Kulturmethoden zur Untersuchung apikal-spezifischer Wechselwirkungen mit intestinalen Organoidmodellen

Zusammenfassung

Hier stellen wir zwei Protokolle vor, die die Modellierung von intestinalen apikal-spezifischen Interaktionen ermöglichen. Organoid-abgeleitete intestinale Monoschichten und Air-Liquid-Interface (ALI)-Kulturen erleichtern die Erzeugung von gut differenzierten Epithelien, die sowohl von luminaler als auch von basolateraler Seite zugänglich sind, während polaritätsinvertierte Darmorganoide ihre apikale Seite freilegen und für Hochdurchsatz-Assays zugänglich sind.

Zusammenfassung

Die Auskleidung des Darmepithels besteht aus einer einfachen Schicht spezialisierter Epithelzellen, die ihre apikale Seite dem Lumen aussetzen und auf äußere Hinweise reagieren. Die jüngste Optimierung der In-vitro-Kulturbedingungen ermöglicht die Wieschaffung der intestinalen Stammzellnische und die Entwicklung fortschrittlicher 3-dimensionaler (3D) Kultursysteme, die die Zellzusammensetzung und die Organisation des Epithels rekapitulieren. Darmorganoide, die in eine extrazelluläre Matrix (ECM) eingebettet sind, können langfristig aufrechterhalten und selbstorganisiert werden, um ein gut definiertes, polarisiertes Epithel zu erzeugen, das ein inneres Lumen und eine externe exponierte Basalseite umfasst. Diese restriktive Natur der Darmorganoide stellt Herausforderungen beim Zugang zur apikalen Oberfläche des Epithels in vitro dar und schränkt die Untersuchung biologischer Mechanismen wie Nährstoffaufnahme und Wirt-Mikrobiota/Wirt-Pathogen-Interaktionen ein. Hier beschreiben wir zwei Methoden, die den Zugang zur apikalen Seite des Organoidepithels erleichtern und die Differenzierung spezifischer Darmzelltypen unterstützen. Zunächst zeigen wir, wie die ECM-Entfernung eine Inversion der Epithelzellpolarität induziert und die Erzeugung von apikalen 3D-Organoiden ermöglicht. Zweitens beschreiben wir, wie man 2-dimensionale (2D) Monoschichten aus Einzelzellsuspensionen erzeugt, die aus Darmorganoiden gewonnen werden, die aus reifen und differenzierten Zelltypen bestehen. Diese Techniken bieten neuartige Werkzeuge, um apikal-spezifische Wechselwirkungen des Epithels mit externen Hinweisen in vitro zu untersuchen und die Verwendung von Organoiden als Plattform zur Erleichterung der Präzisionsmedizin zu fördern.

Einleitung

Das Darmepithel ist das zweitgrößte Epithel im menschlichen Körper und besteht aus einer polarisierten Zellschicht, die die Nährstoffaufnahme erleichtert und als Barriere gegen Umwelteinflüsse wirkt¹. Diese Unterscheidung zwischen der apikalen und der basolateralen Seite ermöglicht es den Zellen des Epithels, ihre vielfältigen Funktionen auszuführen. Das apikale Kompartiment wird dem Lumen ausgesetzt und vermittelt die epithelialen Wechselwirkungen mit Umweltreizen und Mikroorganismen und erleichtert gleichzeitig die Nährstoffaufnahme. Die basolaterale Oberfläche beherbergt interzelluläre Verbindungen und Zellmatrixadhäsionen, während sie mit Zellen des Immunsystems und anderen Geweben^{verbunden ist 2}. Diese Verbindungen erzeugen eine undurchlässige Monoschicht, die an der Basalmembran befestigt ist, die als Barriere fungiert und die aufgenommenen Nährstoffe an das umgebende Körpergewebe abgibt.

Die Etablierung von Kultursystemen, die in der Lage sind, diese Darmfunktionen in vitro zu rekapitulieren, war eine Herausforderung³. Herkömmliche In-vitro-Modelle verwenden transformierte menschliche Darmkrebszelllinien wie Caco-2, um 2D-Monoschichtkulturen zu erzeugen. Obwohl diese Modelle in der Lage sind, mehrere Funktionen des absorbierenden Kompartiments zu modellieren, können sie die Zusammensetzung und Funktion des Darmepithels nicht vollständig rekapitulieren, was die wichtigsten funktionellen Merkmale und Anwendungen einschränkt^4,5.

Die Entstehung von Organoiden als fortschrittliches 3D-Kultursystem, das aus Stammzellen erzeugt wird, die sich selbst organisieren und zu organspezifischen Zelltypen differenzieren können, war ein Durchbruch in der In-vitro-Studie des^{Darmepithels 6}. Darmorganoide sind in eine extrazelluläre Matrix (ECM) eingebettet, die der Basallamina ähnelt und Zell-Matrix-Verbindungen bildet, die es diesen Kulturen ermöglichen, die apikobasale Polarität des Epithels beizubehalten. Organoide weisen eine geschlossene Architektur auf, bei der die apikale Seite dem luminalen Kompartiment ausgesetzt ist und so die Struktur des Darms nachahmt. Obwohl diese geschlossene Organisation die Möglichkeit bietet, orientierungsspezifische Funktionen zu untersuchen, schränkt sie Untersuchungen ein, die einen Zugang zur apikalen Seite des Epithels erfordern. Es wurden verschiedene Ansätze verfolgt, um diese Einschränkungen sowohl in 2D als auch in 3D zu überwinden, einschließlich Organoidfragmentierung, organoider Mikroinjektion und Erzeugung von Monolayer-Kulturen⁷. Organoidfragmentierung verursacht den Verlust der strukturellen Organisation und die Zerstörung von Zellverbindungen, was die Exposition der apikalen Oberfläche des Epithels gegenüber dem Medium ermöglicht. Diese Technik nutzt die regenerative Fähigkeit der Fragmente, Organoide zu reformieren, wenn sie in eine extrazelluläre Matrix eingesät werden, und wurde verwendet, um Infektionskrankheiten und Wirt-Pathogen-Interaktionen zu modellieren^8,9. Der gleichzeitige Zugang sowohl zur apikalen als auch zur basalen Oberfläche kann jedoch auch unspezifische Reaktionen auf infektionen hervorrufen.

Ein alternativer Ansatz, der den Zugang zur apikalen Oberfläche ermöglicht und sowohl die strukturelle Architektur als auch die Zellverbindungen bewahrt, wird durch die Mikroinjektion von Faktoren in das Lumen von Organoiden dargestellt. Diese Methode wurde ausgiebig eingesetzt, um Wirt-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen und die Auswirkungen von Cryptosporidium¹⁰, H. pylori¹¹und C. difficile¹² auf das gastrointestinale Epithel in vitro zu modellieren. Mit ähnlichen Techniken wurde das mutagene Potential des pks⁺ -Stammes von E. coli auf Darmepithel bestimmt¹³. Obwohl effektiv, ist die organoide Mikroinjektion eine mühsame und ineffiziente Aufgabe, wenn man die hohe Anzahl von Organoiden bedenkt, die injiziert werden müssen, um messbare Effekte zu erzielen, und daher ihre Anwendung für Hochdurchsatz-Assays einschränkt.

Jüngste Fortschritte mit intestinalen Organoiden haben auch Methoden zur Etablierung von 2D-Monolayer-Organoidkulturen bereitgestellt, wodurch ihre apikale Oberfläche^14,15,16,17freigelegt wird. Diese organoidbasierten Monoschichten rekapitulieren wichtige In-vivo-Eigenschaften des Darmepithels. Sie weisen eine physiologisch relevante Zellzusammensetzung auf, die sowohl differenzierte als auch Stammzellpopulationen enthält und modellieren die Diversität über die Kryptenzottenachse. Da die apikobasale Polarität erhalten bleibt, ermöglichen die inhärenten Monoschichteigenschaften einen einfachen Zugang sowohl der apikalen als auch der basolateralen Seite, und der Medienaustausch kann den Darmfluss und die Abfallentfernung nachahmen, was eine langfristige Kultur ermöglicht. Diese Eigenschaften machen organoidbasierte Monoschichten für Studien mit Schwerpunkt auf luminalen Wechselwirkungen geeignet und bieten ein überlegenes Modell für die Integrität und Permeabilität der epithelialen Barriere^18,19.

Studien haben gezeigt, dass die Polarität von Epithelzellen durch ECM-Proteine in den MDCK-Sphäroiden^20,21 und kürzlich in menschlichen Darmorganoiden²²streng reguliert wird. Die Entfernung von ECM-Komponenten oder die Hemmung des Integrinrezeptors, der die Zell-Matrix-Verbindungen vermittelt, führt zu einer Polaritätsumkehr der Intestinalorganoide und zur Exposition der apikalen Seite des Epithels gegenüber dem Medium²². Dieser Ansatz hat das Interesse von Forschern geweckt, die an Infektionskrankheiten arbeiten, da er einen einfachen Zugang zur apikalen Seite in 3D ermöglicht und für Hochdurchsatz-Assays zugänglich macht. Hier beschreiben wir ein modifiziertes Protokoll, das auf der jüngsten Arbeit des Amieva-Labors²²basiert und die Erzeugung von 3D-Darmorganoiden erleichtert, die ihre apikale Seite leicht freilegen. Wir skizzieren auch ein Protokoll, das effizient und reproduzierbar intestinale 2D-Monoschichten aus Darmorganoiden erzeugen kann.

Protokoll

Die Ableitung menschlicher intestinaler Organoidkulturen wurde wie an anderer Stelle beschrieben^{durchgeführt 23}. Organoide wurden in Kultur gehalten, wie im Produktinformationsblatt (PIS) für das intestinale Organoid-Expansionsmedium beschrieben (siehe Materialtabelle).

1. Inversion der intestinalen Organoidpolarität

HINWEIS: In diesem Abschnitt wird das Protokoll zur Invertierung der Polarität von 3D-Darmorganoiden beschrieben. Dieses Protokoll bietet ein detailliertes Verfahren für die Etablierung polarisierter Organoide mit einer freiliegenden apikalen Oberfläche in Suspension in einer Kulturplatte. Dieses Protokoll ist als Endpunkt-Assay gedacht, obwohl die Organoide in dieser Konformation für mehr als 2 Wochen beibehalten werden könnten und eine kleine Stammzellpopulation aufrechterhalten könnten, die es ihnen ermöglicht, apikale Organoide bei der Passage wiederherzustellen.

1. Beschichtung von Kulturwaren und Röhrchen mit antihafter Lösung
   HINWEIS: Um die Anzahl der apikalen Darmorganoide zu maximieren und eine unerwünschte Anhaftung an die Kulturware zu verhindern, ist in der Regel eine Vorbeschichtung der Kulturware erforderlich. Der folgende Abschnitt beschreibt die Beschichtung von Kultur- und Kunststoffwaren mit antihafter Lösung.
   1. Beschichtungskulturplatten, die im Suspensionsteil des Protokolls wie folgt verwendet werden sollen.
      1. Fügen Sie 0,5 ml antihaftende Lösung zu jeder Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte hinzu.
      2. Schwenken Sie die Platte, um die Lösung gleichmäßig über die Oberfläche und die Wände der Brunnen zu verteilen.
      3. Zentrifugiert die Platte bei 1.300 x g für 10 min.
      4. Entfernen Sie die antihaftende Lösung aus jeder Vertiefung mit einem Absauger oder einer 1 ml Pipette.
      5. Waschen Sie die Vertiefungen mit 1 ml DMEM/F-12 mit 15mM HEPES (DMEM/F12).
      6. Füllen Sie jedes gut gewaschene Gut mit 0,5 ml DMEM/F-12 und lagern Sie die Platte bei 37 °C und 5% CO₂ bis zur Verwendung.
         HINWEIS: Wenn sie nicht sofort verwendet werden, können die beschichteten Platten mindestens 1 Woche im Inkubator aufbewahrt werden.
   2. Beschichten Sie 15 ml konische Rohre, die in diesem Protokoll verwendet werden, wie folgt.
      1. Fügen Sie 4 ml antihaftende Lösung in das konische 15-ml-Rohr hinzu.
      2. Schwenken Sie das Rohr, um die Lösung gleichmäßig über die Oberfläche der Wände zu verteilen.
      3. Zentrifugen Sie das Röhrchen bei 1.300 x g für 10 min.
      4. Entfernen Sie die antihaftende Lösung aus dem Röhrchen.
      5. Waschen Sie das Röhrchen 1x mit 5 mL DMEM/F-12 und saugen Sie das DMEM/F-12 an. Die Rohre sind nun einsatzbereit.
         HINWEIS: Wenn nicht sofort verwendet, fügen Sie 5 ml DMEM/F12 hinzu und lagern Sie es bei 4 °C. Beschichtete Röhrchen können mindestens eine Woche bei 4 °C aufbewahrt werden.
2. Polaritätsinversion von Darmorganoiden durch Suspensionskultur
   HINWEIS: Die folgenden Schritte beschreiben die Inversion von Darmorganoiden, die zuvor unter Standard-ECM-Dome-Bedingungen kultiviert wurden. Die hier beschriebenen Verfahren gelten für eine Vertiefung einer 24-Well-Platte. Wenn Sie andere Cultureware verwenden, passen Sie die Lautstärke entsprechend an.
   1. Entfernen und entsorgen Sie vorsichtig das Medium aus jeder Vertiefung, die Organoide enthält, ohne die extrazelluläre Matrixkuppel der Basalmembran zu stören. Stellen Sie sicher, dass die Größe der Organoide einen Durchmesser von 150-250 μm hat (typischerweise an Tag 3-5), bevor Sie mit dem Inversionsprotokoll beginnen.
   2. Fügen Sie 1 ml eiskalte Dissoziationslösung in jede Vertiefung hinzu.
   3. Bei Raumtemperatur (15-25 °C) für 1 min. inkubieren.
   4. Fügen Sie mindestens 2 ml antihaftende Lösung zu einem 15-ml-Röhrchen hinzu, das zur Beschichtung von Kunststoffspitzen verwendet wird.
   5. Fügen Sie mindestens 2 ml DMEM/F-12 in ein 15-ml-Röhrchen hinzu, das zum Waschen von Kunststoffspitzen verwendet wird, die mit antihafter Lösung gespült werden.
   6. Beschichten Sie eine 1 mL Pipettenspitze mit antihaftierender Lösung und pipettieren Sie 1 ml Lösung dreimal in das Röhrchen mit antihaftierender Lösung aus Schritt 1.2.4.
   7. Waschen Sie die Spitze in kaltem DMEM/F-12 und pipettieren Sie 1 ml Lösung dreimal mit DMEM/F-12 ab Schritt 1.2.5 in das Rohr.
   8. Entfernen Sie die Kuppeln mit der beschichteten Spitze vorsichtig, indem Sie langsam pipettieren. Achten Sie darauf, die Organoide nicht zu stören oder zu fragmentieren.
   9. Die Organoidsuspension wird auf eine platte übertragen, die mit antihaftender Lösung behandelt wurde (ab Schritt 1.1.1).
   10. Legen Sie die Platte für 30 min bei 4 °C auf einen Shaker. Ein Gyro-Shaker kann bei 70 U / min verwendet werden.
       HINWEIS: Vermeiden Sie hartes Schütteln, z. B. das Vortexing der Probe, da dies zu einer Organoidfragmentierung führen kann. Die Bildung von Blasen und Schaum kann auf hartes Schütteln hinweisen.
   11. Nach 30 Minuten die Platte entfernen. Mit einer 1 mL Pipettenspitze, die mit antihaftender Lösung beschichtet ist, pipetieren Sie die Lösung vorsichtig nach oben und unten.
   12. Legen Sie die Platte für 15 min auf einen Shaker bei 4 °C. Ein Gyro-Shaker kann bei 70 U / min verwendet werden.
   13. Entfernen Sie die Platte und lassen Sie die Organoide durch die Schwerkraft absetzen (1-2 min bei Raumtemperatur). Beobachten Sie die Platte unter dem Mikroskop, um die organoide Sedimentation zu überprüfen.
       HINWEIS: Vermeiden Sie ein ausgedehntes Rühren der Platte, da dies dazu führen kann, dass sich abgesetzte Organoide wieder aufregen.
   14. Nachdem sich die Organoide absetzen, entfernen Sie so viel dissoziationslösung wie möglich und waschen Sie sie, indem Sie 1,5 ml DMEM / F-12 hinzufügen.
   15. Lassen Sie die Organoide sedimentieren und entfernen Sie so viel wie möglich vom Überstand. Wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal.
       HINWEIS: Beobachten Sie die Platte unter dem Mikroskop, um die organoide Sedimentation zu überprüfen, bevor Sie einen Waschschritt durchführen.
   16. Entfernen Sie so viel DMEM/F-12 wie möglich und fügen Sie 0,5 ml Intestinal Organoid Expansion Medium hinzu. Bei 37 °C und 5% CO_{2 inkubieren.}
   17. Führen Sie am nächsten Tag eine teilweise Mediumsänderung durch, indem Sie die Platte in einem Winkel von 25 bis 30 Grad neigen und das Medium entlang der Wand des Brunnens entfernen. Entfernen Sie 0,4 ml Medium und achten Sie darauf, suspendierte Organoide nicht zu entfernen.
   18. Fügen Sie 0,4 ml Intestinal Organoid Expansion Medium hinzu. 3 Tage lang bei 37 °C und 5% CO₂ inkubieren.
       HINWEIS: Nach 3 Tagen sollten die meisten Organoide eine apikale Polarität aufweisen, aber es können sich große Aggregate gebildet haben.
   19. Wenn sich Aggregate gebildet haben, verwenden Sie eine 1-ml-Pipette mit einer mit antihaftierender Lösung beschichteten Spitze (wie in den Schritten 1.2.6 und 1.2.7 beschrieben), um die Aggregate durch 20-maliges Pipettieren nach oben und unten zu scheren, während Das Ende der Spitze in den Boden der Platte gedrückt wird.
   20. Legen Sie die Platte bei 37 °C und 5 % CO₂ auf und führen Sie am nächsten Tag mit dem Darmorganoid-Expansionsmedium (wie in Abschnitt 1.2.17 beschrieben) einen vollständigen Mediumwechsel durch.
   21. Nach 2 Tagen (Tag 5 in Suspension) können apikale Darmorganoide in nachgeschalteten Assays verwendet werden.

2. Etablierung von Intestinalzell-2D-Monolayer- und Air-Liquid-Interface (ALI)-Kulturen, die aus 3D-Darmorganoiden gewonnen werden

HINWEIS: In diesem Abschnitt wird das Protokoll zur Erzeugung von 2D-Monoschichtkulturen aus Darmorganoiden beschrieben. Diese Technik bietet den Vorteil, eine konfluente, polarisierte Monolayer-Kultur mit einer freiliegenden apikalen Oberfläche in einer Gewebekulturplatte mit Zellkulturmembraneinsatz herzustellen. Obwohl sich die Monoschicht im untergetauchten Monolayer-Format zu differenzieren beginnt, kann eine zusätzliche Differenzierung der Monoschicht erreicht werden, indem nach erreichen der Konfluenz auf eine ALI-Kultur umgestellt wird. Sowohl das Monolayer- als auch das nachfolgende ALI-Protokoll sind als Endpunkt-Assays gedacht, und obwohl die Monolayer-Kultur eine kleine Stammzellpopulation aufrechterhält, kann keines von beiden effizient gespalten und nach ihrer Gründung durchgereicht werden.

1. Vorbereitung von Medien und Platten für die intestinale Monoschichtkultur
   1. Vorbereiten Sie das intestinale Organoid-Differenzierungsmedium, wie vom Hersteller für die Monolayer-Kultur beschrieben (siehe Liste der Materialien). Fügen Sie Y-27632 nur zu einem Mediumvolumen hinzu, das innerhalb von 1 Woche in einer Endkonzentration von 10 μM verwendet wird. Bei nicht sofortiger Verwendung bei 4 °C lagern.
   2. Vorwarmes Trypsin EDTA (0,05%) bis 37 °C.
   3. Bereiten Sie mindestens 2 h vor der Aussaat von Monolayer-Kulturen eine 2% ige ECM-Beschichtungslösung wie folgt vor.
      1. ECM auf Eis auftauen und 1:50 zu kaltem, sterilem PBS hinzufügen, um eine 2% ige Lösung zuzubereiten. Bereiten Sie ausreichende Mengen vor, um 100 μL in die obere Vertiefung jedes zu verwendenden 6,5 mm (0,33 cm²⁾Zellkulturmembraneinsatzes zu geben. Passen Sie die Lautstärke für größere oder kleinere Kulturen entsprechend an.
   4. 100 μL in jede Vertiefung geben und jede Platte bei 37 °C und 5% CO₂ bis zum Bedarf (mindestens 2 h vor der Aussaat) inkubieren.
2. Dissoziierende Darmorganoide für monoschichtige Erzeugung und Kultur
   1. Entfernen Sie eine angemessene Anzahl von Organoidkulturbrunnen aus dem Inkubator. In Tabelle 1 finden Sie die empfohlene Anzahl von Brunnen, die für verschiedene Kulturgeräte geerntet werden sollen.
   2. Saugen Sie das gesamte Medium aus den Organoidkulturen ab, ohne die ECM-Kuppel zu stören.
   3. Fügen Sie 1 ml Dissoziationslösung zu jeder Vertiefung hinzu.
   4. Bei Raumtemperatur (15-25 °C) für mindestens 1 min inkubieren.
   5. Mit einer 1-ml-Pipette kräftig auf und ab pipetten, um die Kuppel zu stören und die Organoide freizusetzen.
   6. Die suspendierten Organoide aus jedem Brunnen in einem 15 ml konischen Rohr bündelen. Bei Raumtemperatur 10 min mit sanftem Rühren oder Schaukeln inkubieren. Organoide für die Aussaat mehrerer Vertiefungen können in diesem Schritt mit bis zu 10 ml Volumen in jedem Röhrchen gebündelt werden.
   7. Zentrifuge bei 200 x g für 5 min bei 4 °C.
   8. Entfernen und verwerfen Sie den Überstand. Fügen Sie 5 ml eiskaltes DMEM / F-12 hinzu, um Organoide wieder zu resuspendieren.
   9. Mischen und zentrifugieren Sie erneut bei 200 x g für 5 min bei 4 °C.
   10. Saugen Sie den Überstand an, entfernen Sie so viel wie möglich und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.
       HINWEIS: Ein Rest-ECM kann im Pellet verbleiben; Dies sollte jedoch die Dissoziation der Organoide nicht signifikant beeinflussen.
   11. Fügen Sie 1 ml vorgewärmtes (37 °C) Trypsin-EDTA (0,05%) hinzu, um Organoide wieder zu resuspendieren. Gründlich mischen, um eine gleichmäßige Suspension zu gewährleisten. Addieren Sie zusätzliche 1 ml Trypsin-EDTA für eine große Anzahl von Zellen oder wenn eine signifikante Menge an ECM verbleibt.
   12. Bei 37 °C 5-10 min inkubieren.
   13. Mischen Sie gründlich mit einer 1 ml Pipette, um die Organoide so weit wie möglich zu stören. Organoide sollten vollständig in einzelne Zellen oder kleine Fragmente zerlegt werden. Wenn nach gründlichem Pipettieren größere Fragmente oder ganze Organoide übrig bleiben, setzen Sie die Inkubation mit Trypsin-EDTA bei 37 °C für weitere 3-5 min fort.
       HINWEIS: Inkubieren Sie Trypsin-EDTA nicht mehr als 20 Minuten, da dies zu einem erhöhten Verlust der Zelllebensfähigkeit führen kann.
   14. Sobald die Organoide ausreichend dissoziiert sind, fügen Sie ein gleiches Volumen dmEM / F-12 hinzu (z. B. 1 ml DMEM / F-12 pro ml Trypsin-EDTA) und pipetetten Sie auf und ab, um gründlich zu mischen. Deaktivieren Sie Trypsin-EDTA, indem Sie dem DMEM/F-12 in diesem Schritt 10% FBS hinzufügen.
   15. Zentrifugenfragmente bei 200 x g für 5 min bei 2-8 °C.
   16. Wenn die dissoziierten Organoide nicht pelletieren, ist dies üblich und kann auf eine Ansammlung von Schleim zurückzuführen sein, der von den dissoziierten Zellen freigesetzt wird. Mischen Sie in diesem Fall die Zellen gründlich durch Pipettieren auf und ab und zentrifugieren Sie sie erneut bei 200 x g für 5 min bei 2-8 °C.
   17. Entfernen Sie vorsichtig so viel Überstand wie möglich und lassen Sie nur das Zellpellet übrig.
   18. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μL intestinales Organoid-Differenzierungsmedium (mit 10 μM Y-27632) für jede zu säende Vertiefung. Passen Sie die Lautstärke für größere oder kleinere Bohrergrößen entsprechend an.
   19. Entfernen Sie die beschichteten Platten aus dem Inkubator (vorbereitet in Schritt 3.1.4) und entfernen Sie das überschüssige ECM aus jeder Vertiefung.
   20. 100 μL der Zellsuspension wird in die obere Vertiefung jedes Zellkultureinsatzes geben.
   21. Fügen Sie 500 μL intestinales Organoid-Differenzierungsmedium in die untere Vertiefung jedes Zellkultureinsatzes hinzu.
   22. Bei 37 °C und 5% CO2 inkubieren.
   23. Ersetzen Sie das Medium sowohl in den oberen als auch in den unteren Vertiefungen alle 2 bis 3 Tage. Monolayer-Kulturen sollten innerhalb von 7 Tagen konfluenz und erreichen oft innerhalb von 2-3 Tagen konfluenz.
3. Aufbau einer Air-Liquid Interface (ALI)-Kultur
   HINWEIS: Falls gewünscht, kann eine weitere Differenzierung einer untergetauchten intestinalen Monolayerkultur durch Den Übergang der submerged monolayer Kultur in eine ALI-Kultur erreicht werden. Diese Kulturmethode wird eine Erhöhung der Anzahl differenzierter Zelltypen ermöglichen, insbesondere Zellen der sekretorischen Linie, wie Speiseble- und enteroendokrine Zellen.
   1. Stellen Sie eine Monolayer-Kultur in einem Zellkultureinsatz wie oben in den Schritten 2.2.1-2.2.23 beschrieben her und halten Sie diese Kultur mindestens 4 Tage lang bei 100% Konfluenz.
   2. Um eine ALI-Kultur zu etablieren, entfernen Sie Das Medium aus den oberen und unteren Vertiefungen. Fügen Sie frisches intestinales Organoid-Differenzierungsmedium (mit Y-27632) in den unteren Brunnen hinzu, wobei der obere Brunnen leer bleibt.
   3. Bei 37 °C und 5% CO_{2 inkubieren.}
   4. Ersetzen Sie das Medium in der unteren Vertiefung alle 2-3 Tage und lassen Sie die Monoschicht mindestens 1 Woche lang differenzieren.
   5. Spülen Sie das Obermaterial gut mit sterilem PBS aus, um bei Bedarf überschüssige Schleimansammlungen zu entfernen.
      Unter diesen Bedingungen kann die ALI-Kultur für mindestens 2-3 Wochen aufrechterhalten werden.

Ergebnisse

Organoide wurden aus Biopsieproben nach dem zuvor beschriebenen Protokoll²³ und im PIS für Intestinal Organoid Expansion Medium (siehe Materialtabelle)erzeugt. Abbildung 1A, Linkes Panel, zeigt den Phänotyp der Darmorganoide, die in einer Kuppel mit Intestinal Organoid Expansion Medium kultiviert wurden. Unter diesen Kulturbedingungen weisen Organoide eine zystische Morphologie auf, die durch ein dünnes (10-25 μm) Epithel definiert ist, das ein Lumen umschließt (Abbildung 1A, Rechtes Panel). In diesem Stadium ist die apikale Seite des Darmepithels dem Lumen zugewandt, während die basolaterale Seite die umgebende extrazelluläre Matrix kontaktiert. Wenn die Mehrheit der Organoide die gewünschte Größe erreichte, wurde die extrazelluläre Matrix entfernt und die Organoide wurden dann in Suspension kultiviert. Der Verlust der zellulären Bindung an die extrazelluläre Matrix löst einen Inversionsprozess in den Organoiden aus, was zu einer Umkehrung der Polarität des Organoidepithels führt, die apikale Seite des Epithels dem Wachstumsmedium aussetzt und die basolaterale Seite verinnerlicht.

In einigen Kulturen aggregieren und verschmelzen Organoide in Suspension, ein Effekt, der in den ersten 3 Tagen tiefer ist (Abbildung 1B, Linkes Panel). Die Anwendung einer Schertechnik ermöglicht die Ablösung der Organoide und die Tagefortsetzung der Kulturen mit minimaler Reaggregation (Abbildung 1B, Rechte Tafel).

Darmorganoide, die in ECM-Kuppeln kultiviert werden, dehnen sich weiter aus (Abbildung 1C, linkes Panel) und zeigen spontane Bildung von sekundären Knospenstrukturen, die kleinen Krypten ähneln, auf der basolateralen Seite des Epithels, das das Lumen umgibt ( Abbildung1C, Rechtes Panel). Gleichzeitig entwickeln sich Organoide, die 5 Tage lang in Abwesenheit einer extrazellulären Matrix aufrechterhalten werden, in Suspension weiter (Abbildung 1D, Linkes Panel). Die Inversion der Polarität ist gekennzeichnet durch die Verdickung (30-40 μm) des Epithels, das den Kern der Organoide umgibt, und das Auftreten einer Vielzahl von Morphologien: länglich (Abbildung 1D, rechtes Panel und ergänzende Abbildung 1A), zystisch (Ergänzende Abbildung 1B) und unregelmäßig (Ergänzende Abbildung 1C). Dies wird oft mit einer Schrumpfung des luminalen Raums innerhalb des Organoids kombiniert, was sich auf ihre Gesamtgröße auswirkt.

Eine effiziente Inversion kann auch durch die Analyse der Expression von darmspezifischen Polaritätsmarkern bestätigt werden. Apikal-out-Darmorganoide zeigen eine deutliche Lokalisation der Kerne in Richtung des Lumens des Organoids, wie das 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Signal anzeigt. Die Expression von apikalen Markern wie VILLIN (Abbildung 2A) und ZO-1 (Abbildung 2B) wird an der Außenseite des Epithels nachgewiesen, das dem Medium ausgesetzt ist. Diese Lokalisation steht in starkem Kontrast zu der, die bei Darmorganoiden beobachtet wird, die in ECM kultiviert werden. Extrazelluläre Matrix-eingebettete Organoide, die für Kerne (DAPI), VILLIN (Abbildung 2C) und ZO-1 (Abbildung 2D) gefärbt sind, zeigen eine apikobasale Polarität, bei der die apikale Seite dem Lumen des Organoids zugewandt ist.

Die vollständige Entfernung von ECM ist erforderlich, um eine effiziente Polaritätsinversion der Darmorganoide zu erreichen. Gelegentlich zeigt ein Teil der Organoide, die in Suspensionskulturen gefunden werden, die von ECM-Rückständen umgeben sind, eine zystische Morphologie, die auf ein Versagen der Polaritätsinversion des Epithels hindeutet (Ergänzende Abbildung 2A). Die Analyse der immunfluoreszierenden Färbung, die an diesen Organoiden durchgeführt wird, liefert Hinweise auf die basolaterale Position der Kerne (DAPI) entlang des Epithels und die Expression von ZO-1 auf der apikalen Seite, die dem Lumen des Organoids zugewandt ist (Ergänzende Abbildung 2B), was bestätigt, dass eine unvollständige ECM-Entfernung die Retention der apikobasalen Polarität in ähnlicher Weise wie ecm-eingebettete Organoide verursacht.

Das Protokoll für die Etablierung von intestinalen Monolayer-Kulturen führt innerhalb von 7 Tagen nach der Aussaat zu einer konfluenten Monolayer-Kultur und die Kultur erreicht oft innerhalb von nur 2-3 Tagen einen Zusammenfluss. Eine der wichtigsten Determinanten des Erfolgs ist die Anzahl und Qualität der Zellen, die zur Aussaat der Monoschicht verwendet werden. Abbildung 3A, Left Panel zeigt ein Beispiel für eine ideale Aussaatdichte von etwa 150.000 Zellen in einem 6,5 mm Zellkulturmembraneinsatz. Diese Zahl ist nicht festgelegt und kann je nach Spender und Qualität der Quellorganoidkultur sehr variabel sein. Daher sollte die Zellnummer basierend auf diesen Variablen optimiert werden. Wenn die Aussaatdichte zu niedrig oder von schlechter Qualität ist (Abbildung 3A, Rechtes Panel), sind möglicherweise nicht genügend Aufsätze vorhanden, um eine konfluente Monolayer-Kultur zu bilden.

Sobald die Monoschicht eingerichtet ist (Abbildung 3B), bilden die Zellen Tight Junctions, wodurch ein Kopfsteinpflaster-Aussehen entsteht (Abbildung 3B, Linker Bereich). Wenn sie keine konfluente Monoschicht bilden (Abbildung 3B, Rechtes Panel), ist das Aussehen der Monoschicht oft "lückenhaft", mit Regionen von guter Qualität Zellbindung, aber mit größeren Lücken zwischen diesen Regionen. Diese Kulturen stellen keine funktionelle Barriere zwischen den basalen und apikalen Kompartimenten dar und sind für die beschriebenen Assays nicht geeignet. Eine konfluente Monoschicht richtet ihren VILLIN-haltigen Bürstenrand auf die apikale Seite des Epithels aus, wobei ihr Kern zum basolateralen Pol der Zelle hin positioniert ist (Abbildung 4B). Zwischen den Zellen bilden sich interzelluläre Verbindungen, die aus Multiproteinkomplexen, einschließlich ZO-1, bestehen (Abbildung 4B). Ihre Anwesenheit ist der Schlüssel zur Bereitstellung der Barrierefunktion der Epithelkultur.

Einmal konfluent, induziert der Übergang zu einer ALI-Kultur eine weitere Differenzierung der Kultur (Abbildung 3C). Kleine, runde Speiseblechzellen erscheinen und die Monoschicht selbst nimmt ein gefalteteres Aussehen an. Obwohl Speisebleszellen im Epithel der untergetauchten Kultur vorhanden sind (Abbildung 4A), sind sie nach der ALI-Differenzierung prominenter. Speiseblechzellen, die im Epithel vorhanden sind, sezernieren Schleim, was zu einem verschwommenen Aussehen über dem Epithel führt. Die Speiseblezellen und der sezernierte Schleim können durch Färbung für das sezernierte Mucinprotein MUC2 (Abbildung 4A, C und D) sichtbar gemacht werden und die Zunahme der Speiseblezellpopulation kann durch eine Zunahme der MUC2-Expression gemessen werden (Ergänzende Abbildung 3A). Es ist nicht notwendig, diese gelartige Schleimschicht zu entfernen, und sie haftet an der Oberfläche des Epithels und bleibt nach wiederholten Wäschen bestehen. Wenn eine Entfernung erforderlich ist, entfernt das Waschen der Kultur mit einer mukolytischen Verbindung wie 10 mM N-Acetylcystein oder 50 μg / ml DTT überschüssigen Schleim. Neben der Zunahme der Speiseblezellpopulation erhöht die ALI-Schnittstelle auch das Vorhandensein von enteroendokrinen Zellen (wie durch CHGA-Expression angezeigt) (Ergänzende Abbildung 3B) und reifen Enterozyten (wie durch KRT20-Expression angezeigt) (Ergänzende Abbildung 3C).

Abbildung 1: Stadien der apikal-out intestinalen Organoiderzeugung. (A) Repräsentative Bilder einer Kuppel mit Organoiden der gewünschten Größe an Tag 4 (Linkes Panel, Maßstabsleiste = 500 μm). Organoide sind dünnwandig, mit einem offenen Leuchtfach (Rechtes Panel, Maßstabsleiste = 100 μm). (B) Repräsentatives Bild einer Vertiefung mit umfangreicher Aggregation nach 3 Tagen in Suspension (linkes Panel, Maßstabsleiste = 200 μm). Abbildung von Klumpenfragmenten direkt nach dem Scheren (Rechtes Panel, Maßstabsleiste = 200 μm). (C) Repräsentatives Bild von Darmorganoiden in der Kuppel am Tag 7. Organoide zeigen ein expandiertes Lumen mit der Bildung kleiner Knospen auf der basolateralen Seite des Epithels (linke 20-fache Vergrößerung, rechte 100-fache Vergrößerung des markierten Bereichs, Maßstabsbalken = 200 μm). (D) Repräsentatives Bild von Darmorganoiden nach ECM-Entfernung und anschließender Suspensionskultur für 5 Tage. Die Organoide erhalten eine dichte Morphologie mit einem verdickten Epithel und setzen ihre apikale Seite dem Medium aus. (Links 20-fache Vergrößerung, rechts 100-fache Vergrößerung des markierten Bereichs, Maßstabsbalken = 200 μm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Immunfluoreszierende Färbung für Zellpolaritätsmarker in Darmorganoiden. Apikal-out (A, B) und apikal-in (C, D) orientierte Darmorganoide wurden mit apikalen Markern ZO-1 und VILLIN und mit Epithelmarker E-CADHERIN (rot) gefärbt. DAPI (blau) wurde verwendet, um Kerne zu visualisieren. Linke Felder zeigen Bilder, die mit 25-facher Vergrößerung aufgenommen wurden, und rechte Felder zeigen Bilder verschiedener Organoide mit 63-facher Vergrößerung (nur Panel C zeigt die 25-fache und 63-fache Vergrößerung desselben Organoids an). (A) Apikale Darmorganoide, die mit VILLIN (grün) und E-CADHERIN (rot) gefärbt sind, weisen auf die Exposition der apikalen Seite gegenüber dem Medium hin. (B) Apikale Darmorganoide, die mit ZO-1 (grün) und E-CADHERIN (rot) gefärbt sind, zeigen das Vorhandensein von Tight Junctions und eine Umkehrung der apikobasalen Polarität. (C) Matrigel-eingebettetes Darmorganoid, gefärbt mit VILLIN (grün) und E-CADHERIN (rot), die die apikale Seite zum Organoidlumen hin zeigt. (D) Matrigel-eingebettete Darmorganoide, die mit ZO-1 (grün) und E-CADHERIN (rot) gefärbt sind, was auf das Vorhandensein apikaler Tight Junctions gegenüber dem Lumen des Organoids hinweist. (Maßstabsleiste = 100 μm). Organoide wurden durch Immunfluoreszenz gefärbt und mit zuvor veröffentlichten Protokollen^{24,25 abgebildet.} Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Etablierung intestinaler Monolayerkulturen. (A) Repräsentatives Bild von 3D-Organoiden nach Behandlung mit 0,05% Trypsin-EDTA. Organoide werden zu einzelnen Zellen oder kleinen Zellklumpen dissoziiert, um die Aussaat von Monolayer-Kulturen vorzubereiten. Left Panel: Beispiel für eine optimale Aussaatdichte für eine Monolayer-Kultur, ca. 150.000 Zellen pro 100 μL auf einem 6,5 mm Zellkulturmembraneinsatz. Rechtes Panel: Beispiel für eine suboptimale Aussaatdichte bei <50.000 Zellen pro 100 μL auf einem 6,5 mm Zellkulturmembraneinsatz. (B) Repräsentatives Hellfeldbild einer untergetauchten Monoschichtkultur. Linke Platte: 100% konfluente Schicht mit dem charakteristischen Kopfsteinpflaster-Aussehen. Rechte Platte: ca. 50% konfluente Monoschicht. Lücken in der Monoschicht (gekennzeichnet durch gestrichelte Linie) schließen sich im Laufe der Zeit aufgrund der fortgesetzten Proliferation der Darmstammzellen. (C) Repräsentatives Hellfeldbild einer differenzierten ALI-Kultur nach 7 Tagen. (Maßstabsleiste = 200 μm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Immunfluoreszierende Färbung für differenzierte Zellmarker in Monolayerkulturen. (A) Z-Stack-Bild der immunfluoreszierenden Färbung einer untergetauchten Monolayer-Kultur für das Mucinprotein MUC2, das das Vorhandensein von Kelchzellen innerhalb der Monolayer-Kultur anzeigt (grün = MUC2, blau = DAPI). (B) Z-Stack-Bild der immunfluoreszierenden Färbung einer untergetauchten Monoschicht. Die VILLIN-Färbung (grün) entlang des apikalen Endes des Epithels zeigt das Vorhandensein eines Pinselrandes und die ZO-1-Färbung (rot) das Vorhandensein von Tight Junctions zwischen den Zellen an (blau = DAPI). (C) Z-Stack-Bild der immunfluoreszierenden Färbung einer ALI-differenzierten Monoschichtkultur für das Mucinprotein MUC2, das auf das Vorhandensein einer signifikant größeren Anzahl von Kelchzellen innerhalb der ALI-Monoschichtkultur hinweist (grün = MUC2, blau = DAPI). (D) Kryosektion der ALI-differenzierten Monolayer-Kultur, gefärbt auf das Vorhandensein von MUC2 (grün) und E-CADHERIN (rot), was auf das Vorhandensein von Speiseblezellen im Epithel und die Sekretion von Schleim entlang der apikalen Seite der Monolayer-Kultur hinweist. (Maßstabsleiste = 200 μm). Monoschichtkulturen wurden durch Immunfluoreszenz gefärbt und mit zuvor veröffentlichten Protokollen^{26,27 abgebildet.} Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Spektrum der Phänotypen des apikal-out-Darmorganoids in Kultursuspension. (A,B,C) Zusätzliche repräsentative Bilder von intestinalen Organoidmorphologien, die 5 Tage nach der ENTFERNUNG von ECM in Suspension gehalten wurden. Die organoide Polarität hat sich umgekehrt. Die Organoide sind mit einem verdickten Epithel dichter geworden und die apikale Seite der Organoide ist nach außen gerichtet. Organoide können eine Vielzahl von Morphologien aufweisen: länglich (A), zystische (B) und unregelmäßige (C). (Maßstabsleiste = 100 μm). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Intestinale Organoide können die Polarität in Gegenwart von Rest-Basalmembranmatrixmedium in Suspensionskulturen nicht invertieren. (A) Repräsentatives Bild einer unvollständigen ECM-Entfernung und des Versagens, die Polarität der Organoide umzukehren. Matrigelreste sind um die Organoide herum vorhanden und tragen zur Aufrechterhaltung der epithelpolaritätsorientierten Apikal-In bei. Organoide zeigen eine zystische Morphologie mit einem dünnen Epithel, das das Lumen umgibt (Skalenbalken = 200 μm). (B) Repräsentatives Bild eines nicht invertierten Organoids, das unter Suspensionskulturbedingungen gefunden wurde. Kerne (blau = DAPI) und E-CADHERIN (rot) sind auf der basolateralen Seite positioniert, ZO-1 (grün) wird auf der apikalen Seite exprimiert, die dem Lumen des Organoids zugewandt ist. (Maßstabsleiste = 100 μm). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Genexpression differenzierter Zellmarker in Monolayerkulturen. (A,B,C) Expression von MUC2, CHGAund KRT20 in untergetauchter und ALI-differenzierter Monoschichtkultur, die im intestinalen Organoid-Differenzierungsmedium erzeugt wird, relativ zu einer 3D-Organoidkultur, die mit einem über qPCR etablierten intestinalen Organoid-Expansionsmedium gezüchtet wurde. Die Etablierung einer untergetauchten Monoschichtkultur erhöht die Expression jedes differenzierten Zellmarkers; Die Differenzierung als ALI-Kultur erhöht jedoch den Ausdruck jedes Markers exponentiell. Fehlerbalken = +/- SEM. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

MONOLAYER CULTUREWARE	ANZAHL DER ZU ERNTEENDEN DARMORGANOIDE (ab 50 μL Dome/pro zu säender Vertiefung)
6,5 mm Transwell-Einsatz	1 - 2 Brunnen
12 mm Transwell Einsatz	3 - 4 Brunnen
6-Well-Platte	6 - 8 Brunnen
24-Well-Platte	3 - 4 Brunnen
96-Well-Platte	1 - 2 Brunnen

Tabelle 1: Anzahl der Vertiefungen von Darmorganoiden, die für verschiedene Kulturwaren geerntet werden sollen

Diskussion

Epithelorganoidmodelle sind zu leistungsstarken Plattformen geworden, die verwendet werden können, um gewebeorganisation, Krankheitsverlauf und Identifizierung von^{Therapeutika 23,28,29}zu modellieren. Die organoide Mikroinjektion hat einen Mehrwert für die Fähigkeit der Organoide, Infektionskrankheiten zu modellieren, da sie die Interaktion von Krankheitserregern mit der apikalen Seite des Wirtsepithels ermöglicht. Jüngste Fortschritte bei Mikroinjektionstechniken haben die Injektionsgeschwindigkeit in Organoiden optimiert und eine Rate von bis zu 90 injizierten Organoiden pro Stunde erreicht. Die Barrierefunktion in injizierten Organoiden blieb erhalten, und die niedrige Sauerstoffkonzentration im Lumen ermöglichte das Überleben von obligatorisch-anaeroben injizierten Bakterien³⁰. Studien haben jedoch das Vorhandensein von Heterogenität in organoiden Populationen innerhalb derselben Vertiefung festgestellt. Diese Unterschiede wurden in Größe und Form^31,Expressionsniveaus von Schlüsselgenen³²sowie Proliferationsraten³³beobachtet. Differentielle Reaktionen innerhalb derselben Organoidpopulation auf Verbindungen wie Forskolin und PGE2 oder auf Choleratoxin wurden ebenfalls beschrieben^28,33. Diese Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit hoher Organoidzahlen in Studien und begrenzen die Verwendung der luminalen Injektion.

Die konventionelle Organoidkultur basiert auf der Verkapselung und Vermehrung von Organoiden in einem Hydrogel. Hydrogele können jedoch Die Diffusionsbeschränkungen darstellen und Konzentrationsgradienten einführen, die die Heterogenität erhöhen können³⁴. Darüber hinaus wurden hohe Variabilitäten dokumentiert, nicht nur zwischen Kulturen und Spendern, sondern auch innerhalb einzelner Versuchsbedingungen. Donorquelle, biochemische Eigenschaften des Hydrogels und intrinsische Heterogenität des Organoids als Kultursystem sind wichtige Faktoren, die die experimentelle Variabilität erhöhen und die Reproduzierbarkeit der in nachgelagerten Anwendungen erzielten Ergebnisse einschränken können. Beide hier beschriebenen Methoden bieten ein einfaches Mittel, um die apikale Seite des Epithels freizulegen, so dass Verbindungen und Krankheitserreger von Interesse modelliert werden können, indem sie direkt dem Kulturmedium hinzugefügt werden. Die Verringerung der Hydrogelnutzung kann die experimentelle Variabilität von technischen Fehlerquellen einschränken.

Die apikalen Intestinalorganoide behalten die Schlüsseleigenschaften des Organoidmodellsystems bei und ihre Skalierbarkeit macht sie im Vergleich zur 2D-Monoschicht für Hochdurchsatz-Assays besser geeignet. Da die Organoide jedoch ihre 3D-Struktur behalten, ist die Zugänglichkeit der Basalseite begrenzt und kann Studien behindern, die den gleichzeitigen Zugang zu beiden Seiten erfordern.

Wir haben gezeigt, dass die Polaritätsinversion von Darmorganoiden auf der effizienten und absoluten Entfernung von ECM beruht und gleichzeitig die intakte Struktur der Organoide erhalten bleibt. Sowohl die Verwendung der Dissoziationslösung zur Entfernung von ECM als auch der antihaftenden Lösung zur Verhinderung der Organoidhaftung an der Kunststoffware trugen dazu bei, die Gesamteffizienz des von Co, J. Y. und Kollegen²²veröffentlichten Protokolls zu verbessern, insbesondere in Bezug auf die Anzahl der apikalen Organoide, die für nachgelagerte Anwendungen hergestellt wurden.

Darüber hinaus haben wir beobachtet, dass unser Protokoll eine effizientere Inversion von Organoiden kleiner als 250 μm unterstützt und die Verwendung größerer Organoide aufgrund der durch Pipettieren verursachten Fragmentierung zu einer reduzierten Organoidproduktion führen kann. Breitbohrende Spitzen, wie sie in der Materialtabelle angegeben sind,können die Verwendung größerer Organoide ermöglichen. Breitbohrspitzen sind jedoch bei der ECM-Dissoziation im Vergleich zu Standardspitzen aufgrund der geringeren aufgebrachten mechanischen Kraft weniger effektiv. Daher kann die Wiederholung der Schritte 1.2.9-1.2.11 erforderlich sein, um bei der Arbeit mit größeren Organoiden eine ausreichende Unterbrechung und vollständige Entfernung aller ECM-Reste zu erreichen.

Organoide in Suspension können mindestens 2 Wochen überleben. Nach dieser Zeit beobachteten wir morphologische Veränderungen und eine erhöhte Anzahl von Zelltod. Das Vorhandensein von proliferierenden Zellen in den apikalen Organoiden²² ermöglicht die Wiederherstellung von apikalen Intestinalorganoidkulturen. Dies kann erreicht werden, indem apikale Organoide zu einzelnen Zellen dissoziiert und mit Intestinal Organoid Expansion Medium in ECM eingebettet werden.

Eine Einschränkung, die häufig in Protokollen zur Beschreibung der Etablierung von Darmorganoiden in Suspensionskulturen auftritt, ist die Erzeugung großer Aggregate. Dies wirkt sich auf mehrere Variablen wie Effizienz, Reproduzierbarkeit der morphologischen Merkmale, Durchlässigkeit für Verbindungen und parakrine Signalisierung aus. Ähnlich wie bei dem von Co, J. Y. und Kollegen veröffentlichten Protokoll bestätigen wir hier, dass nach 3 Tagen in Suspension eine Polaritätsinversion von mindestens 97% aller suspendierten Organoide ohne Scherung erreicht wurde. Im Gegensatz zur Veröffentlichung haben wir jedoch einen mechanischen Dissoziationsschritt eingeführt, um die Bildung großer Aggregate zu reduzieren und die Ausbeute zu erhöhen. Da dieses Verfahren das Epithel der Organoide schädigen kann, haben wir die Inkubationszeit der Organoide um weitere 2 Tage verlängert, um eine vollständige Epithelrückgewinnung zu ermöglichen und qualitativ hochwertige Kulturen für nachgelagerte Anwendungen zu gewährleisten. Die Einführung eines konstanten Rührens mit einem Inkubatorschüttler oder einem Spinnerkolben könnte möglicherweise Fusionsereignisse reduzieren, die Fragmentierung minimieren und die Sauerstoffversorgung erhöhen. Diese alternativen Ansätze können die Kulturen für längere Zeit aufrechterhalten, den Zelltod reduzieren und eine weitere Differenzierung der apikalen Darmorganoide ermöglichen.

Die Etablierung einer organoidabgeleiteten 2D-Monoschicht bietet mehrere Vor- und Nachteile gegenüber den invertierten Polaritätsorganoiden. Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die schnelle Etablierung einer konfluenten Monolayer-Kultur, typischerweise in weniger als 7 Tagen und die Möglichkeit einer langfristigen Wartung der Kulturen über einen längeren Zeitraum (bis zu 10 Wochen). Das Protokoll und die hier verwendeten Medien ermöglichen auch die effiziente Differenzierung einer signifikanten Anzahl von Zellen, die in anderen organoidbasierten Monoschichtkulturen nicht immer^{vorkommen 16}. Die Etablierung einer Monoschicht auf einer Zellkultureinsatzmembran ermöglicht den gleichzeitigen Zugriff auf die apikale und die basolaterale Seite des Epithels, was sie ideal für Studien zur Barriereintegrität und zum Epitheltransport macht. Dieser vereinfachte Zugang macht sie auch zugänglicher für Infektions- und Drogenbehandlungsstudien. Darüber hinaus behalten diese Kulturen viele der für den Spender einzigartigen Merkmale bei und behalten ihre Relevanz für patientenspezifische Studien bei. Die ALI-Kulturmethode erleichtert auch die Differenzierung eines funktionelleren Epithels, das sowohl aus sekretorischen als auch aus absorbierenden Zelltypen besteht, wodurch es repräsentativer für das menschliche Darmepithel wird. Die relative Stabilität dieser Kulturen ermöglicht es auch, sie über einen längeren Zeitraum aufrechtzuerhalten, was die Möglichkeit für Langzeitstudien bietet. Einschränkungen dieses Ansatzes sind jedoch die hohe Anzahl von Zellen, die erforderlich sind, um eine konfluente Monoschicht zu bilden, und die Notwendigkeit, die vollständige Konfluenz aufrechtzuerhalten, um eine funktionelle Trennung zwischen den apikalen und basolateralen Kammern zu haben. Die charakteristische Kryptenarchitektur, die in den 3D-Organoidkulturen modelliert werden kann, geht auch mit der Etablierung einer Monolayer-Kultur verloren. Dennoch machen das experimentell freundliche Format der Kultur und die Leichtigkeit, mit der die apikalen und basolateralen Seiten des Epithels zugänglich sind, es zu einem leistungsfähigen Werkzeug für das Studium der Darmphysiologie.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Adherence Rinsing Solution	STEMCELL Technologies Inc.	7010	For coating cultureware. Referred as anti-adherent solution into the main text.
Conical tubes, 15 mL	STEMCELL Technologies Inc.	38009
Corning Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-Free	Corning	356231	Extracellular matrix (ECM) for maintenance and establishment of organoid lines.
Costar 6.5 mm or 12 mm Transwell inserts	STEMCELL Technologies Inc.	38023/38024	For 2D Monolayer culture.
Costar 24 Well  Flat-Bottom, Tissue culture-treated plate	STEMCELL Technologies Inc.	38017	For maintenance and establishment of organoid lines.
D-PBS (Without Ca++ and Mg++)	STEMCELL Technologies Inc.	37350	For washing
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Millipore Sigma	D2650	Reconstitution of small molecules
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES	STEMCELL Technologies Inc.	36254	For washing
Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR)	STEMCELL Technologies Inc.	7174	For Matrigel removal. Referred as dissociation reagent into the main text.
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	STEMCELL Technologies Inc.	6010	For expansion of organoid lines prior to differentiation. Referred as Intestinal Organoid Expansion Medium into the main text.
IntestiCult Organoid Differentiation Medium (Human)	STEMCELL Technologies Inc.	100-0214	For establishment of monolayers and 3D differentiation. Referred as Intestinal Organoid Differentiation Medium into the main text.
Trypsin-EDTA (0.05%)	STEMCELL Technologies Inc.	7910	For 2D Monolayer establishment.
Y-27632	STEMCELL Technologies Inc.	72302	RHO/ROCK pathway inhibitor, Inhibits ROCK1 and ROCK2. Used for 2D monolayer establishment.
Wide bore tips	Corning	#TF-1005-WB-R-S	Organoids handling