Minimierung der Venenblutung nach der Infusion während der intrahepatischen Inseltransplantation bei Mäusen

Zusammenfassung

Hier stellen wir verfeinerte chirurgische Verfahren zur erfolgreichen Durchführung der intraportalen Inseltransplantation, einem klinisch relevanten, aber technisch anspruchsvollen chirurgischen Eingriff, bei Mäusen vor.

Zusammenfassung

Obwohl die Leber derzeit als primärer Transplantationsort für menschliche Inseln in klinischen Umgebungen akzeptiert wird, werden Inseln in den meisten präklinischen Inseltransplantationsstudien von Nagetieren unter die Nierenkapsel transplantiert. Dieses Modell wird häufig verwendet, da die murine intrahepatische Inseltransplantation technisch eine Herausforderung darstellt und ein hoher Prozentsatz der Mäuse an chirurgischen Komplikationen sterben könnte, insbesondere an Blutungen von der Injektionsstelle nach der Transplantation. In dieser Studie werden zwei Verfahren gezeigt, die die Häufigkeit von Pfortaderblutungen nach der Infusion minimieren können. Die erste Methode wendet einen resorbierbaren hämostatischen Gelatineschwamm auf die Injektionsstelle an, und die zweite Methode besteht darin, die Inselinjektionsnadel zuerst durch das Fettgewebe und dann in die Pfortader zu durchdringen, indem das Fettgewebe als physikalische Barriere verwendet wird, um Blutungen zu stoppen. Beide Methoden könnten den blutungsbedingten Mäusetod wirksam verhindern. Der gesamte Leberabschnitt mit Inselverteilung und Anzeichen einer Inselthrombose nach der Transplantation, ein typisches Merkmal für die intrahepatische Inseltransplantation, wurden vorgestellt. Diese verbesserten Protokolle verfeinern die intrahepatischen Inseltransplantationsverfahren und können Labors helfen, das Verfahren zur Untersuchung des Überlebens und der Funktion von Inselchen in präklinischen Umgebungen einzurichten.

Einleitung

Die intraportale Inseltransplantation (IIT) über die Pfortader ist die am häufigsten verwendete Methode für die Transplantation menschlicher Inseln in klinischen Umgebungen. Das IIT-Modell der Maus bietet eine großartige Gelegenheit, die Inseltransplantation zu untersuchen und vielversprechende interventionelle Ansätze zu testen, die die Wirksamkeit der Inseltransplantation verbessern ^können1. IIT wurde erstmals in den 1970er Jahren beschrieben und von mehreren Gruppen verwendet1,2,3,4,5. Es gewann nach dem Durchbruch in der menschlichen Inseltransplantation im Jahr 20006 wieder an ^{Popularität,7}. Die meisten Inseltransplantationsstudien verwendeten jedoch die Nierenkapsel aufgrund ihres leichten Erfolgs als bevorzugten Ort für die experimentelle Inseltransplantation. Im Gegenteil, IIT ist technisch anspruchsvoller und wird seltener für Inseltransplantationsstudien ^verwendet8,9. Im Gegensatz zum IIT leiden Inseln, die unter die Nierenkapsel transplantiert werden, jedoch nicht an der unmittelbaren blutvermittelten Entzündungsreaktion, die durch Thrombose, Entzündungen und Lebergewebeischämie gekennzeichnet ist, und haben daher eine bessere Funktion als in die Leber transplantierte Inseln. Das Nierenkapselmodell kann daher die Belastungen, denen Inselchen bei der Transplantation menschlicher Inseln ausgesetzt sind, möglicherweise nicht vollständig ^{nachahmen10,11,12.}

Eine der Hauptkomplikationen der IIT bei Mäusen sind Blutungen von der Injektionsstelle nach der Transplantation, die 10-30% der Mortalität bei verschiedenen Mausstämmen verursachen ^können12. In diesem Artikel wurden zwei verfeinerte Ansätze entwickelt, um Blutungen schneller und sicherer zu stoppen und die Maussterblichkeit nach einem IIT zu reduzieren. Die visuelle Demonstration dieser raffinierten Details wird den Forschern helfen, die wichtigsten Schritte dieses technisch anspruchsvollen Verfahrens zu identifizieren. Darüber hinaus wurde die Lage der Inseltransplantate in der Leber des Empfängers durch histologische Untersuchung des mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) gefärbten Lebergewebes (ganzer Abschnitt) bestimmt, das transplantierte Inseln trägt.

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Protokoll

Alle Verfahren wurden mit Genehmigung der Institutional Animal Care and Use Committees an der Medical University of South Carolina und des Ralph H Johnson Medical Center in Charleston durchgeführt.

1. Diabetes-Induktion mit Streptozotocin (STZ)

1. Vorbereitung der Empfängermäuse:
   1. Wiegen Sie alle Mäuse einzeln.
   2. Überprüfen Sie den Blutzuckerspiegel aus einer Blutprobe der Heckvene mit einem Glucometer.
2. STZ-Dosisbestimmung für drei verschiedene Szenarien:
   1. Bei Mäusen mit Fettlebererkrankung eine Dosis STZ [40 mg/kg/Tag, intraperitoneale (i.p.) Injektion] für 5 aufeinanderfolgende Tage.
   2. Bei NOD-SCID-Mäusen 125 mg/kg STZ, einmalige Injektion, i.p. nach dem Fasten über Nacht.
   3. Bei C57BL/6-Mäusen 225 mg/kg STZ injizieren, Einzelinjektion, i.p.
3. Berechnungen für STZ (13,5 mg/ml):
   HINWEIS: Diese Berechnung gilt für fünf C57BL/6-Mäuse mit einem Körpergewicht von 30 g:
   1. Gesamtkörpergewicht: 5 Mäuse x 30 g/Maus = 150g
   2. STZ benötigt: 150 g x 225 mg/1000g STZ = 33,75 mg
4. STZ-Vorbereitung:
   1. Wiegen Sie die STZ nach der vorberechneten Dosis.
   2. Das gewogene STZ-Pulver in ein 10 ml Becherglas auf Eis geben.
   3. 3 ml Natriumcitratlösung in das Becherglas geben, um die STZ aufzulösen.
   4. Gut mischen, durch eine 0,22-μm-Pore sterilisieren und die STZ-Lösung innerhalb von 10 Minuten nach der Zubereitung verwenden.
5. STZ-Injektion:
   1. Laden Sie die gewünschte Menge an STZ-Lösung (ausreichend für eine Maus) in eine 1-ml-Spritze.
   2. Führen Sie eine intraperitoneale Injektion am unteren rechten Quadranten des Mausabdomens durch.
   3. Beobachten Sie Mäuse für 5 Minuten nach der Injektion und überprüfen Sie auf Anzeichen von Beschwerden während dieser Zeit, bevor Sie sie wieder in die Käfige legen.
   4. Überwachen Sie den Blutzuckerspiegel aus einer Blutprobe mit einer Schwanzvenenblutprobe täglich nach der STZ-Injektion.
      HINWEIS: In diesem Experiment gelten Mäuse als Diabetiker, wenn der nicht nüchterne Blutzucker an zwei aufeinanderfolgenden Tagen > 350 mg / dl liegt.

2. Inselvorbereitung

HINWEIS: Menschliche Inseln wurden in CMRL-1066-Medien kultiviert, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin/Streptomycin (P/S) bei einer Dichte von 10.000 Inseläquivalenten (IEQ) pro 100 mm Zellkulturschale9. Mausinseln wurden in DMEM mit 10% FBS und 1% P / S mit der gleichen Dichte ^{kultiviert13.} Männliche NOD-SCID- und C57BL/7-Mäuse im Alter zwischen 6 und 10 Wochen wurden aus kommerziellen Quellen gewonnen.

1. Lösen Sie kultivierte Inseln durch leichtes Kratzen von der Zellkulturschale.
2. Wählen Sie die gewünschte Anzahl von Inseln (z. B. 300-350 Inseln) mit einer 1cc-Spritze aus und legen Sie sie in sterile 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis.
3. Drehen Sie das Röhrchen 10 Sekunden lang mit der Mikrozentrifuge.
4. Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie etwas Flüssigkeit zurück, um den Verlust des Pellets zu vermeiden.
5. Resuspendiert das Pellet in 200 μL HBSS mit 0,5% Rinderserumalbumin (BSA).
6. Aspirieren Sie die resuspendierten Inseln in eine 0,5 ml Insulinspritze.
7. Stellen Sie die Spritze in die aufrechte Position. Lassen Sie die Inseln für 1 min sinken.
8. Drücken Sie die Spritze, um alle Blasen zu entfernen, so dass etwa 100-150 μL Flüssigkeit übrig bleiben, die Inseln enthält.
9. Legen Sie die Spritze mit dem Kopf nach unten und klopfen Sie vorsichtig auf die Seite der Spritze, damit sich die Inseln gleichmäßig über die Flüssigkeit verteilen. Islets sind jetzt bereit für die Injektion.

3. Inseltransplantation

1. Induzieren und pflegen Sie die Maus unter Vollnarkose mit 2% Isofluran. Überprüfen Sie, ob Pedalreflexe fehlen, um eine ordnungsgemäße Anästhesie des Tieres zu gewährleisten.
2. Rasieren und entfernen Sie das Fell im Bauchbereich der Maus.
3. Verabreichen Sie eine präoperative Einzeldosis Buprenorphin (0,1 mg/kg i.p.).
4. Desinfizieren Sie den Operationsbereich mit drei abwechselnden Tüchern aus 2% Jod und 75% Alkohol.
5. Führen Sie eine Laparotomie mit einer Mikroschere durch, um einen Schnitt von 1-1,5 cm zu erzeugen.
6. Öffnen Sie die Peritonealhöhle mit einem Retraktor. Befolgen Sie entweder Methode A oder Methode B, wie unten beschrieben.

4. Methode A: (Blutung mit Gelschaum stoppen, Abbildung 1A)^14,15,16

1. Mausvorbereitung
   1. Legen Sie eine sterile Gaze um den Einschnitt.
   2. Ziehen Sie den Darm vorsichtig mit einer Pinzette heraus und halten Sie ihn auf der Gaze.
   3. Identifizieren Sie die Pfortader anhand ihrer Position und legen Sie sie gut frei.
   4. Bedecken Sie den Darm während der gesamten Operation mit einer warmen, salzhaltigen Gaze.
2. Führen Sie die vorgespannte Insulinspritzennadel der Insel durch die Pfortader in der Nähe des Zwölffingerdarms ein (Abbildung 1B). Halten Sie dazu die Nadel mit dem Loch (der Abschrägung) nach unten und positionieren Sie den Winkel der Öffnungsfläche parallel zur Pfortaderwand, bevor Sie durch die Wand eindringen.
   1. Ziehen Sie den Kolben, um etwas Blut (20-50 μL) in die Spritze zu ziehen, um zuerst die Inseln zu mischen.
   2. Tränken Sie die Inseln langsam in die Pfortader, während Sie den Sprung wiederholt ziehen und drücken.
   3. Legen Sie ein Stück Gelschaum (ca. 0,5 cm x 0,5 cm groß) auf, um die Injektionsstelle abzudecken.
   4. Drücken Sie den Gelschaum mit einer Baumwollspitze nach unten, während Sie die Nadel aus der Pfortader herausziehen.
   5. Drücken Sie etwa 2 Minuten lang weiter auf das Gel, um zu bestätigen, dass keine aktive Blutung vorliegt.
   6. Rollen Sie die Baumwollspitze über und weg vom Gelschaum, um sicherzustellen, dass der Gelschaum die Pfortader gut bedeckt.

5. Methode B: (Blutungen mit Fettpolster stoppen, Abbildung 1C)17

1. Legen Sie die Pfortader gründlich frei.
   1. Verwenden Sie zwei Baumwollspitzen, um die freiliegende Pfortader sowohl von der linken als auch von der rechten Seite zu halten.
   2. Identifizieren Sie das Fettgewebepolster zwischen dem Zwölffingerdarm und der Pfortader.
   3. Dringen Sie durch das Fettpolster ein, bevor Sie die Nadel in die Pfortader einführen (Abbildung 1D).
   4. Die Inseln werden nach dem ähnlichen Verfahren infundiert, das oben in den Teilen 4.2.1 und 4.2.2 der Methode A beschrieben wurde.
   5. Ziehen Sie die Nadel heraus, während Sie mit einer Baumwollspitze auf das Fett drücken.
   6. Drücken Sie nach dem Entfernen der Nadel 1 min lang weiter auf das Fettpolster.
2. Nachdem Sie bestätigt haben, dass es keine Blutungen aus der Pfortader gibt, bringen Sie den Darm vorsichtig in die Peritonealhöhle in seiner ursprünglichen Position zurück.
3. Lassen Sie 0,5 ml warme Kochsalzlösung (36-37 ° C) in der Bauchhöhle vor dem Schließen.
   HINWEIS: Warme Kochsalzlösung erleichtert die postoperative Darmbewegung und -erholung und beugt Darmnekrose vor.
4. Schließen Sie die Muskelschicht mit einer 5-0-Naht ab.
5. Schließen Sie die Hautschicht mit einer 4-0-Naht ab.
6. Legen Sie die Maus in einen sauberen Käfig auf einem Heizkissen, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt hat.
7. Geben Sie weiterhin alle 12 Stunden ein Analgetikum (z. B. Buprenorphin 0,1 mg / kg i.p.) und zusätzliche Wärme für 48 h nach der Operation an.
   HINWEIS: Die Inseltransplantation dauert ca. 15-20 Minuten.

6. H & E-Färbung und Foto des gesamten Leberabschnitts

1. Leberdurchblutung
   1. Die Maus unter Narkose setzen, wie oben in Teil 3.1 beschrieben.
   2. Legen Sie vorsichtig die Pfortader frei und schneiden Sie die untere Hohlvene ab.
   3. Perfusionieren Sie die Leber manuell mit 20 ml 10% Paraformaldehyd über die Pfortader für etwa 5 Minuten mit einer 20-ml-Spritze mit ^25G-Nadel18.
      HINWEIS: Die Leberdurchblutung kann Blut aus dem Lebergewebe entfernen und die Leberfixierung verbessern, ohne die Inseltransplantate zu stören.
   4. Sezieren Sie die durchblutete ganze Leber von anderen Organen.
   5. Fixieren Sie das durchblutete Lebergewebe in 10% Paraformaldehyd für 24 h.
   6. Betten Sie das Gewebe in Paraffin ein.
   7. Schneiden Sie Gewebeschnitte mit einer Dicke von jeweils 5 μm und legen Sie sie zum Färben auf einen Glasobjektträger.
   8. H&E-, Insulin-, Fibrin- und polymorphkernige Neutrophilenfärbung (PMN) mit Standardmethoden ^{durchführen15,16}.
   9. Scannen Sie den gesamten Leberschnitt unter einem Mikroskop.

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Ergebnisse

Über die Vene portal führten wir syngene und xenogene Inseltransplantationen durch. Die Funktion des Inseltransplantats wurde in beiden Inseltransplantationsmodellen dosisabhängig beobachtet. Im syngenen Inseltransplantationsmodell mit C57BL/6-Mäusen führte die Transplantation von 250 Inseln zu einer vorübergehenden Normoglykämie, bevor die Mäuse zur Hyperglykämie zurückkehrten. Mäuse, die 500 Inseln erhielten, erreichten und hielten die Normoglykämie länger als 30 Tage nach der Transplantation aufrecht (

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Diskussion

In dieser Studie wurden zwei verbesserte Verfahren demonstriert, die Blutungen verhindern und die Mausmortalität während der Maus-IIT reduzieren können. Diese Studie ermöglicht es den Forschern, das Inseltransplantationsmodell zu visualisieren, das bei der Untersuchung der sofortigen blutvermittelten Entzündungsreaktion nach der Transplantation einzigartig ist. Das IIT-Modell ist ein unverwechselbares Modell für die Untersuchung des Überlebens von Inselzellen und hepatischer ischämischer Verletzungen als Reaktion...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral buffered formalin v/v	Fisher Scientific	23426796
1 mL Syringe with needle	AHS	AH01T
20 mL Syringe	BD	301031
25G x 5/8" hypodermic needles	BD	305122
Alcohol prep pads, sterile	Fisher Scientific	22-363-750
Animal Anesthesia system	VetEquip, Inc.	901806
Buprenorphine hydrochloride, injection	Par Sterile Products, LLC	NDC 42023-179-05
Centrifuge tubes, 15 mL	Fisher Scientific	0553859A
CMRL-1066	Corning	15110CV
DMEM	Corning	10013CV
Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade	Fisher Scientific	BP2818500
Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5882
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	35011CV
FreeStyle  Glucose meter	Abbott	Lite
FreeStyle Blood Glucose test strips	Abbott	Lite
Gelfoam (absorbable gelatin sponge, USP)	Pharmacia & Upjohn Company	34201
Graefe forceps 4” extra delicate tip	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5136
Heated pad	Amazon	B07HMKMBKM
Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25”	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-7850
Insulin syringe with 27-gauge needle	BD	879588
Iodine prep pads	Fisher Scientific	19-027048
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Penicillin/streptomycin (P/S)	HyClone	SV30010
Polypropylene Suture 4-0	Med-Vet International	MV-8683
Polypropylene Suture 5-0	Med-Vet International	MV-8661
Sodium chloride, 0.9% intravenous solution	VWR	2B1322Q
Streptozocin (STZ)	Sigma	S0130
Surgical drape, sterile	Med-Vet International	DR1826
Tissue Cassette	Fisher Scientific	22-272416