JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, farelerde klinik olarak ilgili ancak teknik olarak zorlayıcı bir cerrahi prosedür olan intraportal adacık transplantasyonunun başarılı bir şekilde gerçekleştirilmesi için rafine cerrahi prosedürler sunulmaktadır.

Özet

Karaciğer günümüzde klinik ortamlarda insan adacıkları için birincil transplantasyon alanı olarak kabul edilmekle birlikte, çoğu kemirgen preklinik adacık transplantasyonu çalışmasında adacıklar böbrek kapsülü altında nakledilmektedir. Bu model yaygın olarak kullanılır, çünkü murin intrahepatik adacık transplantasyonu teknik olarak zordur ve farelerin yüksek bir yüzdesi cerrahi komplikasyonlardan, özellikle de nakil sonrası enjeksiyon bölgesinden kanamadan ölebilir. Bu çalışmada, infüzyon sonrası portal ven kanaması insidansını en aza indirgeyebilecek iki prosedür gösterilmiştir. İlk yöntem, enjeksiyon bölgesine emilebilir hemostatik jelatin sünger uygular ve ikinci yöntem, adacık enjeksiyon iğnesinin önce yağ dokusundan sonra da kanamayı durdurmak için fiziksel bir bariyer olarak yağ dokusunu kullanarak portal venin içine nüfuz etmesini içerir. Her iki yöntem de kanamaya bağlı fare ölümünü etkili bir şekilde önleyebilir. Adacık dağılımını gösteren tüm karaciğer kesiti ve intrahepatik adacık transplantasyonu için tipik bir özellik olan transplantasyon sonrası adacık trombozu bulguları sunuldu. Bu geliştirilmiş protokoller, intrahepatik adacık transplantasyon prosedürlerini hassaslaştırır ve laboratuvarların adacık sağkalımını incelemek ve klinik öncesi ortamlarda işlev görmek için prosedürü oluşturmasına yardımcı olabilir.

Giriş

Portal ven yoluyla intraportal adacık transplantasyonu (IIT), klinik ortamlarda insan adacık transplantasyonu için en sık kullanılan yöntemdir. Fare IIT modeli, adacık transplantasyonunu incelemek ve adacık transplantasyonunun etkinliğini artırabilecek umut verici girişimsel yaklaşımları test etmek için harika bir fırsat sunmaktadır1. IIT ilk olarak 1970'lerde tanımlanmış ve birkaç grup tarafından kullanılmıştır1,2,3,4,5. 20006 yılında insan adacık transplantasyonundaki atılımdan sonra popülerliğini yeniden kazanmıştır,7. Bununla birlikte, çoğu adacık nakli çalışması, kolay başarısı nedeniyle böbrek kapsülünü deneysel adacık nakli için tercih edilen bir yer olarak kullanmıştır. Aksine, IIT teknik olarak daha zordur ve adacık nakli çalışmalarında daha az sıklıkla kullanılmaktadır8,9. Bununla birlikte, IIT'den farklı olarak, böbrek kapsülü altına nakledilen adacıklar, tromboz, inflamasyon ve hepatik doku iskemisi ile karakterize acil kan aracılı enflamatuar reaksiyondan muzdarip değildir ve bu nedenle karaciğere nakledilen adacıklardan daha iyi bir işleve sahiptir. Bu nedenle böbrek kapsül modeli, insan adacık naklinde adacıkların karşılaştığı stresleri tam olarak taklit edemeyebilir10,11,12.

IIT'nin farelerdeki en önemli komplikasyonlarından biri, transplantasyon sonrası enjeksiyon bölgesinden kanamadır ve bu da farklı fare suşları arasında mortalitenin %10-30'una neden olabilir12. Bu yazıda, IIT sonrası kanamayı daha hızlı ve güvenli bir şekilde durdurmak ve fare mortalitesini azaltmak için iki rafine yaklaşım geliştirilmiştir. Bu rafine detayların görsel olarak gösterilmesi, araştırmacıların bu teknik olarak zorlu prosedürün temel adımlarını belirlemelerine yardımcı olacaktır. Ayrıca adacık greftlerinin alıcının karaciğerindeki yeri, nakledilen adacıkları taşıyan Hematoksilin ve Eozin (H&E) boyalı karaciğer dokusunun (tüm kesit) histolojik incelemesi ile belirlendi.

Protokol

Tüm prosedürler, Güney Carolina Tıp Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitelerinin ve Charleston'daki Ralph H Johnson Tıp Merkezi'nin onayı ile gerçekleştirildi.

1. Streptozotosin (STZ) kullanarak diyabet indüksiyonu

  1. Alıcı farelerin hazırlanması:
    1. Tüm fareleri ayrı ayrı tartın.
    2. Bir glukometre kullanarak kuyruk damarı kan örneğinden kan şekeri seviyelerini kontrol edin.
  2. Üç farklı senaryo için STZ doz belirleme:
    1. Yağlı karaciğer hastalığı olan fareler için, art arda 5 gün boyunca bir doz STZ [40 mg / kg / gün, intraperitoneal (i.p.) enjeksiyon] enjekte edin.
    2. NOD-SCID fareleri için 125 mg / kg STZ, tek enjeksiyon, yani gece boyunca aç kaldıktan sonra enjekte edin.
    3. C57BL/6 fareler için 225 mg/kg STZ, tek enjeksiyon, yani enjekte edilir.
  3. STZ (13.5 mg/mL) için hesaplamalar:
    NOT: Bu hesaplama, vücut ağırlıkları 30 g olan beş C57BL/6 fare içindir:
    1. Toplam vücut ağırlığı: 5 fare x 30 g/fare = 150g
    2. STZ gerekli: 150 g x 225 mg/1000g STZ = 33.75 mg
  4. STZ hazırlığı:
    1. Önceden hesaplanan dozu takiben STZ'yi tartın.
    2. Tartılan STZ tozunu buz üzerinde 10 mL'lik bir beherin içine aktarın.
    3. STZ'yi çözmek için beherine 3 mL sodyum sitrat çözeltisi ekleyin.
    4. İyice karıştırın, 0.22-μm'lik bir gözenekten sterilize edin ve STZ çözeltisini hazırlıktan sonraki 10 dakika içinde kullanın.
  5. STZ enjeksiyonu:
    1. İstenilen miktarda STZ çözeltisini (bir fare için yeterli) 1 mL şırıngaya yükleyin.
    2. Fare karnının sağ alt çeyreğinde intraperitoneal enjeksiyon yapın.
    3. Enjeksiyondan sonra 5 dakika boyunca fareleri gözlemleyin ve kafeslere geri koymadan önce bu süre zarfında herhangi bir rahatsızlık belirtisi olup olmadığını kontrol edin.
    4. STZ enjeksiyonundan sonra günlük bir glukometre kullanarak kuyruk damarı kan örneğinden kan şekeri seviyesini izleyin.
      NOT: Bu deneyde, açlık yapmayan kan şekeri art arda iki gün boyunca 350 mg / dL'> edildiğinde fareler diyabetik olarak kabul edilir.

2. Adacık hazırlama

NOT: İnsan adacıkları, CMRL-1066 ortamında, 100 mm hücre kültürü kabı başına 10.000 adacık eşdeğer sayısı (IEQ) yoğunluğunda% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin (P / S) ile desteklenerek kültürlenmiştir9. DMEM'de fare adacıkları %10 FBS ve %1 P/S ile aynı yoğunlukta kültüre alındı13. Ticari kaynaklardan 6-10 haftalık yaşlar arasındaki erkek NOD-SCID ve C57BL/7 fareler elde edildi.

  1. Kültürlü adacıkları hücre kültürü kabından nazik tırmalayarak ayırın.
  2. 1cc'lik bir şırınga kullanarak istenen sayıda adacığı (örneğin, 300-350 adacık) elle seçin ve bunları buz üzerinde steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine koyun.
  3. Mikrosantrifüjü kullanarak tüpü 10 saniye boyunca döndürün.
  4. Peleti kaybetmemek için biraz sıvı bırakarak süpernatanı çıkarın.
  5. Peletin 200 μL HBSS'de %0.5 sığır serum albümini (BSA) ile yeniden askıya alın.
  6. Yeniden askıya alınan adacıkları 0,5 mL'lik bir insülin şırıngasına aspire edin.
  7. Şırıngayı dik konuma getirin. Adacıkların 1 dakika boyunca batmasına izin verin.
  8. Tüm kabarcıkları çıkarmak için şırıngayı itin, yaklaşık 100-150 μL sıvı içeren adacıklar bırakın.
  9. Şırıngayı baş aşağı yerleştirin ve adacıkların sıvı boyunca eşit olarak dağılmasına izin vermek için şırınganın yan tarafına hafifçe dokunun. Adacıklar artık enjeksiyon için hazır.

3. Adacık nakli

  1. Fareyi genel anestezi altında% 2 izofluran ile indükleyin ve koruyun. Hayvanın uygun şekilde anestezi altına alınmasını sağlamak için pedal reflekslerinin eksikliğini kontrol edin.
  2. Farenin karın bölgesindeki kürkü tıraş edin ve çıkarın.
  3. Ameliyat öncesi tek bir Buprenorfin dozu uygulayın (0.1 mg / kg i.p.).
  4. Cerrahi alanı% 2 iyot ve% 75 alkolden oluşan üç alternatif mendil ile dezenfekte edin.
  5. 1-1.5 cm'lik bir kesi oluşturmak için mikro makasla bir laparotomi yapın.
  6. Peritoneal boşluğu bir retraktörle açın. Aşağıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi A veya B yöntemini izleyin.

4. Yöntem A: (jel köpük ile kanamayı durdurun, Şekil 1A)14,15,16

  1. Fare hazırlığı
    1. Kesinin etrafına steril bir gazlı bez yerleştirin.
    2. Forseps kullanarak bağırsağı yavaşça dışarı çekin ve gazlı bez üzerinde tutun.
    3. Portal damarını konumuna göre tanımlayın ve iyi bir şekilde ortaya çıkarın.
    4. Tüm ameliyat boyunca bağırsağı ılık bir salin-ıslak gazlı bezle örtün.
  2. Adacık önceden yüklenmiş insülin şırınga iğnesini duodenumun yakınındaki portal damardan geçirin (Şekil 1B). Bunu yapmak için, iğneyi delik (konik) aşağı bakacak şekilde tutun ve duvardan geçmeden önce açılış yüzeyinin açısını portal damar duvarına paralel olarak konumlandırın.
    1. Önce adacıkları karıştırmak için şırıngaya biraz kan (20-50 μL) çekmek için pistonu çekin.
    2. Dalmayı tekrar tekrar çekip iterken adacıkları portal damara yavaşça aşılayın.
    3. Enjeksiyon bölgesini örtmek için bir parça jel köpük (yaklaşık 0,5 cm x 0,5 cm boyutlarında) yerleştirin.
    4. İğneyi portal damardan çekerken jel köpüğü pamuklu bir uçla bastırın.
    5. Aktif kanama olmadığını doğrulamak için jele yaklaşık 2 dakika basmaya devam edin.
    6. Jel köpüğün portal damarı iyi kapladığından emin olmak için pamuk ucunu jel köpüğün üzerine ve uzağına yuvarlayın.

5. Yöntem B: (yağ yastığı ile kanamayı durdurun, Şekil 1C)17

  1. Portal damarını iyice ortaya çıkarın.
    1. Açıkta kalan portal damarı hem sol hem de sağ taraftan tutmak için iki pamuk ucu kullanın.
    2. Duodenum ve portal ven arasındaki yağ dokusu yastığını tanımlayın.
    3. İğneyi portal damara sokmadan önce yağ yastığına nüfuz edin (Şekil 1D).
    4. Yukarıda Yöntem A'nın 4.2.1 ve 4.2.2 bölümlerinde açıklanan benzer prosedürü izleyerek adacıkları demleyin.
    5. Pamuklu bir uçla yağa bastırırken iğneyi çekin.
    6. İğneyi çıkardıktan sonra yağ yastığına 1 dakika basmaya devam edin.
  2. Portal damardan kanama olmadığını doğruladıktan sonra, bağırsağı yavaşça orijinal pozisyonunda periton boşluğuna geri döndürün.
  3. Kapatmadan önce karın boşluğunda 0,5 mL ılık salin (36-37 ° C) bırakın.
    NOT: Sıcak salin, ameliyat sonrası bağırsak hareketini ve iyileşmesini kolaylaştırır ve bağırsak nekrozunu önler.
  4. Kas tabakasını 5-0 dikişle kapatın.
  5. Cilt tabakasını 4-0 dikişle kapatın.
  6. Fareyi anesteziden tamamen kurtulana kadar bir ısıtma yastığı üzerinde temiz bir kafese yerleştirin.
  7. Her 12 saatte bir analjezik (örneğin, buprenorfin 0.1 mg / kg i.p.) ve ameliyat sonrası 48 saat boyunca ek ısı sağlamaya devam edin.
    NOT: Adacık nakli işleminin tamamlanması yaklaşık 15-20 dakika sürmektedir.

6. H&E boyama ve tüm karaciğer bölümünün fotoğrafı

  1. Karaciğer perfüzyonu
    1. Fareyi yukarıda bölüm 3.1'de açıklandığı gibi anestezi altına alın.
    2. Portal damarı dikkatlice ortaya çıkarın ve inferior vena kavayı kesin.
    3. Portal ven yoluyla 20 mL% 10 paraformaldehit kullanarak karaciğeri yaklaşık 5 dakika boyunca 25G iğneli 20 mL'lik bir şırınga kullanarak manuel olarak perfüze edin18.
      NOT: Karaciğer perfüzyonu, karaciğer dokusundan kanı çıkarabilir ve adacık greftlerini rahatsız etmeden karaciğer fiksasyonunu iyileştirebilir.
    4. Perfüze edilmiş tüm karaciğeri diğer organlardan disseke edin.
    5. Perfüze karaciğer dokusunu 24 saat boyunca% 10 paraformaldehit içinde sabitleyin.
    6. Dokuyu parafine gömün.
    7. Her biri 5 μm kalınlığında doku kesitlerini kesin ve boyama için cam bir slayta koyun.
    8. Standart yöntemleri kullanarak H&E, insülin, fibrin ve polimorfonükleer nötrofil (PMN) boyama işlemini gerçekleştirin15,16.
    9. Tüm karaciğer bölümünü mikroskop altında tarayın.

Sonuçlar

Portal ven üzerinden sinjenik ve ksenojenik adacık nakilleri gerçekleştirdik. Her iki adacık transplantasyon modelinde de adacık greft fonksiyonu doza bağımlı olarak gözlendi. C57BL / 6 fareleri kullanan sinjenik adacık transplantasyonu modelinde, 250 adacığın transplantasyonu, fareler hiperglisemiye dönmeden önce geçici normoglikemiye yol açtı. 500 adacık alan fareler, transplantasyondan sonraki 30 günden fazla normoglisemine ulaştı ve korudu (Şekil 2A). Her iki grup...

Tartışmalar

Bu çalışmada, fare IIT sırasında kanamayı önleyebilen ve fare mortalitesini azaltabilen iki gelişmiş prosedür gösterilmiştir. Bu çalışma, araştırmacıların transplantasyon sonrası anlık kan aracılı enflamatuar yanıtı incelemede benzersiz olan adacık transplantasyon modelini görselleştirmelerini sağlar. IIT modeli, adacık transplantasyonuna yanıt olarak adacık hücresi sağkalımı ve hepatik iskemik yaralanmaları incelemek için ayırt edici bir modeldir19. Burada, ...

Açıklamalar

Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Gazi İşleri Bakanlığı (VA-ORD BLR & D Merit I01BX004536) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü HW'ye # 1R01DK105183, DK120394, DK118529 hibeleri tarafından desteklenmiştir. Dil düzenlemesi için Bay Michael Lee ve Bayan Lindsay Swaby'ye teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
10% Neutral buffered formalin v/vFisher Scientific23426796
1 mL Syringe with needleAHSAH01T
20 mL SyringeBD301031
25G x 5/8" hypodermic needlesBD305122
Alcohol prep pads, sterileFisher Scientific22-363-750
Animal Anesthesia systemVetEquip, Inc.901806
Buprenorphine hydrochloride, injectionPar Sterile Products, LLCNDC 42023-179-05
Centrifuge tubes, 15 mLFisher Scientific0553859A
CMRL-1066Corning15110CV
DMEMCorning10013CV
Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology gradeFisher ScientificBP2818500
Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharpRoboz Surgical Instrument Co.RS-5882
Fetal bovine serum (FBS)Corning35011CV
FreeStyle  Glucose meterAbbottLite
FreeStyle Blood Glucose test stripsAbbottLite
Gelfoam (absorbable gelatin sponge, USP)Pharmacia & Upjohn Company34201
Graefe forceps 4” extra delicate tipRoboz Surgical Instrument Co.RS-5136
Heated padAmazonB07HMKMBKM
Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25”Roboz Surgical Instrument Co.RS-7850
Insulin syringe with 27-gauge needleBD879588
Iodine prep padsFisher Scientific19-027048
IsofluranePiramal Critical CareNDC 66794-017-25
Penicillin/streptomycin (P/S)HyCloneSV30010
Polypropylene Suture 4-0Med-Vet InternationalMV-8683
Polypropylene Suture 5-0Med-Vet InternationalMV-8661
Sodium chloride, 0.9% intravenous solutionVWR2B1322Q
Streptozocin (STZ)SigmaS0130
Surgical drape, sterileMed-Vet InternationalDR1826
Tissue CassetteFisher Scientific22-272416

Referanslar

  1. Pellegrini, S., Cantarelli, E., Sordi, V., Nano, R., Piemonti, L. The state of the art of islet transplantation and cell therapy in type 1 diabetes. Acta Diabetology. 53 (5), 683-691 (2016).
  2. Ballinger, W. F., Lacy, P. E. Transplantation of intact pancreatic islets in rats. Surgery. 72 (2), 175-186 (1972).
  3. Wright, J. R., Hauptfeld, V., Lacy, P. E., et al. Induction of Ia antigen expression on murine islet parenchymal cells does not diminish islet allograft survival. American Journal of Pathology. 134 (2), 237-242 (1989).
  4. Toyofuku, A., et al. Natural killer T-cells participate in rejection of islet allografts in the liver of mice. Diabetes. 55 (1), 34-39 (2006).
  5. Goss, J. A., Nakafusa, Y., Finke, E. H., Flye, M. W., Lacy, P. E. Induction of tolerance to islet xenografts in a concordant rat-to-mouse model. Diabetes. 43 (1), 16-23 (1994).
  6. Hara, M., et al. A mouse model for studying intrahepatic islet transplantation. Transplantation. 78 (4), 615-618 (2004).
  7. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
  8. Wang, J., et al. Alpha-1 antitrypsin enhances islet engraftment by suppression of instant blood-mediated inflammatory reaction. Diabetes. 66 (4), 970-980 (2017).
  9. Gou, W., et al. Alpha-1 antitrypsin suppresses macrophage activation and promotes islet graft survival after intrahepatic islet transplantation. American Journal of Transplantation. , (2020).
  10. Contreras, J. L., et al. Activated protein C preserves functional islet mass after intraportal transplantation: A novel link between endothelial cell activation, thrombosis, inflammation, and islet cell death. Diabetes. 53 (11), 2804-2814 (2004).
  11. Moberg, L., et al. Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation. Lancet. 360 (9350), 2039-2045 (2002).
  12. Melzi, R., et al. Intrahepatic islet transplant in the mouse: functional and morphological characterization. Cell Transplantation. 17 (12), 1361-1370 (2008).
  13. Wang, H., et al. Donor treatment with carbon monoxide can yield islet allograft survival and tolerance. Diabetes. 54 (5), 1400-1406 (2005).
  14. Desai, C. S., et al. Effect of liver histopathology on islet cell engraftment in the model mimicking autologous islet cell transplantation. Islets. 9 (6), 140-149 (2017).
  15. Cui, W., Angsana, J., Wen, J., Chaikof, E. L. Liposomal formulations of thrombomodulin increase engraftment after intraportal islet transplantation. Cell Transplantation. 19 (11), 1359-1367 (2010).
  16. Cui, W., et al. Thrombomodulin improves early outcomes after intraportal islet transplantation. American Journal of Transplantation. 9 (6), 1308-1316 (2009).
  17. Proto, C., Grasso, G., Fassio, P. G. Hepatoparenchymal clearance of indocyanine green in infectious hepatitis. Giornale di Malattie Infettive e Parassitarie. 20 (9), 845-851 (1968).
  18. Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments. (132), e56993 (2018).
  19. Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. Intraportal transplantation of pancreatic islets in mouse model. Journal of Visualized Experiments. (135), e57559 (2018).
  20. Wang, H., et al. Autologous mesenchymal stem cell and islet cotransplantation: Safety and efficacy. Stem Cells Translational Medicine. 7 (1), 11-19 (2018).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 171

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır