Minimizando o sangramento da veia do portal pós-infusão durante o transplante de ilhotas intrahápticas em camundongos

Resumo

Aqui apresentamos procedimentos cirúrgicos refinados na realização com sucesso do transplante de ilhotas intraportais, um procedimento cirúrgico clinicamente relevante, mas tecnicamente desafiador, em camundongos.

Resumo

Embora o fígado seja atualmente aceito como o principal local de transplante de ilhotas humanas em ambientes clínicos, as ilhotas são transplantadas sob a cápsula renal na maioria dos estudos de transplante de ilhotas pré-clínicas de roedores. Este modelo é comumente usado porque o transplante de ilhotas intrahpáticas de murina é tecnicamente desafiador, e uma alta porcentagem de camundongos pode morrer de complicações cirúrgicas, especialmente sangrando do local de injeção pós-transplante. Neste estudo, são demonstrados dois procedimentos que podem minimizar a incidência de sangramento venoso do portal pós-infusão. O primeiro método aplica uma esponja de gelatina hemostática absorvível no local da injeção, e o segundo método envolve penetrar a agulha de injeção de ilhotas através do tecido adiposo primeiro e depois na veia portal usando o tecido adiposo como uma barreira física para parar o sangramento. Ambos os métodos poderiam efetivamente prevenir a morte do rato induzido pelo sangramento. Toda a seção hepática que mostra distribuição de ilhotas e evidências de trombose de ilhotas pós-transplante, característica típica do transplante de ilhotas intrahpáticas, foram apresentadas. Esses protocolos aprimorados refinam os procedimentos de transplante de ilhotas intrahpáticas e podem ajudar os laboratórios a configurar o procedimento para estudar a sobrevida de ilhotas e funcionar em ambientes pré-clínicos.

Introdução

O transplante de ilhotas intraportais (IIT) através da veia portal é o método mais utilizado para transplante de ilhotas humanas em ambientes clínicos. O modelo de IIT do camundongo oferece uma grande oportunidade de estudar transplante de ilhotas e testar abordagens intervencionistas promissoras que podem aumentar a eficácia do transplante de ilhotas1. O IIT foi descrito pela primeira vez na década de 1970 e usado por vários grupos1,2,3,4,5. Recuperou popularidade após o avanço no transplante de ilhotas humanas no ano de 20006,7. No entanto, a maioria dos estudos de transplante de ilhotas usou a cápsula renal como local preferido para transplante experimental de ilhotas devido ao seu fácil sucesso. Pelo contrário, o IIT é mais desafiador tecnicamente e menos frequentemente utilizado para estudos de transplante de ^ilhotas8,9. Ao contrário do IIT, no entanto, as ilhotas transplantadas sob a cápsula renal não sofrem da reação inflamatória mediada pelo sangue imediata caracterizada por trombose, inflamação e isquemia de tecido hepático, e, portanto, têm melhor função do que as ilhotas transplantadas no fígado. O modelo de cápsula renal, portanto, não pode imitar totalmente as tensões encontradas pelas ilhotas no transplante de ilhotas humanas10,11,12.

Uma das principais complicações do IIT em camundongos é o sangramento do local da injeção após o transplante, o que poderia causar 10-30% de mortalidade entre diferentes cepas de ^{camundongos12}. Neste artigo, duas abordagens refinadas foram desenvolvidas para parar o sangramento de forma mais rápida e segura e reduzir a mortalidade de camundongos após uma IIT. A demonstração visual desses detalhes refinados ajudará os pesquisadores a identificar os principais passos deste procedimento tecnicamente desafiador. Além disso, a localização dos enxertos de ilhotas no fígado do receptor foi determinada por exame histológico da Hematoxilina e Eosin (H&E) com ilhotas transplantadas.

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Protocolo

Todos os procedimentos foram conduzidos com a aprovação dos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais na Universidade Médica da Carolina do Sul e do Ralph H Johnson Medical Center em Charleston.

1. Indução de diabetes usando estreptozotocina (STZ)

1. Preparação de ratos receptores:
   1. Pesar todos os ratos individualmente.
   2. Verifique os níveis de glicose no sangue de uma amostra de sangue da veia da cauda usando um glucometer.
2. Determinação da dose STZ para três cenários diferentes:
   1. Para camundongos com doença hepática gordurosa, injete uma dose de STZ [40 mg/kg/dia, injeção intraperitoneal (i.p.) por 5 dias consecutivos.
   2. Para ratos NOD-SCID injetar 125 mg/kg de STZ, injeção única, i.p. após o jejum durante a noite.
   3. Para C57BL/6 camundongos injetam 225 mg/kg de STZ, injeção única, i.p.
3. Cálculos para STZ (13,5 mg/mL):
   NOTA: Este cálculo é para cinco camundongos C57BL/6 com pesos corporais de 30 g:
   1. Peso corporal total: 5 ratos x 30 g/mouse = 150g
   2. STZ necessário: 150 g x 225 mg/1000g STZ = 33,75 mgs
4. Preparação stz:
   1. Pese o STZ seguindo a dose pré-calculada.
   2. Transfira o pó STZ pesado para um béquer de 10 mL no gelo.
   3. Adicione 3 mL de solução de citrato de sódio ao béquer para dissolver o STZ.
   4. Misture bem, filtre esterilizar através de um poro de 0,22 μm e use a solução STZ dentro de 10 minutos de preparação.
5. Injeção de STZ:
   1. Carregue a quantidade desejada de solução STZ (suficiente para um mouse) em seringa de 1 mL.
   2. Realize a injeção intraperitoneal no quadrante inferior direito do abdômen do rato.
   3. Observe os camundongos por 5 minutos após a injeção e verifique se há sinais de desconforto durante este período de tempo antes de colocá-los de volta nas gaiolas.
   4. Monitore o nível de glicose no sangue de uma amostra de sangue da veia da cauda usando um glucometer diariamente após a injeção de STZ.
      NOTA: Neste experimento, os camundongos são considerados diabéticos quando a glicemia não em jejum é > 350 mg/dL por dois dias consecutivos.

2. Preparação de ilhotas

NOTA: As ilhotas humanas foram cultivadas em mídia CMRL-1066 suplementada com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina (P/S) a uma densidade de 10.000 ilhotas equivalente (IEQ) por 100 mm de cultura celular ^dish9. As ilhotas do rato foram cultivadas em DMEM com 10% de FBS e 1% P/S com a mesma ^densidade13. Os camundongos NOD-SCID masculinos e C57BL/7 entre 6 e 10 semanas de idade foram obtidos de fontes comerciais.

1. Desprender ilhotas cultivadas do prato de cultura celular por arranhões suaves.
2. Escolha a dedo números desejados de ilhotas (por exemplo, 300-350 ilhotas) usando uma seringa de 1cc e coloque-as em tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL estéreis no gelo.
3. Gire o tubo por 10 segundos usando o microcentrifuuge.
4. Remova o supernasce, deixando algum líquido para evitar perder a pelota.
5. Resuspense a pelota em 200 μL de HBSS com albumina de soro bovino de 0,5% (BSA).
6. Aspire as ilhotas resuspended em uma seringa de insulina de 0,5 mL.
7. Coloque a seringa na posição vertical. Deixe as ilhotas afundarem por 1 min.
8. Empurre a seringa para remover todas as bolhas, deixando cerca de 100-150 μL de líquido contendo ilhotas.
9. Coloque a cabeça da seringa para baixo e bata suavemente no lado da seringa para deixar as ilhotas distribuirem igualmente por todo o líquido. Ilhotas estão prontas para injeção.

3. Transplante de ilhotas

1. Induzir e manter o rato sob anestesia geral com 2% de isoflurane. Verifique a falta de reflexos do pedal para garantir a anestesia adequada do animal.
2. Raspe e remova a pele na área do abdômen do rato.
3. Administrar uma única dose pré-operatória de Buprenorfina (0,1 mg/kg i.p.).
4. Desinfete a área cirúrgica com três lenços alternados de 2% de iodo e 75% de álcool.
5. Faça uma laparotomia com micro tesoura para gerar uma incisão de 1-1,5 cm.
6. Abra a cavidade peritoneal com um retrátil. Siga com o método A ou o método B conforme detalhado abaixo.

4. Método A: (pare de sangrar com espuma de gel, Figura 1A)14,15,16

1. Preparação do rato
   1. Coloque uma gaze estéril ao redor da incisão.
   2. Puxe suavemente o intestino usando um fórceps e mantenha-o na gaze.
   3. Identifique a veia do portal por sua localização e exponha-a bem.
   4. Cubra o intestino com uma gaze salina quente durante toda a cirurgia.
2. Insira a ilhota agulha de seringa de insulina pré-carregada através da veia portal perto do duodeno (Figura 1B). Para isso, segure a agulha com o orifício (bisel) voltado para baixo e posicione o ângulo da superfície de abertura paralela à parede da veia do portal antes de penetrar através da parede.
   1. Puxe o êmbolo para extrair um pouco de sangue (20-50 μL) na seringa para misturar as ilhotas primeiro.
   2. Infunda as ilhotas na veia do portal lentamente enquanto puxa e empurra repetidamente o mergulho.
   3. Coloque um pedaço de espuma de gel (cerca de 0,5 cm x 0,5 cm de tamanho) para cobrir o local da injeção.
   4. Pressione a espuma de gel para baixo com uma ponta de algodão enquanto puxa a agulha da veia do portal.
   5. Continue pressionando o gel por cerca de 2 minutos para confirmar que não há sangramento ativo.
   6. Enrole a ponta de algodão para cima e para longe da espuma de gel para ter certeza de que a espuma de gel cobre bem a veia do portal.

5. Método B: (pare de sangrar com almofada de gordura, Figura 1C)¹⁷

1. Exponha bem a veia do portal.
   1. Use duas pontas de algodão para segurar a veia do portal exposto tanto do lado esquerdo quanto do direito.
   2. Identifique a almofada de tecido adiposo entre o duodeno e a veia portal.
   3. Penetre através da almofada de gordura antes de inserir a agulha na veia portal (Figura 1D).
   4. Infundir as ilhotas, seguindo o procedimento semelhante descrito acima nas partes 4.2.1 e 4.2.2 do Método A.
   5. Puxe a agulha enquanto pressiona a gordura com uma ponta de algodão.
   6. Continue pressionando a almofada de gordura por 1 minuto depois de remover a agulha.
2. Após confirmar que não há sangramento da veia portal, retorne suavemente o intestino à cavidade peritoneal em sua posição original.
3. Deixe 0,5 mL de soro fisiológico quente (36-37 °C) na cavidade abdominal antes do fechamento.
   NOTA: O soro fisiológico quente facilita o movimento e a recuperação do intestino pós-cirurgia e previne a necrose intestinal.
4. Feche a camada muscular com uma sutura 5-0.
5. Feche a camada de pele com uma sutura 4-0.
6. Coloque o mouse em uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento até que esteja totalmente recuperado da anestesia.
7. Continue fornecendo um analgésico (por exemplo, buprenorfina 0,1 mg/kg i.p.) a cada 12h e calor suplementar para 48 h pós-cirurgia.
   NOTA: O procedimento de transplante de ilhotas leva aproximadamente 15-20 minutos para ser concluído.

6. Mancha h&E e fotografia de toda a seção hepática

1. Perfusão hepática
   1. Coloque o rato sob anestesia como descrito acima na parte 3.1.
   2. Exponha cuidadosamente a veia do portal e corte a veia cava inferior.
   3. Perfumar manualmente o fígado usando 20 mL de 10% de paraformaldeído através da veia portal por cerca de 5 minutos, utilizando uma seringa de 20 mL com agulha ^25G18.
      NOTA: A perfusão hepática pode remover sangue do tecido hepático e melhorar a fixação hepática sem perturbar os enxertos de ilhotas.
   4. Dissecar o fígado inteiro perfumado de outros órgãos.
   5. Fixar o tecido hepático perfumado em 10% paraformaldeído por 24 h.
   6. Incorpore o tecido em parafina.
   7. Corte seções de tecido de 5 μm de espessura cada e coloque-as em uma lâmina de vidro para coloração.
   8. Realize a coloração de H&E, insulina, fibrina e nêutrons polimorfonuclear (PMN) utilizando métodos ^padrão15,16.
   9. Escaneie a seção hepática inteira sob um microscópio.

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Resultados

Realizamos transplantes de ilhotas sinténicas e xenogênicas através da veia portal. A função do enxerto de ilhota foi observada de forma dependente de dose em ambos os modelos de transplante de ilhotas. No modelo de transplante de ilhotas sinténicas usando camundongos C57BL/6, o transplante de 250 ilhotas levou à normolicemia transitória antes que os camundongos retornassem à hiperglicemia. Camundongos que receberam 500 ilhotas alcançaram e mantiveram a normolicemia além de 30 dias após o transplante (

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Discussão

Neste estudo, dois procedimentos aprimorados que podem prevenir sangramento e reduzir a mortalidade do rato durante o IIT do camundongo foram demonstrados. Este estudo permite que os pesquisadores visualizem o modelo de transplante de ilhotas que é único no estudo da resposta inflamatória mediada pelo sangue instantâneo após o transplante. O modelo IIT é um modelo distinto para estudar a sobrevivência das células ilhotas e lesões isquêmicas hepáticas em resposta ao transplante de ^ilhotas19

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral buffered formalin v/v	Fisher Scientific	23426796
1 mL Syringe with needle	AHS	AH01T
20 mL Syringe	BD	301031
25G x 5/8" hypodermic needles	BD	305122
Alcohol prep pads, sterile	Fisher Scientific	22-363-750
Animal Anesthesia system	VetEquip, Inc.	901806
Buprenorphine hydrochloride, injection	Par Sterile Products, LLC	NDC 42023-179-05
Centrifuge tubes, 15 mL	Fisher Scientific	0553859A
CMRL-1066	Corning	15110CV
DMEM	Corning	10013CV
Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade	Fisher Scientific	BP2818500
Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5882
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	35011CV
FreeStyle  Glucose meter	Abbott	Lite
FreeStyle Blood Glucose test strips	Abbott	Lite
Gelfoam (absorbable gelatin sponge, USP)	Pharmacia & Upjohn Company	34201
Graefe forceps 4” extra delicate tip	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5136
Heated pad	Amazon	B07HMKMBKM
Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25”	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-7850
Insulin syringe with 27-gauge needle	BD	879588
Iodine prep pads	Fisher Scientific	19-027048
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Penicillin/streptomycin (P/S)	HyClone	SV30010
Polypropylene Suture 4-0	Med-Vet International	MV-8683
Polypropylene Suture 5-0	Med-Vet International	MV-8661
Sodium chloride, 0.9% intravenous solution	VWR	2B1322Q
Streptozocin (STZ)	Sigma	S0130
Surgical drape, sterile	Med-Vet International	DR1826
Tissue Cassette	Fisher Scientific	22-272416