והזרבובית נמצאות באותו גובה (מיקום 'היישום לדוגמה'). אם זרבובית ורשת מיושרים, נוזל יצטבר על הרשת לאחר ריסוס לתקופה ממושכת. במידת הצורך, התאם את מיקום הזרבובית.
12. התאימו את מיקום האתאן הנוזלית על ידי הזזה ידנית של הזרוע הצוללת עם פינצטה רכובה למיקום הסופי שלה (הגעה לכוס האתאן). כאשר מוגדר כראוי, רשת המוחזקת על ידי פינצטה תגיע בערך למרכז האתאן הנוזלי.
13. ודא ש- 'run Script' ישתמש בתקצבי הזרימה, באמצעי האחסון ובתזמונים הרצויים. עיין בסעיף 'רצף הריצה' לעיל לקבלת פרטים.
14. ודא ששום דבר לא חוסם את נתיב הבוכנה. שאף את נפח המאגר הנדרש לריצה בודדת למזרק 1. פעולה זו מתבצעת בתוכנת הבקרה, ראה סעיף 'רצף הריצה' עבור הגדרה ואמצעי אחסון טיפוסיים. לאחר מכן ודא שסתום 1 הוא עבר למצב 'לוותר'. בצע בדיקה מופעלת על-ידי הקשה על הפעל Script בתוכנת הבקרה.
    אזהרה: התרחקו מה-TED עד לסיום רצף הריצה. העברת חלקים עלולה לגרום לפציעה!
15. כאשר 'רצף הריצה' מסתיים, הגדר את הלחץ על הזרוע הצוללת לערך הרצוי (בדרך כלל 1-2 פס). רק לאחר מכן לחץ על אישור בתוכנת הבקרה כדי לשחרר לחץ מזרוע הצלילה. אם יש להתאים את 'רצף הריצה' או הלחץ על הזרוע הצלילה, הגדרות אלה עשויות להשתנות בשלב זה ושלבים 1.13 - 1.15 חוזרים על עצמם.

2. הכנת רשת מהירה

1. מלאו תחילה את מיכל האתאן/חנקן הנוזלי בחנקן נוזלי. כאשר קר מספיק ללא חנקן נוזלי, למלא את הכוס עם אתאן נוזלי. הימנע התגבשות של האתאן הנוזלי. שלב זה זהה להכנה קונבנציונלית של הרשת.
   הערה: כדי למזער את זיהום האתאן, ודא כי שלבים 2.2 - 2.13 מבוצעים מהר ככל האפשר
   זהירות: אתאן נוזלי הוא קריוגן ודליק. יש להסתפיד בעת הטיפול.
2. הכן רשתות קריו-EM לפריקה זוהרת. אנחנו בדרך כלל משתמשים ברשתות פחמן חוריות ופריקה זוהרת עבור 90 s, בלחץ אוויר 0.1 mbar ו 10 mA. בדרך כלל, לא יותר מ 4 רשתות הם זוהר משוחררים בכל פעם. הרשתות משמשות בתוך 30 דקות של פריקת זוהר.
3. ישילב את הצינורות עם מדגם (בעקבות שלבים 1.9.1 - 1.9.5, באמצעות מדגם במקום חוצץ). אם נפח המדגם הזמין נמוך, ייתכן שהאובבים ישוללו עם נפח מת אחד בלבד.
4. שאף את כמות המדגם הדרושה לריצה בודדת למזרק 1 בתוכנת הבקרה (ראה סעיף 'רצף הריצה' לקבלת פרטים). לאחר מכן לעבור שסתום 1 למצב 'לוותר'.
5. בדוק שהלחות היחסית הגיעה לערך הרצוי (בדרך כלל אנו מכינים רשתות ב- 60% לחות יחסית ומעלה). לאחר ≥ 60% לחות הוא הגיע, לפתוח את תא הלחות רק למשך פרק זמן מינימלי, כדי לשמור על לחות גבוהה.
6. מניחים את פינצטה, מחזיקים רשת זוהרת, בפוכנה פנאומטית ולתקן אותם. הזז את הבוכנה למיקום ההתחלה שלו (בחלק העליון).
7. ודא שהמחוון של הפוטנציומטר נמצא במצב ההתחלה, מוכן למדידה, על-ידי הזזתו ידנית ליצירת קשר עם הבוכנה. הגדר את הגורם המפעיל על האוסצילוסקופ בתוכנת האוסצילוסקופ.
8. מניחים את מיכל האתאן/חנקן הנוזלי.
9. הקש הפעל Script בתוכנת הבקרה. כאשר תתבקש, לחץ על אישור בתוכנת הבקרה כדי להתחיל את ההפעלה.
   אזהרה: התרחקו מה-TED עד לסיום רצף הריצה. העברת חלקים עלולה לגרום לפציעה!
10. לאחר השלמת 'רצף הריצה', שחרר את הלחץ על הבוכנה הפנאומטית על-ידי לחיצה על אישור בתוכנת הבקרה.
11. תא לחות פתוח, לשחרר את הקשר בין זרוע צוללת פינצטה ביד אחת תוך הבטחת פינצטה עם השני. כאשר פינצטה חופשית, להזיז את זרוע הצלילה למעלה תוך שמירה על הרשת באתאן הנוזלי. לאחר מכן העבר את הרשת לשטח האחסון שלה בנוזל N₂שמסביב . לאחר הקפאה, הרשת צריכה להישמר בטמפרטורת N₂ נוזלית בכל עת.
12. שמור את מדידת האוסצילוסקופ. אפס באופן ידני את המיקום של מחוון פוטנציומטר ואת הבוכנה לאחר מכן.
13. חזור על שלבים 2.4-2.12 כדי להכין רשתות שכפול
14. העבר את הרשתות לאחסון לטווח ארוך עד לחיתוך רשת ואיסוף נתונים.
15. לשטוף את המערכת עם חוצץ, על פי שלבים 1.9.1 - 1.9.5. ואז לשטוף את המערכת עם H₂O, על פי שלבים 1.9.1 - 1.9.5.
16. כבה את וסת הגז הראשי של החנקן וכבה את החשמל.
17. מניחים את מיכל האתאן/חנקן במכסה המנוע כדי לתת לו להתחמם ולתת לאתאן הנוזלי ול-N₂ להתאדות.

3. קריו-EM שנפתר בזמן

הערה: כאשר ניסויים שנפתרו בזמן נערכים עם TED, יש לקחת בחשבון היבטים נוספים, אם כי ההתקנה הבסיסית והמשתנים נשארים זהים. ההנחה כאן היא כי שני פתרונות מעורבים ביחס 1:1 (v / v) כדי לייצר את התערובת הסופית אשר מופקד על הרשת. 'פעל לפי הפרוטוקול המתואר ב-1. הכנת רשת מהירה עם TED', עם השינויים הבאים:

1. השתמש בריכוזים גבוהים יותר במלאי לערבוב ניסויים מאשר לניסויי ספריי פשוטים. ערבוב ביחס של 1:1 (v/v) יביא לדילול של פי 2 של כל רכיב.
2. לניסוי ערבוב מהיר, השתמש בכל שלושת המזרקים ולא רק באחד.
   1. חבר צינורות למשאבות מזרק 2-3.
   2. יש לחבר צינורות ממשאבות מזרק 2-3 לזרבובית הריסוס.
   3. ישילב את כל שלושת המזרקים במאגר ודגימה בנפרד. בדרך כלל, מזרק 1 מלא בדגימה A ומזרקים 2-3 מלאים בדגימה B(איור 3).
3. שנה את רצף הריצה. דוגמה לרצף ריצה באמצעות כל שלושת המזרקים לניסוי ערבוב מהיר ניתנת באיור 6. עיין גם בסעיף 'רצף הריצה' לקבלת פרטים.
4. עיכובים שונים בזמן ניתן להשיג בשתי דרכים:
   1. לשנות את מהירות הבוכנה. על ידי התאמת מהירות הבוכנה, ניתן לשנות את השהיית הזמן בטווח צר יחסית. לדוגמה, עם מרחק ריסוס / אתאן של 2 ס"מ, הבוכנה ניתן להזיז ב 1 מ '/s או 2 מ '/s לתת עיכוב זמן של 20 ms או 10 ms, בהתאמה. זה נעשה כמתואר בשלב 1.15.
   2. שנה את מיקום הריסוס/אתאן על-ידי התאמת המיקום (האנכי) של זרבובית הריסוס. אם הזרבובית ממוקמת במרחק של 5 ס"מ מפני השטח של האתאן, למשל, מהירות צלילה של 1 מ'/ש' נותנת עיכוב זמן של 50 אלפיות שניה. השגת עיכובים ארוכים יותר באופן משמעותי בזמן דורשת שינויים נוספים בהתקנה.
      הערה: בשל זרימת למינאר באזור מיקוד הזרימה של הזרבובית, איננו מצפים לערבוב משמעותי בחלק זה של הזרבובית. במקום זאת, אנו צופים כי ערבוב מתרחש במהלך יצירת ספריי, בטיפות בדרך לרשת ובמהלך התפשטות טיפה על הרשת. זמן הטיסה עבור טיפות ספריי להגיע לרשת מוערך ≤ 1 אלפיות שני (למהירות טיפה של ≥ 10 מ '/s ומרחק רשת זרבובית של 1 ס"מ). לכן, רק הזמן בין נחיתת טיפה וvitrification נחשב "עיכוב זמן".

תוצאות

הכנת רשת מהירה עם TED
כדגימה בדיקה להכנת רשת מהירה, השתמשנו אפופריצין מטחול סוסים ב 20 מיקרומטר ב 30 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.5. שחזור ברזולוציה של 3.5 Å התקבל מ 690 מיקרוגרפים כמתואר ב ref.¹⁵ (איור 7A). טווח הפירוק נבחר כך שניתן לזהות חלקיקים בקלות בתמונות הגולמיות

Discussion

הפרוטוקולים בעבודה זו יכולים לשמש להכנת רשת מהירה על ידי ריסוס ישיר וניסויים TrEM. הכנת רשת מהירה יכולה לשמש כדי להפחית אינטראקציות חלקיקים עם ממשק מי האוויר⁵. המגבלות העיקריות הן ריכוז המדגם הזמין ועובי הקרח ברשת. בתוך גבולות אלה ובתנאי שאיכות המדגם טובה, הפרוטוקול מייצר רשתות...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Time resolved device
acrylic glass box	USA scientific
digital humidity/temperature controller	THE20 digital humidity/temperature controller
dual rod pneumatic cylinder	dual rod pneumatic cylinder TN 10x70
FEP tubing	Upchurch Scientific 1/16” O.D., 0.01'' I.D. FEP tubing
flangeless fittings	Upchurch Scientific ETFE/ETFE flangeless fittings
flexible reinforced PVC tubing	12 mm OD. flexible reinforced PVC tubing
glass syringes	Kloehn 250 µL zero-dead volume
humidifier pump	Interpret Aqua Air AP3
liquid ethane container	from Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV
multistage regulator	GASARC class 3 multistage regulator
negative pressure tweezers	Dumont N5 Inox B negative pressure tweezers
oscilloscope	Hantek 6022BE oscilloscope
PE tubing	Scientific Commodities Inc. 0.043” O.D., 0.015” I.D. PE tubing
power supply	Mean Well GSM160A24-R7B
power supply	Wanptek KPS305D power supply
PU tubing	SMC TU0425 4 mm O.D., 2.5 mm I.D. PU tubing
regulator	Norgren R72G-2GK-RMN
slide potentiometer	PS100 slide potentiometer
solenoid valve	SMC NVJ314M solenoid valve
syringe drive pumps	Kloehn V6 48K model
Reagents & Materials
apoferritin from equine spleen	Sigma-Aldrich, A3660
ATP	Sigma-Aldrich, A2383
cryo-EM grids	Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3
EGTA	Sigma Aldrich E3889
F-actin	Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 1)
glow-discharger	Cressington 208 carbon coater with a glow-discharge unit
HEPES	Sigma-Aldrich, H7006
KAc	Sigma-Aldrich, P1190
MgCl2	Sigma-Aldrich, M8266
MOPS	Sigma-Aldrich, M1254
NaCl	Sigma-Aldrich, S9888
Skeletal muscle myosin S1	Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 2)
Ref 1	Spudich, J. A. & Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of biological chemistry 246, 4866-4871 (1971).
Ref 2	White, H. & Taylor, E. Energetics and mechanism of actomyosin adenosine triphosphatase. Biochemistry 15, 5818-5826 (1976).