JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מציגים שני פרוטוקולים המאפשרים מידול של אינטראקציות ספציפיות למעיים. מונו-שכבתי מעיים שמקורם באורגנוידים ותרבויות ממשק נוזלי אוויר (ALI) מאפשרות ליצור אפיתליה מובחנת היטב הנגישה הן מצדי הזוהר והן מצד בזולטר, בעוד שאורגנואידים מעיים הפוכים בקוטביות חושפים את הצד האפי שלהם והם נוחים לתפוקה גבוהה.

Abstract

רירית האפיתל במעיים מורכבת משכבה פשוטה של תאי אפיתל מיוחדים החושפים את הצד האפיקלי שלהם ללומן ומגיבים לרמזים חיצוניים. אופטימיזציה אחרונה של תנאי תרבות במבחנה מאפשרת יצירה מחדש של נישה של תאי גזע המעי ופיתוח של מערכות תרבות תלת ממדיות מתקדמות (3D) כי recapitulate הרכב התא ואת הארגון של האפיתל. אורגנוידים מעיים המוטמעים במטריצה חוץ-תאית (ECM) יכולים להישמר לטווח ארוך ולארגן את עצמם כדי ליצור אפיתל מקוטב ומוגדר היטב המקיף לומן פנימי וצד בזאלי חיצוני חשוף. אופי מגביל זה של האורגנוידים במעיים מציב אתגרים בגישה למשטח האפילי של האפיתל במבחנה ומגביל את החקירה של מנגנונים ביולוגיים כגון ספיגת חומרים מזינים ואינטראקציות בין מארח מיקרוביוטה לפתוגן. כאן, אנו מתארים שתי שיטות המאפשרות גישה לצד האפילי של האפיתל האורגנויד ותומכות בהבחנה של סוגי תאי מעיים ספציפיים. ראשית, אנו מראים כיצד הסרת ECM מעוררת היפוך של קוטביות תאי האפיתל ומאפשרת את הדור של organoids 3D apical-out. שנית, אנו מתארים כיצד ליצור monolayers דו ממדי (2D) מן השעיות תא יחיד נגזר organoids מעיים, המורכב מסוגי תאים בוגרים ומובחנים. טכניקות אלה מספקות כלים חדשניים לחקר אינטראקציות ספציפיות לאפיתל עם רמזים חיצוניים במבחנה ולקדם את השימוש באורגנוידים כפלטפורמה להקלה על רפואה מדויקת.

Introduction

אפיתל המעי הוא האפיתל השני בגודלו בגוף האדם והוא מורכב משכבת תאים מקוטבת המאפשרת ספיגת חומרים מזינים ופועלת כמחסום נגד עלבונות סביבתיים1. הבחנה זו בין הצדדים האפיים והבסולטריים מאפשרת לתאי האפיתל לבצע את תפקידיהם המגוונים. התא האפיאלי חשוף ללומן ומתווך את האינטראקציות האפיתליות עם גירויים סביבתיים ומיקרואורגניזמים, תוך שהוא גם מקל על ספיגת החומרים המזינים. פני השטח הבסולטריים מכילים צמתים בין-תאיים והידבקויות במטריצת תאים, תוך כדי שדול לתאי מערכת החיסון ורקמות אחרות2. צמתים אלה מייצרים monolayer בלתי חדיר מחובר קרום המרתף, אשר פועל כמחסום ומספק את החומרים המזינים נספגים לרקמת הגוף שמסביב.

הקמת מערכות תרבות המסוגלות לשחזר את תפקודי המעיים הללו במבחנה הייתה מאתגרת3. מודלים במבחנה קונבנציונליים משתמשים בקווי תאים של סרטן המעי הגס האנושי שעברו טרנספורמציה, כגון קאקו-2, כדי ליצור תרביות מונו-שכבתיות דו-ממדיות. למרות היכולת לדגמן פונקציות מרובות של תא הספיגה, מודלים אלה אינם יכולים לשחזר באופן מלא את הרכב האפיתל והתפקוד במעיים, המגבילים מאפיינים פונקציונליים מרכזיים ויישומים4,5.

הופעתם של organoids כמערכת תרבית תלת-ממדית מתקדמת שנוצרה מתאי גזע שיכולים לארגן ולהבדיל את עצמם לסוגי תאים ספציפיים לאיברים, הייתה פריצת דרך במחקר במבחנה של אפיתל המעי6. אורגנוידים במעיים מוטבעים במטריצה חוץ-תאית (ECM) הדומה ללאמינה בזאלית ויוצרים צמתים של מטריצת תאים המאפשרים לתרבויות אלה לשמור על הקוטביות האפיקובסלת של האפיתל. Organoids מציגים ארכיטקטורה סגורה שבה הצד האפימי חשוף לתא הזוהר, ובכך מחקה את מבנה המעי. למרות שארגון סגור זה מציע את ההזדמנות ללמוד פונקציות ספציפיות להתמצאות, הוא מגביל חקירות הדורשות גישה לצד האפיזי של האפיתל. גישות שונות נלקחו כדי להתגבר על מגבלות אלה הן 2D ו 3D, כולל פיצול organoid, microinjection organoid, ודור של תרבויות monolayer7. פיצול אורגנויד גורם לאובדן הארגון המבני ולהרס צמתים סלולריים, המאפשרים את חשיפת המשטח האפיקלי של האפיתל למדיום. טכניקה זו מנצלת את היכולת ההתחדשותית של השברים כדי לתקן organoids כאשר זרע לתוך מטריצה חוץ תאית שימש מודל מחלות זיהומיות ואינטראקציותמארח-פתוגן 8,9. עם זאת, הגישה בו זמנית הן למשטח האפאלי והן למשטח הבזלי עשויה גם לעורר תגובות לא ספציפיות לזיהום.

גישה חלופית המאפשרת גישה למשטח האפילי ושומרת הן על הארכיטקטורה המבנית והן על צמתים סלולריים מיוצגת על ידי מיקרו-ינון של גורמים ללומן של אורגנוידים. שיטה זו נוצלה בהרחבה כדי לחקור אינטראקציות מארח-פתוגן ולדגם את ההשפעות של Cryptosporidium10, H. pylori11, ו C. difficile12 על אפיתל מערכת העיכול במבחנה. באמצעות טכניקות דומות, הפוטנציאל mutagenic של pks+ זן של E. coli על אפיתל מעיים נקבע13. למרות יעיל, microinjection organoid היא משימה מייגע ולא יעיל בהתחשב במספר הגבוה של organoids כי יש צורך להזריק כדי לקבל אפקטים מדידים ולכן מגביל את היישום שלה עבור בדיקות תפוקה גבוהה.

ההתקדמות האחרונה עם organoids מעיים סיפקו גם שיטות להקמת תרבויות organoid 2D monolayer, ובכך לחשוף את פני השטח apical שלהם14,15,16,17. אלה מונו-שכבתיות שמקורן באורגנוידים לשחזר מפתח בתכונות vivo של אפיתל המעי. הם מציגים הרכב תאים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, המכיל אוכלוסיות מובחנות ותאי גזע ומדגם את המגוון על פני ציר הקריפטה-villus. ככל שהקוטביות האפיקובסלת נשמרת, תכונות המונו-שכבתיות הטבועות מאפשרות גישה קלה הן לצדים האפיים והן לצדים הבסקיים וחילופי מדיה יכולים לחקות זרימת מעיים ופינוי פסולת המאפשרים תרבות ארוכת טווח. תכונות אלה הופכות את המונו-שכבתיות שמקורן באורגנוידים למקובלות למחקרים המתמקדים באינטראקציות זוהרות ומספקות מודל מעולה לשלמות מחסום אפיתל וחמלות18,19.

מחקרים הראו כי קוטביות תאי אפיתל מווסתת בחוזקה על ידי חלבוני ECM ב SDCK כדורי20,21 ולאחרונה באורגנוידים במעיים אנושיים22. הסרת רכיבי ECM או עיכוב של הקולטן integrin המתווך צמתים מטריצת התא גורמת היפוך קוטביות של organoids מעיים ואת החשיפה של הצד האפילי של האפיתל למדיום22. גישה זו משכה את העניין של חוקרים העובדים על מחלות זיהומיות שכן היא מאפשרת גישה קלה לצד האפירי בתלת-ממד והופכת אותו למקובל על תפוקה גבוהה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול שונה המבוסס על העבודה האחרונה על ידי מעבדת Amieva22, המאפשר את הדור של organoids מעיים 3D לחשוף בקלות את הצד האפילי שלהם. אנו גם מתארים פרוטוקול שיכול ליצור ביעילות ובשחזור מונו-שכבתיים דו-שכבתיים במעיים הנגזרים מאורגנואידים במעיים.

Protocol

נגזרת של תרביות אורגנויד מעיים אנושיות בוצעה כמתואר במקום אחר23. Organoids נשמרו בתרבות כפי שתואר על ידי גיליון מידע המוצר (PIS) עבור מדיום הרחבת אורגנויד מעיים (עיין בטבלת החומרים).

1. היפוך של קוטביות אורגנויד מעיים

הערה: סעיף זה יתווה את הפרוטוקול להיפוך הקוטביות של אורגנוידים מעיים תלת-ממדיים. פרוטוקול זה מספק הליך מפורט להקמת organoids מקוטב עם משטח apical חשוף בהשעיה בצלחת תרבות. פרוטוקול זה נועד כניסיון נקודת קצה, אם כי האורגנוידים יכולים להישמר בקונפורמציה זו במשך למעלה משבועיים ולשמור על אוכלוסיית תאי גזע קטנה המאפשרת להם להקים מחדש organoids apical-in עם המעבר.

  1. ציפוי כלי תרבות וצינורות עם פתרון אנטי דבק
    הערה: כדי למקסם את מספר organoids מעיים apical-out ולמנוע התקשרות בלתי רצויה לכלי התרבות, precoating של כלי תרבות נדרש בדרך כלל. הסעיף המתואר להלן מתאר את ציפוי התרבות וכלי הפלסטיק עם פתרון אנטי דבק.
    1. צלחות תרבות מעיל לשימוש בחלק ההשעיה של הפרוטוקול כדלקמן.
      1. הוסף 0.5 מ"ל של פתרון אנטי דבק לכל באר של צלחת תרבית רקמות 24-well.
      2. מערבבים את הצלחת כדי להפיץ את הפתרון באופן שווה על פני השטח ואת קירות בארות.
      3. צנטריפוגה את הצלחת ב 1,300 x g במשך 10 דקות.
      4. הסר פתרון אנטי דבק מכל באר באמצעות שאיפה או פיפטה 1 מ"ל.
      5. לשטוף את בארות עם 1 מ"ל של DMEM / F-12 עם 15mM HEPES (DMEM / F12).
      6. מלא כל שטף היטב עם 0.5 מ"ל של DMEM / F-12 ולאחסן את הצלחת ב 37 °C (5% CO2 עד השימוש.
        הערה: אם לא נעשה שימוש מיידי, ניתן לשמור את הצלחות המצוות באינקובטור למשך שבוע לפחות.
    2. מעיל 15 mL צינורות חרוט המשמשים בפרוטוקול זה כדלקמן.
      1. הוסף 4 מ"ל של פתרון אנטי דבק לצינור חרוט 15 מ"ל.
      2. מערבבים את הצינור כדי להפיץ את הפתרון באופן שווה על פני השטח של הקירות.
      3. צנטריפוגה הצינור ב 1,300 x g במשך 10 דקות.
      4. הסר את הפתרון האנטי דבק מהצינור.
      5. לשטוף את הצינור 1x עם 5 מ"ל של DMEM / F-12 ולשאף DMEM / F-12. הצינורות מוכנים כעת לשימוש.
        הערה: אם לא נעשה שימוש מיידי, להוסיף 5 מ"ל של DMEM / F12 ולאחסן ב 4 °C (70 °F). צינורות מצופים ניתן לשמור על 4 °C (55 °F) לפחות שבוע.
  2. היפוך קוטביות של organoids מעיים על ידי תרבות השעיה
    הערה: השלבים שלהלן מתארים את ההיפוך של organoids מעיים בעבר תרובו תחת תנאי כיפת ECM סטנדרטיים. ההליכים המתוארים כאן הם עבור באר אחת של צלחת 24-well. אם אתה משתמש בכלי תרבות אחרים, התאם את עוצמת הקול בהתאם.
    1. הסר בזהירות והשלך את המדיום מכל באר המכילה organoids מבלי לשבש את כיפת מטריצה חוץ תאית קרום המרתף. ודא כי גודל האורגנוידים הוא בקוטר 150-250 מיקרומטר (בדרך כלל ביום 3-5) לפני תחילת פרוטוקול ההיפוך.
    2. הוסיפו 1 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה קרה כקרח בכל באר.
    3. דגירה בטמפרטורת החדר (15-25 מעלות צלזיוס) למשך דקה אחת.
    4. הוסף לפחות 2 מ"ל של פתרון אנטי דבק לצינור 15 מ"ל שישמש לציפוי טיפים מפלסטיק.
    5. הוסף לפחות 2 מ"ל של DMEM / F-12 לצינור 15 מ"ל שישמש לשטיפת טיפים מפלסטיק שטופים בתמיסה אנטי דבקה.
    6. יש לכסות קצה פיפטה של 1 מ"ל עם פתרון אנטי-דבק, תוך צנרת של 1 מ"ל של פתרון שלוש פעמים לתוך הצינור עם פתרון אנטי דבקות מהשלב 1.2.4.
    7. לשטוף את הקצה DMEM קר / F-12, צינור 1 מ"ל של פתרון שלוש פעמים לתוך הצינור עם DMEM / F-12 מהשלב 1.2.5.
    8. בעזרת הקצה המצוי, יש לפנות בזהירות את הכיפות על ידי צנרת איטית. יש להקפיד לא לשבש או לפצל את האורגנוידים.
    9. מעבירים את ההשעיה האורגנוידית לצלחת שטופלה בתמיסה אנטי-דבקה (החל מהשלב 1.1.1).
    10. מניחים את הצלחת על שייקר ב 4 °C (55 °F) במשך 30 דקות. ניתן להשתמש בשייקר ג'ירו ב-70 סל"ד.
      הערה: הימנע רועד קשה, כגון מערבולת המדגם, כפי שהוא יכול לגרום פיצול organoid. היווצרות של בועות קצף יכול להצביע על רעידות קשות.
    11. לאחר 30 דקות, להסיר את הצלחת. בעזרת קצה פיפטה של 1 מ"ל מצופה בתמיסה אנטי-דבקה, מעבירים בעדינות את הפתרון למעלה ולמטה.
    12. מניחים את הצלחת על שייקר ב 4 °C (5 °F) במשך 15 דקות. ניתן להשתמש בשייקר ג'ירו ב-70 סל"ד.
    13. מוציאים את הצלחת ומניחים לאורגנואידים להתיישב בכוח המשיכה (1-2 דקות בטמפרטורת החדר). שים לב ללוח מתחת למיקרוסקופ כדי לאמת משקעים אורגנויד.
      הערה: הימנע תסיסה נרחבת של הצלחת כפי שהוא יכול לגרום organoids מיושב resuspend.
    14. לאחר organoids להתיישב, להסיר כמה שיותר של פתרון דיסוציאציה ככל האפשר לשטוף על ידי הוספת 1.5 מ"ל של DMEM / F-12.
    15. אפשר לאורגנוידים משקעים ולהסיר כמה שיותר מהסופר-טבעיים ככל האפשר. חזור על שלב הכביסה פעם נוספת.
      הערה: שים לב ללוח שמתחת למיקרוסקופ כדי לאמת משקעים אורגנויד לפני ביצוע כל שלב כביסה.
    16. הסר כמה שיותר DMEM / F-12 ככל האפשר ולהוסיף 0.5 מ"ל של מדיום הרחבת אורגנויד מעיים. דגירה ב 37 °C (5°F) ו 5% CO2.
    17. למחרת, בצע שינוי בינוני חלקי על ידי הטיית הצלחת בזווית של 25 עד 30 מעלות, והסרת בינוני לאורך קיר הבאר. הסר 0.4 מ"ל של בינוני דואג לא להסיר organoids מושעה.
    18. יש להוסיף מדיום להרחבת אורגנויד מעיים 0.4 מ"ל. דגירה ב 37 °C (5°F) ו 5% CO2 במשך 3 ימים.
      הערה: לאחר 3 ימים, רוב organoids צריך להיות קוטביות apical-out, אבל אגרגטים גדולים עשויים להיווצר.
    19. אם נוצרו אגרגטים, השתמש בפיפטה של 1 מ"ל עם קצה מצופה בתמיסה אנטי-דבקה (כמתואר בשלבים 1.2.6 ו- 1.2.7) כדי להטות את האגרגטים על ידי צנרת למעלה ולמטה 20 פעמים תוך לחיצה על קצה הקצה לתחתית הצלחת.
    20. מניחים את הצלחת על 37 °C (5% CO2 ולבצע שינוי בינוני מלא למחרת עם מדיום הרחבת אורגנויד מעיים (כמתואר בסעיף 1.2.17).
    21. לאחר יומיים (יום 5 בהשעיה), אורגנוידים במעיים apical-out ניתן להשתמש בבדיונים במורד הזרם.

2. הקמת תאי מעיים 2D monolayer וממשק נוזלי אוויר (ALI) תרביות נגזר אורגנוידים מעיים 3D

הערה: סעיף זה יתווה את הפרוטוקול ליצירת תרביות מונו-שכבתיות דו-שכבתיות מאורגנואידים במעיים. טכניקה זו מספקת את היתרון של הקמת תרבות מונו-שכבתית מקוטבת ומקוטבת עם משטח אפי חשוף בלוח תרבית רקמות המכילה קרום התא. למרות monolayer יתחיל להבדיל בפורמט שקוע, monolayer, הבחנה נוספת של monolayer ניתן להשיג על ידי מעבר לתרבות ALI לאחר שהגיע למפגש. הן ה- monolayer והן פרוטוקולי ALI הבאים נועדו כבוחות נקודת קצה ולמרות שתרבות המונו-שכבתית שומרת על אוכלוסיית תאי גזע קטנה, לא ניתן לפצל ולהעביר אותה ביעילות לאחר הקמתה.

  1. הכנת מדיה וצלחות לתרבות חד-שכבתית במעיים
    1. הכן מדיום בידול אורגנויד מעייםכפי שמתואר על ידי היצרן לתרבות monolayer (ראה רשימת חומרים ). הוסף Y-27632 רק לנפח של מדיום שישמש בתוך שבוע אחד בריכוז סופי של 10 מיקרומטר. אם לא נעשה שימוש מיידי, יש לאחסן ב-4 °C (70 °F).
    2. טריפסין EDTA לפני חם (0.05%) עד 37 °C (50 °F).
    3. לפחות 2 שעות לפני זריעת תרבויות מונו-שכבתיות, הכינו פתרון ציפוי ECM 2% כדלקמן.
      1. הפשירו ECM על הקרח והוסיפו 1:50 ל-PBS קר וסטרילי כדי להכין פתרון של 2%. הכן כמויות מספיקות כדי להוסיף 100 μL לבאר העליונה של כל 6.5 מ"מ (0.33 ס"מ2) קרום התא להוסיף לשימוש. כוונן את עוצמת הקול בהתאם לתרבויות גדולות או קטנות יותר.
    4. מוסיפים 100 μL לכל באר ודגרה כל צלחת ב 37 °C ו 5% CO2 עד הצורך (לפחות 2 שעות לפני זריעה).
  2. פירוק אורגנוידים במעיים לדור ולתרבות של מונו-שכבתיות
    1. הסר מספר מתאים של בארות תרבות organoid מן האינקובטור. עיין בטבלה 1 לקבלת המספר המומלץ של בארות לקצור עבור כלי תרבות שונים.
    2. שאפו את כל המדיום מתרבויות האורגנויד מבלי להפריע לכיפת ECM.
    3. הוסף 1 מ"ל של פתרון דיסוציאציה לכל באר.
    4. דגירה בטמפרטורת החדר (15-25 מעלות צלזיוס) למשך דקה אחת לפחות.
    5. באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, פיפטה נמרצת למעלה ולמטה כדי לשבש את הכיפה ולשחרר את האורגנוידים.
    6. יש לאסוף את האורגנוידים התלויים מכל באר בצינור חרוט של 15 מ"ל. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות עם עצבנות עדינה או נדנדה. Organoids עבור זריעת בארות מרובות ניתן לאגד בשלב זה, עד 10 מ"ל נפח בכל צינור.
    7. צנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F).
    8. הסר והשלך את supernatant. יש להוסיף 5 מ"ל DMEM/F-12 קר כקרח לאורגנואידים.
    9. מערבבים וצנטריפוגה שוב ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F).
    10. לשאוף supernatant, הסרת ככל האפשר, נזהר לא להפריע לכדור.
      הערה: חלק מה- ECM שיורית עשוי להישאר בכדור; עם זאת, זה לא אמור להשפיע באופן משמעותי על ניתוק האורגנוידים.
    11. הוסף 1 מ"ל של טריפסין-EDTA מחומם מראש (37 °C) (0.05%) כדי resuspend organoids. יש לערבב היטב כדי להבטיח השעיה אחידה. הוסף עד 1 מ"ל נוספים של טריפסין-EDTA עבור מספר רב של תאים, או אם כמות משמעותית של ECM נשאר.
    12. דגירה ב 37 °C (5-10 דקות).
    13. מערבבים היטב עם פיפטה של 1 מ"ל כדי לשבש את האורגנוידים ככל האפשר. אורגנואידים צריכים להיות מנותקים לחלוטין לתאים בודדים או שברים קטנים. אם שברים גדולים יותר או organoids שלם להישאר לאחר pipetting ביסודיות, להמשיך את הדגירה עם טריפסין-EDTA ב 37 °C (5 דקות נוספות).
      הערה: אין לדגור עם טריפסין-EDTA במשך יותר מ -20 דקות, שכן הדבר עלול לגרום לאובדן מוגבר של הכדאיות התאית.
    14. לאחר organoids הם מנותקים מספיק, להוסיף נפח שווה של DMEM / F-12 (למשל, 1 מ"ל DMEM / F-12 לכל mL טריפסין-EDTA) ו pipette למעלה ולמטה לערבב ביסודיות. לאפעיל טריפסין-EDTA על-ידי הוספת 10% FBS ל- DMEM/F-12 בשלב זה.
    15. שברי צנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות ב 2-8 °C (7 °F).
    16. אם organoids מנותק להיכשל גלולה, זה נפוץ יכול להיות בגלל הצטברות של ריר שוחרר על ידי התאים מנותקים. במקרה זה, לערבב את התאים ביסודיות על ידי צנרת למעלה ולמטה צנטריפוגה אותם שוב ב 200 x g במשך 5 דקות ב 2-8 °C (8 °F).
    17. הסר בזהירות כמה שיותר supernatant ככל האפשר, משאיר רק את גלולה התא.
    18. Resuspend התאים 100 μL של מדיום בידול אורגנויד מעיים (עם 10 μM Y-27632) עבור כל באר להיות זרע. התאם את עוצמת הקול בהתאם לגדלי באר גדולים או קטנים יותר.
    19. הסר את הצלחות מצופות מן האינקובטור (מוכן בשלב 3.1.4) ולהסיר את עודף ECM מכל באר.
    20. הוסף 100 μL של השעיית התא לבאר העליונה של כל הוספה של תרבית תא.
    21. הוסף 500 μL של מדיום בידול אורגנויד מעיים לבאר התחתונה של כל תוספת תרבית תא.
    22. דגירה ב 37 °C (7 °F) ו 5% CO2.
    23. החלף את המדיום הן בבאר העליונה והן בבאר התחתונה כל 2 עד 3 ימים. תרבויות Monolayer צריך להגיע למפגש בתוך 7 ימים ולעתים קרובות יגיע למפגש בתוך 2-3 ימים.
  3. הקמת תרבות ממשק אוויר נוזלי (ALI)
    הערה: אם תרצה, ניתן לבצע הבחנה נוספת של תרבות מונו-שכבתית מעיים שקועה על ידי מעבר תרבות המונו-שכבתית השקועה לתרבות ALI. שיטת תרבית זו תאפשר עלייה במספר סוגי התאים המובחנים, במיוחד תאים של שושלת הפרשה, כגון תאים בגבל ואנטרונדוקריני.
    1. קבעו תרבות של שכבות תאים בתרבית תאים כמתואר לעיל בשלבים 2.2.1-2.2.23 ושמירה על תרבות זו ב-100% השפעה למשך 4 ימים לפחות.
    2. כדי ליצור תרבות ALI, הסר בינוני מהבאר העליונה והתחתון. הוסף מדיום בידול אורגנויד מעיים טרי (עם Y-27632) לבאר התחתונה, משאיר את הבאר העליונה ריקה.
    3. דגירה ב 37 °C (5°F) ו 5% CO2.
    4. החלף את המדיום בבאר התחתונה כל 2-3 ימים ואפשר למונולייר להבדיל לפחות שבוע אחד.
    5. יש לשטוף את הבאר העליונה עם PBS סטרילי כדי להסיר הצטברות ריר עודפת, במידת הצורך.
      בתנאים אלה, תרבות ALI ניתן לשמור על לפחות 2-3 שבועות.

תוצאות

Organoids נוצרו מדגימות ביופסיה בעקבות הפרוטוקול שתואר בעבר23 וב PIS עבור מדיום הרחבת אורגנויד מעיים (ראה טבלת החומרים). איור 1A, פאנל שמאלי, מציג את הפנוטיפ של האורגנוידים במעיים בתרבית בכיפה עם מדיום הרחבת אורגנויד מעיים. בתנאי תרבות אלה, organoids להציג מורפולוגיה ציסטית המוגדרת על ידי אפיתל דק (10-25 מיקרומטר) המקיף לומן(איור 1A, פאנל ימני). בשלב זה, הצד האפיקלי של האפיתל במעיים פונה ללומן, בעוד הצד הבסקי יוצר קשר עם המטריצה החוץ-תאית שמסביב. כאשר רוב האורגנוידים הגיעו לגודל הרצוי, המטריצה החוץ תאית הוסרה, והאורגנואידים היו אז בתרבית בהשעיה. אובדן הכריכה התאית למטריצה החוץ-תאית מפעיל תהליך היפוך באורגנוידים, וכתוצאה מכך היפוך הקוטביות של האפיתל האורגנויד, חשיפת הצד האפיקלי של האפיתל למדיום הצמיחה והפנמת הצד הבסולטרלי.

בתרבויות מסוימות, organoids במצטבר השעיה ופתיל, אפקט שהוא עמוק יותר במהלך 3 הימים הראשונים(איור 1B,פאנל שמאל). יישום של טכניקת גיזום מאפשר ניתוק של organoids והמשך של התרבויות במשך ימים עם reaggregation מינימלית (איור 1B,פאנל ימני).

אורגנוידים מעיים המתורבתים בכיפות ECM ממשיכים להתרחב(איור 1C,פאנל שמאלי)ומציגים היווצרות ספונטנית של מבנים משניים, הדומים לקריפטה קטנה, בצד הבסולטרי של האפיתל המקיף את הלומן(איור 1C,פאנל ימני). יחד עם זאת, organoids נשמר במשך 5 ימים בהיעדר מטריצה חוץ תאית להמשיך להתפתח השעיה (איור 1D,פאנל שמאל). היפוך הקוטביות מאופיין על ידי עיבוי (30-40 מיקרומטר) של האפיתל המקיף את הליבה של organoids ואת המראה של מגוון של מורפוזיות: מוארך (איור 1D, פאנל ימני איור משלים 1A),סיסטיק ( איורמשלים 1B),ולא סדיר ( איורמשלים 1C). זה משולב לעתים קרובות עם כיווץ של החלל הזוהר בתוך organoid, המשפיעים על גודלם הכולל.

היפוך יעיל יכול גם להיות מאושר על ידי ניתוח הביטוי של סמני קוטביות ספציפיים למעיים. אורגנואידים במעיים Apical-out להראות לוקליזציה ברורה של הגרעינים לכיוון לומן של organoid, כפי שצוין על ידי 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) אות. הביטוי של סמנים אפיים, כגון VILLIN (איור 2A) ו- ZO-1 (איור 2B), מזוהה בצד החיצוני של האפיתל החשופ למדיום. לוקליזציה זו עומדת בניגוד מוחלט לזה שנצפה באורגנוידים במעיים בתרבית ECM. אורגנוידים מוטבעים במטריצה חוץ-תאית המוכתמים בגרעין (DAPI), VILLIN (איור 2C)ו- ZO-1 (איור 2D) מדגימים קוטביות אפיקובסלאית שבה הצד האפיקלי פונה ללומן של האורגנויד.

הסרה מלאה של ECM נדרשת כדי להשיג היפוך קוטביות יעיל של organoids המעי. מדי פעם, חלק של organoids נמצא בתרביות השעיה מוקף שאריות ECM, מראה מורפולוגיה ציסטית המצביעה על כישלון היפוך הקוטביות של האפיתל (איור משלים 2A). ניתוח של כתמים אימונופלואורסצנטיים, המבוצע על organoids אלה, מספק עדות למיקום הבסולטרלי של הגרעינים (DAPI) לאורך האפיתל ואת הביטוי של ZO-1 בצד apical המתמודד עם לומן של organoid (איור משלים 2B) המאשר כי הסרת ECM חלקית גורמת לשמירה על הקוטביות apicobasal באופן דומה organoids מוטבע ECM.

הפרוטוקול להקמת תרבויות מונו-שכבתיות מעיים גורם לתרבות מונולייר משוחחת תוך 7 ימים מהזריעה והתרבות תגיע לעתים קרובות למפגש תוך 2-3 ימים בלבד. אחד הגורמים העיקריים להצלחה הוא מספר ואיכות התאים המשמשים לזריעת המונו-שכבתית. איור 3A, פאנל שמאלי מספק דוגמה לצפיפות זריעה אידיאלית של כ-150,000 תאים בתוסף של קרום תרבית תאים בקומת תא 6.5 מ"מ. מספר זה אינו קבוע והוא יכול להיות משתנה מאוד בהתבסס על התורם ואיכות תרבות האורגנויד המקור; לכן, יש למטב את מספר התא בהתבסס על משתנים אלה. אם צפיפות הזריעה נמוכה מדי, או באיכות ירודה(איור 3A, לוח ימני), ייתכן שלא יהיו מספיק קבצים מצורפים כדי ליצור תרבות של שכבות מונו-שכבתיות.

לאחר הקמת הקוברות(איור 3B),התאים יוצרים צמתים הדוקים ויוצרים מראה מרוצף אבן(איור 3B, לוח שמאלי). אם הם לא יצליחו ליצור מונונייטר(איור 3B, פאנל ימני),המראה של monolayer יהיה לעתים קרובות "מטושטש", עם אזורים של חיבור תאים באיכות טובה, אבל עם פערים גדולים יותר בין אזורים אלה. תרבויות אלה אינן מספקות מחסום תפקודי בין התאים הבזליים והאפיים ואינן מתאימות לבדיקות המתוארות. מונו-קולייר משוחח מכוון את גבול המברשת המכיל VILLIN לכיוון הצד האפיקלי של האפיתל, כאשר הגרעין שלו ממוקם לכיוון הקוטב הבסקי של התא (איור 4B). בין התאים נוצרים צמתים בין-תאיים המורכבים ממתחמי חלבון מרובים, כולל ZO-1 (איור 4B). נוכחותם היא המפתח למתן פונקציית המחסום של תרבות האפיתל.

לאחר המפגש, המעבר לתרבות ALI גורם לבידול נוסף של התרבות(איור 3C). תאי גאבל קטנים ועגולים מופיעים והשחור עצמו מקבל מראה מקופל יותר. למרות שתאי בגביע נמצאים בתוך האפיתל של התרבות השקועה (איור 4A), הם בולטים יותר בעקבות בידול עלי. תאי גופע הנמצאים בתוך ריר הפרשת האפיתל, מה שמוביל למראה מעורפל מעל החלק העליון של האפיתל. ניתן לדמיין את תאי הגביע והריר המופרש על ידי הכתמת חלבון המוצין המופרש, MUC2 (איור 4A, C ו- D) ואת הגידול באוכלוסיית תאי הזבל ניתן למדוד על ידי עלייה בביטוי MUC2 (איור משלים 3A). אין צורך להסיר את שכבת ריר דמוי ג'ל זה והוא ידבק על פני השטח של האפיתל ויישאר בעקבות שטיפות חוזרות ונשנות. אם יש צורך בהסרה, שטיפת התרבות עם תרכובת mucolytic, כגון 10 mM N-אצטיל ציסטאין או 50 מיקרוגרם / mL DTT מסיר ריר עודף. בנוסף לגידול באוכלוסיית תאי הגביע, ממשק ALI גם מגביר את נוכחותם של תאים אנתרואנדוקריניים (כפי שצוין על ידי ביטוי CHGA) (איור משלים 3B) ואנטוציטים בוגרים (כפי שצוין על ידי ביטוי KRT20) (איור משלים 3C).

figure-results-6220
איור 1: שלבים של דור האורגנויד במעיים. (A)תמונות מייצגות של כיפה עם organoids בגודל הרצוי ביום 4 (פאנל שמאלי, סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר). אורגנואידים דקים מוקפים חומה, עם תא זוהר פתוח (פאנל ימני, סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). (B)תמונה מייצגת של באר עם צבירה נרחבת לאחר 3 ימים בהשעיה (פאנל שמאלי, סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר). תמונה של שברי גוש מיד לאחר גימה (פאנל ימני, סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר). (ג)תמונה מייצגת של אורגנוידים במעיים בכיפה ביום 7. Organoids להציג לומן מורחב עם היווצרות של ניצנים קטנים בצד הבסולטרי של האפיתל (הגדלה שמאלית 20x, הגדלה ימין 100x של האזור המסומן, סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר). (D)תמונה מייצגת של organoids מעיים לאחר הסרת ECM ותרבות השעיה לאחר מכן במשך 5 ימים. האורגנוידים משיגים מורפולוגיה צפופה עם אפיתל מעובה וחושפים את הצד האפיקלי שלהם למדיום. (הגדלה של 20x שמאל, הגדלה ימינה פי 100 של האזור המסומן, סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7502
איור 2: כתמים אימונופלואורסצנטיים לסמני קוטביות של התאים באורגנוידים במעיים. אפיל-אאוט(A, B),ו- apical-in (C, D)אורגנוידים מעיים מונחים היו מוכתמים בסמנים אפיים ZO-1 ו- VILLIN, ועם סמן אפיתל E-CADHERIN (אדום). DAPI (כחול) שימש להדמיה גרעינים. חלוניות שמאל מציגות תמונות שצולמו בהגדלה של פי 25 ולוחות ימניים מציגים תמונות של אורגנוידים שונים בהגדלה של פי 63 (רק פאנל C מציג הגדלה של פי 25 ו-63 של אותו אורגנויד). (A)אורגנוידים מעיים אפויליים המוכתמים בווילין (ירוק) ו- E-CADHERIN (אדום) מציינים את החשיפה של הצד האפילי למדיום. (B)אורגנוידים מעיים אפויים המוכתמים ב- ZO-1 (ירוק) ו- E-CADHERIN (אדום) מראים נוכחות של צמתים הדוקים והחזרה של הקוטביות האפיקובסל. (C)אורגנויד מעיים משובץ מטריגל מוכתם בווילין (ירוק) ו- E-CADHERIN (אדום) המציג את הצד האפילי מול לומן האורגנויד. (D)אורגנוידים מעיים משובצים מטריג'ל מוכתמים ב- ZO-1 (ירוק) ו- E-CADHERIN (אדום) המציין את נוכחותם של צמתים הדוקים אפיים הפונים ללומן של האורגנויד. (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). Organoids היו מוכתמים על ידי אימונופלואורסצנטיות ותמונה באמצעות פרוטוקולים שפורסמו בעבר24,25. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-9045
איור 3: הקמת תרביות מונו-שכבתיות מעיים. (A) תמונה מייצגת של אורגנוידים תלת-ממדיים לאחר טיפול עם 0.05% טריפסין-EDTA. Organoids מנותקים לתאים בודדים או גושי תאים קטנים כהכנה לזרוע תרביות monolayer. פאנל שמאלי: דוגמה לצפיפות זריעה אופטימלית לתרבות חד שכבתית, כ-150,000 תאים ל-100 מיקרו-אל על תוספת קרום תאי של 6.5 מ"מ. פאנל ימני: דוגמה של צפיפות זריעה תת-אופטימלית ב-<50,000 תאים לכל 100 מיקרו-אל על תוספת של קרום התא 6.5 מ"מ. (ב)תמונה ברייטפילד מייצגת של תרבות חד-שכבתית שקועה. פאנל שמאלי: 100% שכבה מכנסת עם מראה מרוצף אופייני. פאנל ימני: כ-50% מונולייטר. פערים הנראים בשכבת המונו-שכבתית (המצוינת על ידי קו מקווקו) נסגרים עם הזמן בשל המשך התפשטות תאי גזע המעיים. (ג)תמונה ברייטפילד מייצגת של תרבות עלי מובחנת ב 7 ימים. (סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-10184
איור 4: כתמים אימונופלואורסצנטיים עבור סמני תאים מובחנים בתרבויות מונו-שכבתיות. (A)תמונת ערימת Z של כתמים אימונופלואורסצנטיים של תרבות מונו-שכבתית שקועה עבור חלבון המוצין MUC2, המציין את נוכחותם של תאי גבל בתוך תרבות המונו-שכבתית (ירוק = MUC2, כחול = DAPI). (B)Z-stack תמונה של כתמים אימונופלואורסצנטיים של monolayer שקוע. כתמי VILLIN (ירוק) לאורך הקצה האפיקלי של האפיתל מציינים את נוכחותו של גבול מברשת והכתמת ZO-1 (אדום) מציינת נוכחות של צמתים הדוקים בין תאים (כחול = DAPI). (C)תמונת ערימת Z של כתמים אימונופלואורסצנטיים של תרבות מונו-שכבתית מובחנת עלי עבור חלבון המוצין MUC2, המציין את נוכחותם של מספר גדול משמעותית של תאי גבל בתוך תרבות המונו-שכבתית ALI (ירוק = MUC2, כחול = DAPI). (D)Cryosection של תרבות monolayer מובחנת ALI, מוכתמת בנוכחות MUC2 (ירוק) ו- E-CADHERIN (אדום) המציין את נוכחותם של תאי גביע באפיתל ואת הפרשת הריר לאורך הצד האפי של תרבות המונו-שכבתית. (סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר). תרבויות Monolayer היו מוכתמות על ידי אימונופלואורסצנטיות ותמונה באמצעות פרוטוקולים שפורסמו בעבר26,27. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: ספקטרום של פנוטיפים של אורגנואיד מעיים apical-out בהשעיית תרבית. (A,B,C) תמונות מייצגות נוספות של מורפורולוגיות אורגנויד מעיים נשמרות בהשעיה 5 ימים לאחר הסרת ECM. הקוטביות האורגנוידית התהפך. האורגנוידים הפכו צפופים יותר עם אפיתל מעובה והצד האפי של האורגנוידים פונה כלפי חוץ. Organoids יכול להראות מגוון רחב של מורפורולוגיות: מוארך (A), סיסטיק (B), ולא סדיר (C). (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור 2 משלים: אורנואידים במעיים אינם מצליחים הפוך את הקוטביות בנוכחות מדיום מטריצת קרום מרתף שיורית בתרביות השעיה. (A)תמונה מייצגת של הסרת ECM לא שלמה וכישלון הפוך את הקוטביות של האורגנוידים. שרידי מטריגל נמצאים סביב האורגנוידים ותורמים לשמירה על קוטביות האפיתל המוכוונת לאפיתל. Organoids להראות מורפולוגיה ציסטית עם אפיתל דק המקיף את לומן (סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר). (B)תמונה מייצגת של אורגנויד לא הפוך שנמצא בתנאי תרבות השעיה. גרעינים (כחול = DAPI) ו- E-CADHERIN (אדום) ממוקמים לצד הבסולטרי, ZO-1 (ירוק) בא לידי ביטוי בצד האפי הפונה ללומן של האורגנויד. (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 3: ביטוי גנים של סמני תאים מובחנים בתרבויות חד שכבתיות. (A,B,C) ביטוי של MUC2, CHGA, ו KRT20 בתרבות מונו-שכבתית שקועה ומובחנת ALI שנוצרת במדיום בידול אורגנויד מעיים ביחס לתרבות אורגנויד תלת-ממדית הגדלה עם מדיום הרחבת אורגנויד מעיים שהוקם באמצעות qPCR. הקמת תרבות חד-שכבתית שקועה מגבירה את הביטוי של כל סמן תא מובחן; עם זאת, בידול כתרבות ALI מגביר את הביטוי של כל סמן באופן אקספוננציאלי. קווי שגיאה = +/- SEM. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

כלי תרבות של שכבות מונו-שכבתיותמספר בארות של אורגנוידים במעיים לקצור (מ 50 μL כיפה / לבאר להיות זרע)
6.5 מ"מ תוספת טרנסוול1 - 2 בארות
12 מ"מ טרנסוול להוסיף3 - 4 בארות
צלחת 6-באר6 - 8 בארות
צלחת 24-באר3 - 4 בארות
צלחת 96-באר1 - 2 בארות

טבלה 1: מספר בארות של organoids מעיים לקצור עבור כלי תרבות שונים

Discussion

מודלים organoid אפיתל הפכו פלטפורמות חזקות שניתן להשתמש בהם כדי מודל ארגון רקמות, התקדמות המחלה, ולזהות טיפולית23,28,29. microinjection Organoid יש ערך מוסף ליכולת האורגנוידים של מידול מחלות זיהומיות כפי שהוא מאפשר אינטראקציה פתוגן עם הצד האפיקלי של האפיתל המארח. ההתקדמות האחרונה בטכניקות מיקרו-אינפלציה מיטבו את מהירות ההזרקה באורגנוידים והגיעו לקצב של עד 90 organoids מוזרק לשעה. פונקציית המחסום באורגנוידים מוזרקים נשמרה, וריכוז החמצן הנמוך בתוך הלומן אפשר את הישרדותם של חיידקים מוזרקיםחובה-אנאירוביים 30. עם זאת, מחקרים ציינו את נוכחותה של הטרוגניות באוכלוסיות אורגנויד באותה באר. הבדלים אלה נצפו בגודל ובצורה31, רמות ביטוי של גנים מרכזיים32, כמו גם שיעוריהתפשטות 33. תגובות דיפרנציאליות בתוך אותה אוכלוסיית organoid לתרכובות כגון forskolin ו PGE2, או רעלן כולרה, תוארו גם28,33. תוצאות אלה מדגישות את הצורך במספרים אורגנוידים גבוהים במחקרים ומגבילים את ניצול הזרקת זוהר.

תרבות האורגנויד הקונבנציונלית מבוססת על אנקפסולציה והפצה של אורגנוידים בהידרוג'ל. עם זאת, הידרוג'ל יכול להוות מגבלות על דיפוזיה ולהציג שיפועי ריכוז, אשר יכול להגביר את ההטרוגניות34. יתר על כן, תועדו שונות גבוהה, לא רק בין תרבויות ותורמים אלא גם בתנאי ניסוי בודדים. מקור התורם, תכונות ביוכימיות של הידרוג'ל, והטרוגניות מהותית של האורגנויד כמערכת תרבות הם גורמים חשובים שיכולים להגביר את השונות הניסיונית ולהגביל את יכולת הרבייה של תוצאות שהושגו ביישומים במורד הזרם. שתי השיטות המתוארות כאן מספקות אמצעי פשוט לחשיפת הצד האפיקלי של האפיתל, ומאפשרות מידול של תרכובות ופתוגנים של עניין על ידי הוספתם ישירות למדיום התרבותי. הירידה בניצול הידרוג'ל יכולה להגביל את השונות הניסיונית ממקורות שגיאה טכניים.

האורגנוידים במעיים האפיקליים שומרים על מאפיינים מרכזיים של מערכת המודל האורגנויד והמדרגיות שלהם הופכת אותם למקובלים יותר עד תפוקה גבוהה, בהשוואה למונו-שכבתית הדו-ממדית. עם זאת, כמו organoids לשמור על המבנה 3D שלהם, הנגישות של הצד הבזלי מוגבלת ועלול לעכב מחקרים הדורשים גישה לשני הצדדים בו זמנית.

הוכחנו כי היפוך הקוטביות של organoids מעיים מסתמך על הסרה יעילה ומוחלטת של ECM, תוך שמירה על המבנה שלם של organoids. הן השימוש בפתרון הדיסוציאציה להסרת ECM והן הפתרון האנטי-דבק כדי למנוע דבקות אורגנוידים בכלי הפלסטיק תרמו ameliorating היעילות הכוללת של הפרוטוקול שפורסם על ידי Co, J. Y. ועמיתיו22, במיוחד לגבי מספר organoids apical-out המיוצר עבור יישומים במורד הזרם.

יתר על כן, ראינו כי הפרוטוקול שלנו תומך היפוך יעיל יותר של organoids קטן מ 250 מיקרומטר ושימוש organoids גדול יותר עלול לגרום פלט organoid מופחת, בשל הפיצול שנגרם על ידי pipetting. טיפים רחבים, כגון אלה המצוינים בטבלת החומרים, עשויים לאפשר ניצול של organoids גדול יותר. עם זאת, טיפים רחב נשא יעילים פחות דיסוציאציה ECM בהשוואה טיפים סטנדרטיים בשל כוח מכני מיושם נמוך יותר. לכן, שלבים חוזרים 1.2.9-1.2.11 עשויים להידרש לשיבושים מספיקים והסרה מלאה של כל שרידי ECM בעת עבודה עם organoids גדול יותר.

אורגנואידים בהשעיה יכולים לשרוד לפחות שבועיים. לאחר פרק זמן זה, ראינו שינויים מורפולוגיים ומספר גדל של מוות תאים. נוכחותם של תאים מתרבים באורגנוידים apical-out22 מאפשרת הקמה מחדש של תרביות organoid מעיים apical-in. זה יכול להיות מושגת על ידי ניתוק organoids apical-out לתאים בודדים והטבעת אותם ECM עם מדיום הרחבת אורגנויד מעיים.

מגבלה שנתקלת בה לעתים קרובות בפרוטוקולים המתארים הקמת אורגנואידים במעיים בתרביות השעיה היא דור של אגרגטים גדולים. זה משפיע על מספר משתנים כגון יעילות, רבייה של התכונות המורפולוגיות, חמיכות לתרכובות, ואיתות paracrine. בדומה לפרוטוקול שפורסם על ידי Co, J. Y. ועמיתיו, כאן אנו מאשרים כי השיג היפוך קוטביות של לפחות 97% מכל organoids מושעה ללא גיזום לאחר 3 ימים בהשעיה. עם זאת, בניגוד לפרסום, הצגנו צעד ניתוק מכני על מנת להפחית את היווצרות האגרגטים הגדולים ולהגדיל את התשואה. מאז הליך זה עלול לפגוע האפיתל של organoids, הארכנו את תקופת הדגירה organoids במשך יומיים נוספים כדי לאפשר התאוששות אפיתל מלאה ולהבטיח תרבויות באיכות גבוהה עבור יישומים במורד הזרם. כניסת תסיסה מתמדת עם השימוש בשייקר אינקובטור או בקבוקון ספינר עשויה להפחית אירועי היתוך, למזער פיצולים ולהגביר את החמצון. גישות חלופיות אלה עשויות לשמור על התרבויות למשך זמן ארוך יותר, להפחית את מות התאים ולאפשר הבחנה נוספת של האורגנוידים במעיים.

הקמתו של מונו-שכבתית 2D שמקורו באורגנויד מספקת מספר יתרונות וחסרונות בהשוואה לאורגנואידים הקוטביים ההפוכים. הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר הקמה מהירה של תרבות מונולייר משוחחת, בדרך כלל, תוך פחות מ -7 ימים ואפשרות לתחזוקה ארוכת טווח של התרבויות לתקופה ממושכת (עד 10 שבועות). הפרוטוקול והמדיה המשמשים כאן מאפשרים גם הבחנה יעילה של מספר משמעותי של תאים, לא תמיד נמצא בתרבויות מונו-שכבתיות אחרות שמקורן באורגנויד16. הקמת monolayer על קרום הכנסת תרבית התא מאפשר גישה בו זמנית הן לצדים apical ו basolateral של האפיתל מה שהופך אותם אידיאליים עבור מחקרים שלמות המחסום והובלה אפיתל. גישה פשוטה זו גם הופכת אותם נוחים יותר למחקרי זיהום וטיפול תרופתי. יתר על כן, תרבויות אלה שומרות על רבים מהמאפיינים הייחודיים לתורם, תוך שמירה על הרלוונטיות שלהן למחקרים ספציפיים למטופל. שיטת התרבות ALI גם מקלה על ההבחנה של אפיתל פונקציונלי יותר המורכב מסוגי תאים הפרשתיים וספיגה, מה שהופך אותו לייצוגי יותר של אפיתל המעי האנושי. היציבות היחסית של תרבויות אלה מאפשרת גם לשמור עליהן לתקופה ממושכת, ומספקת את האפשרות ללימודים ארוכי טווח. עם זאת, מגבלות של גישה זו הן המספר הגבוה של תאים הנדרשים כדי להקים monolayer confluent ואת הצורך לשמור על השפעה מלאה יש הפרדה פונקציונלית בין התאים apical ו basolateral. ארכיטקטורת הקריפטה האופיינית, אשר ניתן לדגמן בתרבויות האורגנויד 3D הולך לאיבוד גם עם הקמת תרבות monolayer. עם זאת, הפורמט הידידותי מבחינה ניסיונית של התרבות ואת הקלות שבה ניתן לגשת לצדדים apical ו basolateral של האפיתל, להפוך אותו כלי רב עוצמה לחקר פיזיולוגיה של המעי.

Disclosures

G. S., W.C., ו S. S. הם עובדים של STEMCELL טכנולוגיות בע"מ, קיימברידג '(בריטניה). מ.ס., פ. א', ש.ל., א.א. ור.ק.C הם עובדי STEMCELL Technologies Inc. , ונקובר (קנדה).

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי מענק Horizon 2020 OrganoVIR 812673 על פרויקט Organoids לחקר וירוסים - תוכנית אימון-ITN חדשנית.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-Adherence Rinsing SolutionSTEMCELL Technologies Inc.7010For coating cultureware. Referred as anti-adherent solution into the main text.
Conical tubes, 15 mLSTEMCELL Technologies Inc.38009
Corning Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-FreeCorning356231Extracellular matrix (ECM) for maintenance and establishment of organoid lines.
Costar 6.5 mm or 12 mm Transwell insertsSTEMCELL Technologies Inc.38023/38024For 2D Monolayer culture.
Costar 24 Well  Flat-Bottom, Tissue culture-treated plateSTEMCELL Technologies Inc.38017For maintenance and establishment of organoid lines.
D-PBS (Without Ca++ and Mg++)STEMCELL Technologies Inc.37350For washing 
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Millipore SigmaD2650Reconstitution of small molecules
DMEM/F-12 with 15 mM HEPESSTEMCELL Technologies Inc.36254For washing
Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR)STEMCELL Technologies Inc.7174For Matrigel removal. Referred as dissociation reagent into the main text.
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)STEMCELL Technologies Inc.6010For expansion of organoid lines prior to differentiation. Referred as Intestinal Organoid Expansion Medium into the main text.
IntestiCult Organoid Differentiation Medium (Human)STEMCELL Technologies Inc.100-0214For establishment of monolayers and 3D differentiation. Referred as Intestinal Organoid Differentiation Medium into the main text.
Trypsin-EDTA (0.05%)STEMCELL Technologies Inc.7910For 2D Monolayer establishment.
Y-27632STEMCELL Technologies Inc.72302RHO/ROCK pathway inhibitor, Inhibits ROCK1 and ROCK2. Used for 2D monolayer establishment.
Wide bore tipsCorning#TF-1005-WB-R-SOrganoids handling

References

  1. Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).
  2. Schneeberger, K., Roth, S., Nieuwenhuis, E. E. S., Middendorp, S. Intestinal epithelial cell polarity defects in disease: lessons from microvillus inclusion disease. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).
  3. Klunder, L. J., Faber, K. N., Dijkstra, G., Van Ijzendoorn, S. C. D. Mechanisms of cell polarity - Controlled epithelial homeostasis and immunity in the intestine. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (7), 0227888 (2017).
  4. DiMarco, R. L., Hunt, D. R., Dewi, R. E., Heilshorn, S. C. Improvement of paracellular transport in the Caco-2 drug screening model using protein-engineered substrates. Biomaterials. 129, 152-162 (2017).
  5. Sun, H., Chow, E. C., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
  6. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  7. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  8. Zhang, Y. -. G., Wu, S., Xia, Y., Sun, J. Salmonella-infected crypt-derived intestinal organoid culture system for host-bacterial interactions. Physiological Reports. 2 (9), 12147 (2014).
  9. Nigro, G., Rossi, R., Commere, P. -. H., Jay, P., Sansonetti, P. J. The cytosolic bacterial peptidoglycan sensor Nod2 affords stem cell protection and links microbes to gut epithelial regeneration. Cell Host & Microbe. 15 (6), 792-798 (2014).
  10. Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
  11. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  12. Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infection and Immunity. 83 (1), 138-145 (2015).
  13. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Mutational signature in colorectal cancer caused by genotoxic pks(+) E. coli. Nature. 580 (7802), 269-273 (2020).
  14. Fernando, E. H., et al. A simple, cost-effective method for generating murine colonic 3D enteroids and 2D monolayers for studies of primary epithelial cell function. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 313 (5), 467-475 (2017).
  15. Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).
  16. Wang, Y., et al. Long-term culture captures injury-repair cycles of colonic stem cells. Cell. 179 (5), 1144-1159 (2019).
  17. Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 45270 (2017).
  18. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  19. Thorne, C. A., et al. Enteroid monolayers reveal an autonomous WNT and BMP circuit controlling intestinal epithelial growth and organization. Developmental Cell. 44 (5), 624-633 (2018).
  20. Wang, A. Z., Ojakian, G. K., Nelson, W. J. Steps in the morphogenesis of a polarized epithelium: I. Uncoupling the roles of cell-cell and cell-substratum contact in establishing plasma membrane polarity in multicellular epithelial (MDCK) cysts. Journal of Cell Science. 95 (1), 137-151 (1990).
  21. Wang, A. Z., Ojakian, G. K., Nelson, W. J. Steps in the morphogenesis of a polarized epithelium: II. Disassembly and assembly of plasma membrane domains during reversal of epithelial cell polarity in multicellular epithelial (MDCK) cysts. Journal of Cell Science. 95 (1), 153-165 (1990).
  22. Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: a human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
  23. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  24. Dodt, H. -. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  25. Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
  26. Crowley, S. M., et al. Intestinal restriction of Salmonella Typhimurium requires caspase-1 and caspase-11 epithelial intrinsic inflammasomes. PLoS Pathogens. 16 (4), 1008498 (2020).
  27. Rees, W. D., et al. Enteroids derived from inflammatory bowel disease patients display dysregulated endoplasmic reticulum stress pathways, leading to differential inflammatory responses and dendritic cell maturation. Journal of Crohn's & Colitis. 14 (7), 948-961 (2020).
  28. Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
  29. Almeqdadi, M., Mana, M. D., Roper, J., Yilmaz, &. #. 2. 1. 4. ;. H. Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).
  30. Williamson, I. A., et al. A high-throughput organoid microinjection platform to study gastrointestinal microbiota and luminal physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
  31. Kassis, T., Hernandez-Gordillo, V., Langer, R., Griffith, L. G. OrgaQuant: human intestinal organoid localization and quantification using deep convolutional neural networks. Scientific Reports. 9 (1), 12479 (2019).
  32. Gracz, A. D., et al. A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis. Nature Cell Biology. 17 (3), 340-349 (2015).
  33. Gunasekara, D. B., et al. Development of arrayed colonic organoids for screening of secretagogues associated with enterotoxins. Analytical Chemistry. 90 (3), 1941-1950 (2018).
  34. Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

169monolayers

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved