Минимизация постинфузионного портального венозного кровотечения во время внутрипеченочной трансплантации островков у мышей

Резюме

Здесь мы представляем усовершенствованные хирургические процедуры по успешному выполнению внутрипортальной трансплантации островков, клинически значимой, но технически сложной хирургической процедуры, у мышей.

Аннотация

Хотя печень в настоящее время считается основным местом трансплантации островков человека в клинических условиях, островки пересаживаются под капсулу почки в большинстве доклинических исследований трансплантации островков грызунов. Эта модель обычно используется, потому что трансплантация внутрипеченочных островков мышей технически сложна, и высокий процент мышей может умереть от хирургических осложнений, особенно кровотечения из места инъекции после трансплантации. В этом исследовании демонстрируются две процедуры, которые могут свести к минимуму частоту постинфузионного портального венозного кровотечения. Первый метод применяет рассасывающуюся гемостатическую желатиновую губку к месту инъекции, а второй метод включает в себя проникновение иглы для инъекции островка сначала через жировую ткань, а затем в воротную вену, используя жировую ткань в качестве физического барьера для остановки кровотечения. Оба метода могут эффективно предотвратить смерть мыши, вызванную кровотечением. Был представлен весь участок печени, показывающий распределение островков и доказательства тромбоза островков после трансплантации, типичной особенности для внутрипеченочной трансплантации островков. Эти улучшенные протоколы совершенствуют процедуры внутрипеченочной трансплантации островков и могут помочь лабораториям установить процедуру для изучения выживаемости и функции островков в доклинических условиях.

Введение

Внутрипортальная трансплантация островков (ИИТ) через воротную вену является наиболее часто используемым методом трансплантации островков человека в клинических условиях. Мышиная модель ИИТ предлагает прекрасную возможность изучить трансплантацию островков и протестировать перспективные интервенционные подходы, которые могут повысить эффективность трансплантации ^{островков1}. ИИТ был впервые описан в 1970-х годах и использовался несколькими группами1,2,3,4,5. Он вновь обрел популярность после прорыва в трансплантации островков человека в 20006 ^году7. Тем не менее, большинство исследований по пересадке островков использовали капсулу почки в качестве предпочтительного места для экспериментальной трансплантации островков из-за ее легкого успеха. Напротив, ИИТ является более технически сложным и реже используется для исследований трансплантации ^{островков8,9}. Однако, в отличие от ИИТ, островки, пересаженные под почечную капсулу, не страдают от немедленной опосредованной кровью воспалительной реакции, характеризующейся тромбозом, воспалением и ишемией печеночной ткани, и, таким образом, имеют лучшую функцию, чем островки, пересаженные в печень. Таким образом, модель капсулы почки может не полностью имитировать стрессы, с которыми сталкиваются островки при трансплантации островков человека10,11,12.

Одним из основных осложнений ИИТ у мышей является кровотечение из места инъекции после трансплантации, которое может вызвать 10-30% смертности среди различных штаммов ^мышей12. В этой статье были разработаны два усовершенствованных подхода для более быстрой и безопасной остановки кровотечения и снижения смертности мышей после ИИТ. Визуальная демонстрация этих уточненных деталей поможет исследователям определить ключевые этапы этой технически сложной процедуры. Кроме того, расположение островковых трансплантатов в печени реципиента было определено гистологическим исследованием окрашенной гематоксилином и эозином (H&E) ткани печени (целый срез), несущей трансплантированные островки.

протокол

Все процедуры были проведены с одобрения институциональных комитетов по уходу за животными и их использованию в Медицинском университете Южной Каролины и Медицинском центре Ральфа Х. Джонсона в Чарльстоне.

1. Индукция диабета с использованием стрептозотоцина (СТЗ)

1. Препарат для мышей-реципиентов:
   1. Взвешивайте всех мышей по отдельности.
   2. Проверьте уровень глюкозы в крови из образца крови хвостовой вены с помощью глюкометра.
2. Определение дозы СТЗ для трех различных сценариев:
   1. Мышам с жировой болезнью печени вводят одну дозу СТЗ [40 мг/кг/сут, внутрибрюшинная (в.п.) инъекция] в течение 5 дней подряд.
   2. Для мышей NOD-SCID вводят 125 мг/кг STZ, однократную инъекцию, т.п. после ночного голодания.
   3. Для мышей C57BL/6 вводят 225 мг/кг СТЗ, однократная инъекция, т.п.
3. Расчеты для СТЗ (13,5 мг/мл):
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот расчет предназначен для пяти мышей C57BL/6 с массой тела 30 г:
   1. Общая масса тела: 5 мышей x 30 г/мышь = 150 г
   2. Требуется STZ: 150 г x 225 мг/1000 г STZ = 33,75 мг
4. Подготовка к СТЗ:
   1. Взвесьте СТЗ после заранее рассчитанной дозы.
   2. Переложите взвешенный порошок STZ в стакан емкостью 10 мл на льду.
   3. Добавьте 3 мл раствора цитрата натрия в стакан для растворения СТЗ.
   4. Хорошо перемешать, процедить стерилизовать через поры 0,22 мкм и использовать раствор СТЗ в течение 10 мин после приготовления.
5. СТЗ инъекции:
   1. Загрузите нужное количество раствора STZ (достаточное для одной мыши) в шприц объемом 1 мл.
   2. Выполняют внутрибрюшинную инъекцию в нижний правый квадрант живота мыши.
   3. Понаблюдайте за мышами в течение 5 минут после инъекции и проверьте наличие признаков дискомфорта в течение этого периода времени, прежде чем помещать их обратно в клетки.
   4. Контролируйте уровень глюкозы в крови из образца крови хвостовой вены с помощью глюкометра ежедневно после инъекции STZ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте мыши считаются диабетиками, когда уровень глюкозы в крови без голодания составляет > 350 мг / дл в течение двух дней подряд.

2. Подготовка островков

ПРИМЕЧАНИЕ: Человеческие островки культивировали в среде CMRL-1066, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллином/стрептомицином (P/S) при плотности 10 000 островковых эквивалентов (IEQ) на 100 мм чашку для культивирования ^{клеток9}. Мышиные островки культивировали в DMEM с 10% FBS и 1% P/S с одинаковой ^{плотностью13}. Самцы мышей NOD-SCID и C57BL/7 в возрасте 6-10 недель были получены из коммерческих источников.

1. Отделите культивируемые островки от чашки для клеточной культуры путем мягкого расчесывания.
2. Вручную выберите желаемое количество островков (например, 300-350 островков) с помощью шприца объемом 1 куб. см и поместите их в стерильные микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл на льду.
3. Вращайте трубку в течение 10 секунд с помощью микроцентрифуги.
4. Удалите супернатант, оставив немного жидкости, чтобы избежать потери гранулы.
5. Повторно суспендировать гранулы в 200 мкл HBSS с 0,5% бычьим сывороточным альбумином (BSA).
6. Аспирировать повторно суспендированные островки в инсулиновый шприц объемом 0,5 мл.
7. Поместите шприц в вертикальное положение. Дайте островкам опуститься вниз на 1 мин.
8. Надавите на шприц, чтобы удалить все пузырьки, оставив около 100-150 мкл жидкости, содержащей островки.
9. Положите головку шприца вниз и осторожно постучите по боковой стороне шприца, чтобы островки равномерно распределились по всей жидкости. Островки теперь готовы к инъекции.

3. Трансплантация островков

1. Индуцировать и поддерживать мышь под общим наркозом с 2% изофлураном. Проверьте на отсутствие педальных рефлексов, чтобы обеспечить надлежащую анестезию животного.
2. Сбрить и удалить шерсть в области брюшка мыши.
3. Вводят однократную предоперационную дозу Бупренорфина (0,1 мг/кг в.п.).
4. Продезинфицируйте хирургическую область тремя чередующимися салфетками 2% йода и 75% спирта.
5. Выполните лапаротомию микроножами для создания разреза 1-1,5 см.
6. Откройте брюшинную полость с помощью втягивающего устройства. Затем используйте либо метод A, либо метод B, как описано ниже.

4. Метод А: (остановить кровотечение с помощью гелевой пены, рисунок 1А)14,15,16

1. Подготовка мыши
   1. Поместите стерильную марлю вокруг разреза.
   2. Аккуратно вытяните кишечник с помощью щипцов и держите его на марле.
   3. Определите вену портала по ее расположению и хорошо ее обнажите.
   4. Накрывайте кишечник теплой солено-влажной марлей в течение всей операции.
2. Ввести островок предварительно загруженной инсулиновой шприцевой иглой через воротную вену возле двенадцатиперстной кишки (рисунок 1В). Для этого держите иглу с отверстием (скосом) лицом вниз и расположите угол поверхности отверстия параллельно стенке воротной жилы, прежде чем проникать через стену.
   1. Потяните поршень, чтобы втянуть немного крови (20-50 мкл) в шприц, чтобы сначала перемешать островки.
   2. Медленно вливайте островки в воротную вену, многократно вытягивая и толкая погружение.
   3. Поместите кусочек гелевой пены (размером около 0,5 см х 0,5 см), чтобы покрыть место инъекции.
   4. Прижмите гелевую пену ватным наконечником, вытащив иглу из воротной вены.
   5. Продолжайте нажимать на гель в течение примерно 2 минут, чтобы подтвердить, что нет активного кровотечения.
   6. Опрокидывайте хлопчатобумажный опрокидывание над и подальше от гелевой пены, чтобы убедиться, что гелевая пена хорошо покрывает воротную вену.

5. Метод Б: (остановить кровотечение с помощью жировой прокладки, рисунок 1С)¹⁷

1. Тщательно обнажите воротную вену.
   1. Используйте два хлопковых наконечника, чтобы удерживать открытую воротную вену как с левой, так и с правой стороны.
   2. Определите подушечку жировой ткани между двенадцатиперстной кишкой и воротной веной.
   3. Проникните через жировую прокладку перед введением иглы в воротную вену (рисунок 1D).
   4. Вводят островки в соответствии с аналогичной процедурой, описанной выше в частях 4.2.1 и 4.2.2 Метода А.
   5. Вытащите иглу, надавливая на жир ватным наконечником.
   6. Продолжайте надавливать на жировую подушку в течение 1 мин после удаления иглы.
2. Подтвердив, что кровотечения из воротной вены нет, осторожно верните кишечник в брюшинную полость в исходное положение.
3. Оставьте 0,5 мл теплого физиологического раствора (36-37 °C) в брюшной полости перед закрытием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Теплый физиологический раствор облегчает послеоперационное движение кишечника и восстановление и предотвращает некроз кишечника.
4. Закройте мышечный слой швом 5-0.
5. Закройте слой кожи швом 4-0.
6. Поместите мышь в чистую клетку на грелку до полного восстановления после анестезии.
7. Продолжайте принимать анальгетик (например, бупренорфин 0,1 мг/кг в.п.) каждые 12 ч и дополнительное тепло в течение 48 ч после операции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура трансплантации островков занимает примерно 15-20 минут.

6. Окрашивание H&E и фотографирование всего отдела печени

1. Перфузия печени
   1. Поместите мышь под наркоз, как описано выше в части 3.1.
   2. Осторожно обнажите воротную вену и срежьте нижнюю полую вену.
   3. Вручную перфузируйте печень, используя 20 мл 10% параформальдегида через воротную вену в течение примерно 5 минут, используя шприц 20 мл с иглой ^25G18.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перфузия печени может удалить кровь из ткани печени и улучшить фиксацию печени, не нарушая островковые трансплантаты.
   4. Рассекайте перфузированную всю печень от других органов.
   5. Фиксируют перфузированную ткань печени в 10% параформальдегиде в течение 24 ч.
   6. Встроить ткань в парафин.
   7. Вырежьте участки ткани толщиной 5 мкм каждый и положите их на стеклянную горку для окрашивания.
   8. Выполняют окрашивание H&E, инсулина, фибрина и полиморфноядерных нейтрофилов (PMN) стандартными ^{методами15,16}.
   9. Сканирование всего участка печени под микроскопом.

Результаты

Мы выполнили сингенную и ксеногенную трансплантацию островков через воротную вену. Функция островкового трансплантата наблюдалась дозозависимым образом в обеих моделях трансплантации островков. В модели трансплантации сингенных островков с использованием мышей C57BL/6 трансплантаци?...

Обсуждение

В этом исследовании были продемонстрированы две улучшенные процедуры, которые могут предотвратить кровотечение и могут снизить смертность мышей во время мышиного ИИТ. Это исследование позволяет ученым визуализировать модель трансплантации островков, которая является уникальной в и...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral buffered formalin v/v	Fisher Scientific	23426796
1 mL Syringe with needle	AHS	AH01T
20 mL Syringe	BD	301031
25G x 5/8" hypodermic needles	BD	305122
Alcohol prep pads, sterile	Fisher Scientific	22-363-750
Animal Anesthesia system	VetEquip, Inc.	901806
Buprenorphine hydrochloride, injection	Par Sterile Products, LLC	NDC 42023-179-05
Centrifuge tubes, 15 mL	Fisher Scientific	0553859A
CMRL-1066	Corning	15110CV
DMEM	Corning	10013CV
Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade	Fisher Scientific	BP2818500
Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5882
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	35011CV
FreeStyle  Glucose meter	Abbott	Lite
FreeStyle Blood Glucose test strips	Abbott	Lite
Gelfoam (absorbable gelatin sponge, USP)	Pharmacia & Upjohn Company	34201
Graefe forceps 4” extra delicate tip	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5136
Heated pad	Amazon	B07HMKMBKM
Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25”	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-7850
Insulin syringe with 27-gauge needle	BD	879588
Iodine prep pads	Fisher Scientific	19-027048
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Penicillin/streptomycin (P/S)	HyClone	SV30010
Polypropylene Suture 4-0	Med-Vet International	MV-8683
Polypropylene Suture 5-0	Med-Vet International	MV-8661
Sodium chloride, 0.9% intravenous solution	VWR	2B1322Q
Streptozocin (STZ)	Sigma	S0130
Surgical drape, sterile	Med-Vet International	DR1826
Tissue Cassette	Fisher Scientific	22-272416