מזעור דימום וריד פורטל לאחר עירוי במהלך השתלת איים תוך-הפטיים בעכברים

Summary

כאן אנו מציגים הליכים כירורגיים מעודנים על ביצוע מוצלח של השתלת איים תוך-ספורטיביים, הליך כירורגי רלוונטי מבחינה קלינית אך מאתגר מבחינה טכנית, בעכברים.

Abstract

למרות שהכבד מתקבל כיום כאתר ההשתלה העיקרי עבור איים אנושיים בהגדרות קליניות, איים מושתלים תחת קפסולת הכליה ברוב מחקרי השתלת האי הפרה-קליני מכרסמים. מודל זה נפוץ כי השתלת אי תוך-הפסטי מורין היא מאתגרת מבחינה טכנית, ואחוז גבוה של עכברים יכול למות מסיבוכים כירורגיים, במיוחד דימום מאתר ההזרקה לאחר ההשתלה. במחקר זה, שני נהלים שיכולים למזער את השכיחות של דימום וריד פורטל לאחר עירוי מוצגים. השיטה הראשונה מיישמת ספוג ג'לטין hemostatic נספג לאתר ההזרקה, והשיטה השנייה כוללת חדירה מחט הזרקת האי דרך רקמת השומן תחילה ולאחר מכן לתוך וריד הפורטל באמצעות רקמת השומן כמחסום פיזי כדי לעצור את הדימום. שתי השיטות יכולות למנוע ביעילות מוות של עכברים כתוצאה מדימום. כל החלק הכבד מראה הפצת איון וראיות של פקקת איון לאחר ההשתלה, תכונה אופיינית להשתלת איים תוך-הפגפיים, הוצגו. פרוטוקולים משופרים אלה לחדד את הליכי השתלת האי התוך-הפגטי ועשויים לסייע למעבדות להקים את ההליך לחקר ההישרדות והתפקוד של האיים בהגדרות פרה-קליניות.

Introduction

השתלת איים תוך-ספורטיביים (IIT) דרך וריד הפורטל היא השיטה הנפוצה ביותר להשתלת איון אנושית בהגדרות קליניות. מודל IIT העכבר מציע הזדמנות נהדרת ללמוד השתלת איון ולבדוק גישות התערבות מבטיחות שיכולות לשפר את היעילות של השתלת ^איון1. IIT תואר לראשונה בשנות השבעים ושימש מספר קבוצות ^1,2,3,4,5. זה חזר לפופולריות לאחר פריצת הדרך בהשתלת האי האנושי בשנת 20006,7. עם זאת, רוב מחקרי השתלת האיון השתמשו בקפסולת הכליה כאתר מועדף להשתלת אי ניסיוני בשל הצלחתו הקלה. להיפך, IIT מאתגר יותר מבחינה טכנית ומשמש פחות למחקרי השתלת ^איון8,9. שלא כמו IIT, עם זאת, איונים המושתלים תחת כמוסת הכליה אינם סובלים מהתגובה הדלקתית המתווכת בדם המיידית המאופיינת בפקקת, דלקת ואיסכמיה של רקמת הכבד, ולכן יש להם תפקוד טוב יותר מאשר איים המושתלים בכבד. מודל קפסולה הכליה, אם כן, לא יכול לחקות באופן מלא את הלחצים נתקלים על ידי איים בהשתלת אי האדם10,11,12.

אחד הסיבוכים העיקריים של IIT בעכברים הוא דימום מאתר ההזרקה לאחר ההשתלה, אשר יכול לגרום 10-30% של תמותה בקרב זני עכבר ^שונים12. במאמר זה פותחו שתי גישות מעודנות כדי לעצור את הדימום במהירות ובבטחה רבה יותר וכדי להפחית את תמותת העכברים לאחר IIT. הדגמה חזותית של פרטים מעודנים אלה תסייע לחוקרים לזהות את הצעדים העיקריים של הליך מאתגר מבחינה טכנית זה. בנוסף, המיקום של שתלי האי בכבד של המטופל נקבע על ידי בדיקה היסטולוגית של המטוקסילין ואאוזין (H&E) רקמת כבד מוכתמת (סעיף שלם) הנושאת איים מושתלים.

Protocol

כל ההליכים נערכו באישור הוועדות המוסדיות לטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה ובמרכז הרפואי ראלף ה. ג'ונסון בצ'רלסטון.

1. אינדוקציה לסוכרת באמצעות סטרפטוזוטוצין (STZ)

1. הכנת עכברי נמען:
   1. לשקול את כל העכברים בנפרד.
   2. בדוק את רמות הגלוקוז בדם מדגימת דם וריד הזנב באמצעות glucometer.
2. קביעת מינון STZ לשלושה תרחישים שונים:
   1. עבור עכברים עם מחלת כבד שומני להזריק מנה אחת של STZ [40 מ"ג / קילוגרם / יום, הזרקה תוך אפריטונית (i.p.) במשך 5 ימים רצופים.
   2. עבור עכברי NOD-SCID להזריק 125 מ"ג/ק"ג של STZ, זריקה אחת, i.p. לאחר צום לילה.
   3. עבור C57BL / 6 עכברים להזריק 225 מ"ג / קילוגרם של STZ, זריקה אחת, כלומר.
3. חישובים עבור STZ (13.5 מ"ג / מ"ל):
   הערה: חישוב זה מיועד לחמישה עכברי C57BL/6 עם משקולות גוף של 30 גרם:
   1. סה"כ משקולות גוף: 5 עכברים x 30 גרם / עכבר = 150g
   2. STZ דרוש: 150 גרם x 225 מ"ג / 1000 גרם STZ = 33.75 מ"ג
4. הכנת STZ:
   1. לשקול את STZ בעקבות המינון מחושב מראש.
   2. מעבירים את אבקת ה-STZ השקולה לכוס של 10 מ"ל על הקרח.
   3. הוסף 3 מ"ל של פתרון נתרן ציטראט לכוס כדי להמיס את STZ.
   4. מערבבים היטב, מסננים עיקור דרך נקבובית של 0.22 מיקרומטר, ומשתמשים בתמיסת STZ תוך 10 דקות מההכנה.
5. הזרקת STZ:
   1. טען את הכמות הרצויה של פתרון STZ (מספיק לעכבר אחד) למזרק 1 מ"ל.
   2. בצע הזרקה תוך-פריטונית ברביע הימני התחתון של בטן העכבר.
   3. שים לב לעכברים במשך 5 דקות לאחר ההזרקה ולבדוק אם יש סימנים של אי נוחות במהלך תקופה זו של זמן לפני לשים אותם בחזרה לכלובים.
   4. ניטור רמת הגלוקוז בדם מדגימת דם וריד הזנב באמצעות glucometer מדי יום לאחר הזרקת STZ.
      הערה: בניסוי זה, עכברים נחשבים לחולי סוכרת כאשר גלוקוז בדם שאינו בצום הוא > 350 מ"ג / ד"ל במשך יומיים רצופים.

2. הכנת איון

הערה: איים אנושיים היו מתורבתים במדיה CMRL-1066 בתוספת סרום בקר עוברי 10% (FBS), ו 1% פניצילין / סטרפטומיצין (P / S) בצפיפות של 10,000 מספר שווה ערך איון (IEQ) לכל צלחת תרבית תא 100 מ"^מ99. איי העכבר היו מתורבתים ב- DMEM עם 10% FBS ו- 1% P / S עם אותה ^{צפיפות13}. זכר NOD-SCID ו C57BL / 7 עכברים בין 6-10 שבועות של גיל הושגו ממקורות מסחריים.

1. נתק איונים מתורבתים ממנת תרבית התא על ידי גירוד עדין.
2. איסוף ידני של מספרים רצויים של איים (למשל, 300-350 איים) באמצעות מזרק 1cc ולשים אותם לתוך צינורות microcentrifuge סטריליים 1.5 מ"ל על קרח.
3. לסובב את הצינור במשך 10 שניות באמצעות microcentrifuge.
4. הסר את supernatant, משאיר קצת נוזל כדי למנוע לאבד את הכדור.
5. Resuspend את הכדור ב 200 μL של HBSS עם 0.5% אלבומין סרום בקר (BSA).
6. שאפו את האיים המחודשים למזרק אינסולין של 0.5 מ"ל.
7. מניחים את המזרק בתנוחה זקופה. תן לאיים לשקוע למשך דקה אחת.
8. לדחוף את המזרק כדי להסיר את כל הבועות, משאיר על 100-150 μL של נוזל המכיל איים.
9. מניחים את ראש המזרק למטה ומקישים בעדינות על צד המזרק כדי לאפשר לאיים להפיץ באופן שווה את כל הנוזל. האיים מוכנים כעת להזרקה.

3. השתלת איון

1. לגרום ולשמור על העכבר תחת הרדמה כללית עם 2% איזופלוריין. בדוק את חוסר רפלקסים דוושה כדי להבטיח הרדמה נכונה של החיה.
2. גילוח והסר את הפרווה באזור הבטן של העכבר.
3. לנהל מנה טרום ניתוחית אחת של Buprenorphine (0.1 מ"ג / קילוגרם i.p.p.).
4. לחטא את האזור הניתוחי עם שלושה מגבונים לסירוגין של 2% יוד ו 75% אלכוהול.
5. בצע לפרוסטומיה עם מספריים מיקרו כדי ליצור חתך 1-1.5 ס"מ.
6. פתח את חלל הצפק עם מפסק. עקוב אחר שיטה A או שיטה ב' כמפורט להלן.

4. שיטה A: (להפסיק לדמם עם קצף ג'ל, איור 1A)14,15,16

1. הכנת עכבר
   1. מניחים גזה סטרילית סביב החתך.
   2. בעדינות לשלוף את המעי באמצעות מלקחיים ולשמור אותו על הגזה.
   3. זהה את וריד הפורטל לפי מיקומו וחשוף אותו היטב.
   4. לכסות את המעי עם גזה רטובה מלוחה חמה במהלך כל הניתוח.
2. הכנס את מחט מזרק האינסולין שנטענה מראש דרך וריד הפורטל ליד התריסריון (איור 1B). לשם כך, החזק את המחט עם החור (משופע) פונה כלפי מטה ומקם את זווית משטח הפתיחה במקביל לקיר וריד הפורטל לפני חדירה דרך הקיר.
   1. משוך את הבוכנה כדי לצייר קצת דם (20-50 μL) לתוך המזרק כדי לערבב את האיים הראשון.
   2. החדירו את האיים לווריד השער באיטיות תוך משיכה חוזרת ודחיפת הצלילה.
   3. מניחים חתיכת קצף ג'ל (כ 0.5 ס"מ x 0.5 ס"מ בגודל) כדי לכסות את אתר ההזרקה.
   4. לחץ על קצף הג'ל כלפי מטה עם קצה כותנה תוך כדי משיכת המחט מווריד הפורטל.
   5. ממשיכים ללחוץ על הג'ל במשך כ -2 דקות כדי לאשר שאין דימום פעיל.
   6. מגלגלים את קצה הכותנה מעל ומחוץ לקצף הג'ל כדי לוודא שקצף הג'ל מכסה היטב את וריד הפורטל.

5. שיטה ב': (להפסיק לדמם עם כרית שומן, איור 1C)¹⁷

1. לחשוף את וריד הפורטל ביסודיות.
   1. השתמש בשני קצות כותנה כדי להחזיק את וריד הפורטל החשוף משני הצדדים השמאליים והימניים.
   2. זהה את כרית רקמת השומן בין התריסריון לווריד הפורטל.
   3. יש לחדור דרך כרית השומן לפני החדרת המחט לווריד הפורטל (איור 1D).
   4. להחדיר את האיים, בעקבות ההליך הדומה שתואר לעיל בחלקים 4.2.1 ו 4.2.2 של שיטה A.
   5. מוציאים את המחט תוך כדי לחיצה על השומן עם קצה כותנה.
   6. ממשיכים ללחוץ על כרית השומן במשך 1 דקות לאחר הסרת המחט.
2. לאחר אישור כי אין דימום מווריד הפורטל, להחזיר בעדינות את המעי לחלל הצפק במיקומו המקורי.
3. יש להשאיר 0.5 מ"ל של תמיסת מלח חמה (36-37 מעלות צלזיוס) בחלל הבטן לפני הסגירה.
   הערה: תמיסת מלח חמה מקלה על תנועת המעי לאחר הניתוח והתאוששות ומונעת נמק המעי.
4. סגור את שכבת השריר עם תפר 5-0.
5. סגור את שכבת העור עם תפר 4-0.
6. מניחים את העכבר בכלוב נקי על כרית חימום עד התאושש לחלוטין מהרדמה.
7. המשך לספק משכך כאבים (למשל, buprenorphine 0.1 מ"ג / קילוגרם i.p.) כל 12 שעות וחום משלים עבור 48 שעות לאחר הניתוח.
   הערה: הליך ההשתלה באי לוקח בערך 15-20 דקות כדי להשלים.

6. כתמי H&E וצילום של חלק כבד שלם

1. זלוף כבד
   1. שים את העכבר תחת הרדמה כמתואר לעיל בחלק 3.1.
   2. בזהירות לחשוף את וריד הפורטל ולחתוך את הווריד התחתון.
   3. באופן ידני perfuse הכבד באמצעות 20 מ"ל של 10% paraformaldehyde דרך וריד הפורטל במשך כ 5 דקות, באמצעות מזרק 20 מ"ל עם מחט ^25G18.
      הערה: זלוף הכבד יכול להסיר דם מרקמת הכבד ולשפר את קיבוע הכבד מבלי להפריע להשתלות האי.
   4. לנתח את הכבד כולו perfused מאיברים אחרים.
   5. תקן את רקמת הכבד המופקרת ב 10% paraformaldehyde במשך 24 שעות.
   6. הטמע את הרקמה בפרפין.
   7. חותכים מקטעי רקמות בעובי 5 מיקרומטר כל אחד ומניחים אותם על מגלשת זכוכית להכתמה.
   8. בצע הכתמת H&E, אינסולין, פיברין ופולימורפונוקלאר נויטרופיל (PMN) בשיטות ^{סטנדרטיות15,16}.
   9. סרוק את כל החלק של הכבד תחת מיקרוסקופ.

תוצאות

ביצענו השתלות איים סינגניים וקסנוגניים דרך וריד הפורטל. פונקציית השתלת האיון נצפתה באופן תלוי במינון בשני המודלים להשתלת איון. במודל השתלת האי הסינגניים באמצעות עכברי C57BL/6, השתלה של 250 איים הובילה לנורמוגליקמיה חולפת לפני שהעכברים חזרו להיפרגליקמיה. עכברים שקיבלו 500 איים הגיעו והחזיקו נו...

Discussion

במחקר זה הוכחו שני הליכים משופרים שיכולים למנוע דימום ועשויים להפחית את תמותת העכבר במהלך IIT של העכבר. מחקר זה מאפשר לחוקרים לדמיין את מודל השתלת האיים הייחודי בחקר התגובה הדלקתית המתווכת בדם מיידי לאחר ההשתלה. מודל IIT הוא מודל ייחודי לחקר הישרדות תאי איון ופגיעות איסכמיות בכבד בתגובה להש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral buffered formalin v/v	Fisher Scientific	23426796
1 mL Syringe with needle	AHS	AH01T
20 mL Syringe	BD	301031
25G x 5/8" hypodermic needles	BD	305122
Alcohol prep pads, sterile	Fisher Scientific	22-363-750
Animal Anesthesia system	VetEquip, Inc.	901806
Buprenorphine hydrochloride, injection	Par Sterile Products, LLC	NDC 42023-179-05
Centrifuge tubes, 15 mL	Fisher Scientific	0553859A
CMRL-1066	Corning	15110CV
DMEM	Corning	10013CV
Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade	Fisher Scientific	BP2818500
Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5882
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	35011CV
FreeStyle  Glucose meter	Abbott	Lite
FreeStyle Blood Glucose test strips	Abbott	Lite
Gelfoam (absorbable gelatin sponge, USP)	Pharmacia & Upjohn Company	34201
Graefe forceps 4” extra delicate tip	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5136
Heated pad	Amazon	B07HMKMBKM
Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25”	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-7850
Insulin syringe with 27-gauge needle	BD	879588
Iodine prep pads	Fisher Scientific	19-027048
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Penicillin/streptomycin (P/S)	HyClone	SV30010
Polypropylene Suture 4-0	Med-Vet International	MV-8683
Polypropylene Suture 5-0	Med-Vet International	MV-8661
Sodium chloride, 0.9% intravenous solution	VWR	2B1322Q
Streptozocin (STZ)	Sigma	S0130
Surgical drape, sterile	Med-Vet International	DR1826
Tissue Cassette	Fisher Scientific	22-272416