כמות מוחלטת של אינוזיטול פירופוספטים על ידי אלקטרופורזה נימית אלקטרוספריי ספקטרומטריית מסה יינון

Summary

מתואר הליך לאלקטרופורזה נימית אלקטרופורזה ספקטרומטריית מסת יינון עבור הכמות המוחלטת של אינוזיטול פירופוספטים מתמציות תאי יונקים.

Abstract

אינוזיטול פירופוספטים (PP-InsPs) הם קבוצה חשובה של מולקולות איתות תוך-תאיות. מולקולות אלה, שמקורן באינוזיטול פוספטים (InsPs), כוללות נוכחות של לפחות פירופוספט מואטי אנרגטי אחד על טבעת מיו-אינוזיטול. הם קיימים בכל מקום באאוקריוטים ופועלים כשליחים מטבוליים הסוקרים הומאוסטזיס פוספט, רגישות לאינסולין ומטען אנרגיה תאית. בשל היעדר כרומופור במטבוליטים אלה, צפיפות מטען גבוהה מאוד ושפע נמוך, הניתוח שלהם דורש מעקב רדיואקטיבי, ולכן הוא מפותל ויקר. כאן, המחקר מציג פרוטוקול מפורט לביצוע כמות תפוקה מוחלטת וגבוהה של אינוזיטול פירופוספטים מתאי יונקים על ידי אלקטרופורזה נימית אלקטרוספריי ספקטרומטריית מסת יינון (CE-ESI-MS). שיטה זו מאפשרת פרופיל רגיש של כל מיני PP-InsPs הרלוונטיים ביולוגית בתאי יונקים, ומאפשרת הפרדה בסיסית של רג'יואיזומרים. מוצגים ריכוזים תאיים מוחלטים של PP-InsPs, כולל איזומרים קלים, וניטור השינויים הזמניים שלהם בתאי HCT116 במספר תנאי ניסוי.

Introduction

מאז הגילוי הראשוני של מיו-אינוזיטול פירופוספטים (PP-InsPs) בשנת 1993 ^1,2, הושגה התקדמות משמעותית כדי להבהיר את הביוסינתזה, המחזור והתפקודים שלהם³. אינוזיטול פירופוספטים מופיעים בכל מקום בתאים אאוקריוטים⁴ ומשמשים כמולקולות איתות מטבוליות המעורבות באופן קריטי, למשל, הומאוסטזיס פוספט^5,6, רגישות לאינסולין⁷, תנודות סידן^8,9, סחר בשלפוחית 10, אפופטוזיס 11, תיקון DNA 12^, איתות חיסוני ¹³ ואחרים., שפע התהליכים החשובים תחת שליטתם של אינוזיטול פירופוספטים דורש הבנה עמוקה יותר של השפע התאי שלהם, תנודות ולוקליזציה.

למרות ש- InsPs ו- PP-InsPs משכו תשומת לב בין דיסציפלינות, ניתוח השפע שלהם מבוצע באופן שגרתי בשיטה שפותחה במהלך שנות ה -80, המורכבת מתיוג תאים עם אינוזיטול טריטי, פתרון PP-InsPs שחולץ על ידי כרומטוגרפיית חילופי אניונים חזקה Sax-HPLC עם ספירת scintillation שלאחר מכן. שיטות חדשות יותר המבוססות על ספקטרומטריית מסות עדיין מתמודדות עם אתגרים משמעותיים: אינוזיטול פירופוספטים עם עד שמונה יחידות פוספט מכילים אסטרי פוספט ואנהידרידים, מה שמוביל למטען שלילי משמעותי ולאובדן פוספט פוטנציאלי במהלך יינון. ישנם ארבעה סוגים עיקריים של PP-InsPs שנמצאים ביונקים (איור 1): 1,5-(PP)_2-InsP 4 (או 1,5-InsP₈), 5-PP-InsP 5 (או 5-InsP 7), 1-PP-InsP 5 (או 1-InsP₇) ו-5-PP-Ins(1,3,4,6)P 4 (או_{5-PP-InsP 4})^3,14. הרמות הפיזיולוגיות של PP-InsPs נמצאות בדרך כלל בטווח הננו-מיקרומולרי הנמוך, כאשר 5-PP-InsP 5 הוא הנפוץ ביותר עם ריכוזים תאיים של 0.5 - 5 מיקרומטר. 1,5-(PP)_{2-InsP 4} ו-1-PP-InsP 5 הם ככל הנראה עד כ-10% ממאגר 5-PP-InsP ₅ ונותר קשה למעקב בתאים רבים¹⁵. 5-PP-InsP₄ עם קבוצת OH חופשית הוא אפילו נמוך יותר בשפע ובדרך כלל הופך להיות ניתן לזיהוי רק כאשר הידרולזות פוספט מעוכבות עם נתרן פלואוריד (NaF)¹⁶.

צפיפות המטען הגבוהה של PP-InsPs מקשה על הפרדתם, והמופע של רג'ואיזומרים PP-InsP מסבך עוד יותר את המאמצים הללו. כתוצאה מכך, רוב הניסויים הסתמכו על כמות על ידי תיוג רדיואקטיבי מטבולי של תאים באמצעות [³H]-אינוזיטול, כאשר הרקע מהמטריצה אינו נכלל ורגישות גבוהה מושגת^17,18. עם זאת, שיטה זו היא יקרה, זמן רב, ואינה מאפשרת להבחין כראוי בין regioisomers PP-InsP הקשורים. יתר על כן, [³H]-אינוזיטול תיוג אינו לוקח בחשבון סינתזה אנדוגנית של אינוזיטול מגלוקוז. שיטה מבוססת אלקטרופורזה בג'ל פוליאקרילאמיד (PAGE) היא חלופה זולה המיושמת באופן נרחב אך מוגבלת ברגישותה 19,20,21,22^. פורסמו גישות אחרות הנמנעות מתיוג רדיו, כולל כרומטוגרפיית יונים ואחריה נגזרת לאחר עמודה גילוי UV²³, כרומטוגרפיית אינטראקציה הידרופילית (HILIC)24, או חילופי אניונים חלשים (WAX) בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (MS)²⁵. עם זאת, הם אינם (עדיין) בקנה אחד עם הפרוטוקול הקלאסי [³H]-אינוזיטול SAX-HPLC.

לאחרונה, אלקטרופורזה נימית אלקטרוספריי יינון מסה ספקטרומטריה (CE-ESI-MS) הוצגה כאסטרטגיה טרנספורמטיבית לניתוח של מטבוליזם InsPs ו- PP-InsPs, העונה על כל הדרישות שנדונו לעיל¹⁶. בשילוב עם מיצוי InsP המתקדם הנוכחי על ידי חומצה פרכלורית ואחריו העשרה עם חרוזי טיטניום דו-חמצני²⁶, CE-ESI-MS הצליח בכל אורגניזם שנבדק עד כה, משמרים ועד צמחים ויונקים. פרופיל סימולטני של InsPs ו- PP-InsPs, כולל כל הרג'ואיזומרים האפשריים, הושג בקלות. תקנים פנימיים יציבים המסומנים באיזוטופים (SIL) אפשרו כמות אבסולוטית מהירה ומדויקת, ללא קשר להשפעות המטריצה. מאחר שטרשת נפוצה יכולה ללכוד הבדלי מסה איזוטופיים, ניתן ליישם את CE-ESI-MS גם כדי לחקור מסלולי סינתזה תאית ממודרים של InsPs ו-PP-InsPs, למשל על-ידי הזנת תאים עם [13 C 6]-מיו-אינוזיטול או [¹³C ₆]-D-גלוקוז.

המתואר כאן הוא פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב עבור הכמות המוחלטת של PP-InsPs ו- InsPs מתאי יונקים על ידי CE-ESI-MS. מלבד האיזומר העיקרי של 5-PP-InsP 5, 1,5-(PP)_{2-InsP 4} ו-1-PP-InsP₅ מכמתים גם הם במחקר זה, למרות השפע הנמוך שלהם. שני קווי תאי HCT116 ממעבדות שונות (NIH, UCL) נחקרים, ומאומת כי תאי HCT116^UCL מכילים רמות גבוהות פי 7 של 1,5-(PP)_{2-InsP 4} מאשר ב- HCT116^NIH, בעוד שריכוזי 5-PP-InsP₅ דומים. בנוסף, סינתזת 1-PP-InsP₅ ב- HCT116^UCL אינה מוגברת באופן משמעותי. כמו כן, העלייה ברמות PP-InsP על ידי חסימת הדה-פוספורילציה שלהם באמצעות נתרן פלואוריד נחקרת באופן כמותי.

Protocol

1. הגדרת מערכת CE-ESI-MS

1. להקים מערכת CE-ESI-MS המורכבת ממערכת CE מסחרית - וספקטרומטר מסה טנדם משולש מרובע, המצויד במקור יינון אלקטרוספריי (ESI) של זרם סילון אג'ילנט (AJS). נדרשת ערכת ריסוס CE-ESI-MS ומשאבת LC איזוקרטית (כרומטוגרפיה נוזלית).
2. חבר את מפצל זרימת הנדן 1:100 (כלול בערכת הריסוס CE-MS) ואת שקע משאבת LC איזוקרטית.
3. ודא כי בקבוקון הכניסה של מערכת CE נמצא באותו גובה כמו קצה המרסס של מנתח המסה.
4. השתמש בתחנת העבודה MassHunter (גרסה 10.1) או בתוכנת MS דומה כדי לשלוט במערכת כולה, וכן לצורך איסוף וניתוח נתונים.

2. הכנת מאגר, נימי דם ומערכת CE-MS

1. הכן חיץ ריצה CE: התאם את ה- pH של אמוניום אצטט של 40 mM ל- 9.0 עם אמוניום הידרוקסיד. מומלץ להשתמש בבקבוק נפחי של 250 מ"ל. סנן את המאגר בגודל 250 מ"ל באמצעות מסנני ממברנה בגודל נקבוביות של 0.2 מיקרומטר. הקפידו להשתמש רק במים טהורים במיוחד שעברו דה-יוניזציה ובריאגנטים ברמה של טרשת נפוצה.
   הערה: ניתן לשמור חיץ זה בטמפרטורת החדר למשך 2-3 שבועות או למשך מספר חודשים במקרר.
2. הכינו את נוזל הנדן: ערבבו 100 מ"ל מים טהורים במיוחד ו-100 מ"ל איזופרופנול בדרגה LC-MS בבקבוק של 250 מ"ל. החלף את נוזל הנדן לפחות פעם בשבוע. הוסף התייחסות מסה לנוזל הנדן בעת שימוש בספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה.
3. התקן נוזל נדן: נקה במהירות של 5 מ"ל/דקה למשך 5 דקות והגדר את קצב הזרימה על 1 מ"ל/דקה (10 μL/min לתוך מרסס CE-MS). לחץ המשאבה יהיה בערך 180 בר. ודא שצינורות המיחזור מתחברים בחזרה לבקבוק נוזל הנדן כדי לעשות שימוש חוזר בממס.
4. הכן נימי: רכוש נימי CE-MS (50 μm i.d. ו- 365 μM o.d. באורך של 125 ס"מ) עם חלון זיהוי UV. המשתמש יכול גם להשיג הרבה יותר זול נימי סיליקה התמזגות בר ממפיצים מיוחדים. חותכים נימי באורך של 100 ס"מ. חותכים כראוי את שני הקצוות הנימיים עם חותך עמוד נימי עם להב יהלום מסתובב ומסירים 2-3 ס"מ של ציפוי פולימיד משני הקצוות עם מצית. נקו את המשטח הנימי עם איזופרופנול.
5. התקן נימי: התאם את הנימים לקלטת CE-MS. לחץ על כפתור שינוי קלטת והתקן את הקלטת במכשיר CE. קצה הכניסה של הנימים נמוך בכ-2 מ"מ מהאלקטרודה. ודא שקצה הכניסה נמוך משטח הדגימה במהלך תהליך ההזרקה.
6. הפעלת נימי: לפני השימוש הראשון, יש לשטוף את הנימים עם 1 M NaOH, לאחר מכן מים למשך 10 דקות, וחיץ ריצה CE למשך 15 דקות.
7. הכנס את הקצה הנימי למרסס CE-MS: הכנס בעדינות את הנימי למרסס CE-MS וודא שהקצה הנימי בולט כ-0.1 מ"מ מקצה המרסס. הקפידו לבצע כוונון מדויק של קצה השקע הנימי באמצעות זכוכית מגדלת ובורג הכוונון במרסס. החזירו את המרסס למקור היונים והימנעו מלגעת בבורג הכוונון. ה- MS נמצא במצב המתנה בעת ביצוע פעולה זו.
8. בדוק את ספריי ESI: בדוק את היציבות של מרסס ESI במצב סריקה מלאה. התנודתיות של סך האלקטרופרוגרמות של היונים חייבת להיות בטווח של 5%.
9. בצע הרצת בדיקה עם תקני InsP: השתמש בתערובת של 2 μM InsP_{3-InsP 8} תקנים (מותאם על ידי ^{כמות 31}P NMR^15,27) עבור ריצות בדיקה עם זריקה ב 50 mbar עבור 10 שניות (10 nL). הגדר את הפרמטרים המפורטים של ESI ו- MS כפי שמוצג בטבלה 1. זרם CE הוא בערך 26 μA. רוחב השיא הוא סביב 0.4-0.5 דקות. ודא שיחס האות לרעש מגיע ל-400 לפחות.

3. מיצוי פוספטים מסיסים של אינוזיטול מתאי יונקים

הערה: תאי HCT116^NIH היו מתנה חביבה מסטיבן שירס²⁸. תאי HCT116^UCL היו ממעבדה²⁶ של סאיארדי.

1. זריעת תאים
   1. תרבית תאי HCT116^NIH או HCT116^UCL ב-T75 צלוחיות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של CO₂ עם לחות גבוהה ב-5% (המכונה גם תנאים סטנדרטיים) במדיום הנשר המעובד (DMEM) של דולבקו, בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS).
   2. יש לשטוף את תרביות המלאי HCT116^NIH ו-HCT116^UCL עם תמיסות מלח עם מאגרי פוספט (PBS) (5 מ"ל) ולדגור על התאים עם חומצה טטרצטית טריפסין-אתילנדיאמין (EDTA) (3 מ"ל, 0.25%) בתנאים סטנדרטיים עד לניתוקם מוחלט. להרוות את פעילות הטריפסין על ידי הוספת מדיום (7 מ"ל), לאסוף את התאים לתוך צינור צנטריפוגה, צנטריפוגה (200 x גרם, 3 דקות).
   3. הסר את הסופרנטנט ושלח את התאים במדיום (10 מ"ל). לספור את התאים ולקבוע את הכדאיות באמצעות הרחקה כחולה טריפאן.
   4. זרעו את התאים (6 מיליון תאי HCT116 בכל בדיקה) לצלחת של 150 מ"מ והתאימו 20 מ"ל של תרבית תאים בסך הכל. מערבבים מראש את המדיום ואת התאים בצינור צנטריפוגה לפני הזריעה כדי להשיג חלוקה שווה של התאים בצלחת. הכן מנה מקבילה כאשר נדרש נורמליזציה לפי מספר התא.
   5. תרבית את התאים בתנאים סטנדרטיים במשך 72 שעות. התאים יגיעו לכ-80%-90% מפגש.
2. אפנון רמות הפוספט של אינוזיטול עם NaF וקצירת תאים
   1. טיפול NaF: יש להוסיף NaF (10 מ"מ) שעה אחת לפני הקטיף למדיום. מערבבים את המדיום על ידי מערבולת הצלחת/פיפטינג ודוגרים על התאים למשך 60 דקות בתנאים סטנדרטיים.
   2. לאחר טיפול NaF, הסר את המדיום מהתאים והנח את התאים על קרח.
   3. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS (5 מ"ל, 4 מעלות צלזיוס) ולהסיר את PBS לחלוטין מן הכלים.
   4. הוסף חומצה פרכלורית (PA) (1 מ"ל, 1 מ', 4 °C ). הקפידו לכסות את כל פני השטח ב-PA (התאים יהפכו לבנים ככל שהחלבונים יזרזו). דגירה של התאים במשך 10 דקות על שולחן הטיה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   5. לאסוף PA לתוך צינור צנטריפוגה ולהסיר את הפסולת המזהמת על ידי צנטריפוגה (17,000 x גרם, 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס). הוסף את הסופרנאטנט לחרוזי TiO₂ המוכנים למשיכת InsPs.
   6. לשטוף את המנה לאחר מיצוי פעמיים עם PBS (5 מ"ל, r.t.) עבור deacidification; להסיר PBS לחלוטין מן המנה.
   7. לבודד את החלבונים שעל הצלחת באמצעות תוספת של חיץ תזה תאית (1.5 מ"ל, r.t.; 0.1% נתרן דודציל סולפט [SDS] ב-0.1 M NaOH). דגרו את המנה במשך 15 דקות על שולחן הטיה ב- r.t. מעבירים את התא ליזאט לתוך צינור צנטריפוגה וצנטריפוגה (17,000 x גרם, 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס). יש לאחסן את הסופר-נטנט בטמפרטורה של -80°C עד לקביעת ריכוז החלבון באמצעות בדיקת חלבון DC באמצעות אלבומין בסרום בקר כתקן כיול (בדרך כלל, מנה אחת של 150 מ"מ מכילה כ-10 מ"ג חלבונים).
   8. קביעת מספרי תאים ממנות מקבילות: קצירת התאים של המנה המקבילה באמצעות טריפסין כמתואר בשלב 3.1.2 (השתמש בטריפסין-EDTA של 5 מ"ל עבור צלחת 150 מ"מ) והסר את המדיום. החזירו את כדור התא ב-PBS (5 מ"ל), ערבבו כראוי וספרו את התאים. בצע שלב זה ממש לפני הקציר באמצעות מרווה ישירה כדי לקבל ספירות תאים מייצגות. בנוסף, מדוד את נפח התאים בשיטה מתאימה (למשל, באמצעות מכונה רב-ממדית).
3. העשרת TiO₂ של פוספטים אינוזיטול
   הערה: כדי למנוע פירוק חומצי של תרכובות זרחניות, בצע את כל שלבי ההעשרה עד לאלוטציה על קרח, וקצר את כל הריאגנטים ל -4 מעלות צלזיוס. שמור את הזמן למיצוי למינימום (1.5-2 שעות). בצע את כל שלבי החילוץ עם 1 M PA.
   1. הכנת חרוזים: לשטוף TiO₂ חרוזים (5 מ"ג לדגימה) עם ddH₂O (1 מ"ל) וצנטריפוגה (3,500 x גרם, 1 דקה, 4 °C). הסר ddH₂O ולשטוף את החרוזים עם PA (1 מ"ל). הסר PA על ידי צנטריפוגה (3,500 x גרם, דקה אחת, 4 °C). יש להשעות את החרוזים ב-PA (50 μL לדגימה).
   2. הוסף את הסופרנטנט המכיל תרכובות זרחניות (השווה סעיף 3.2, שלב 3.2.5) לתרחיף החרוזים, למערבולת, ולאחר מכן סובב את הדגימה למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
   3. צנטריפוגה של הדגימה (3,500 x גרם, 1 דקה, 4 מעלות צלזיוס) ולהשליך את supernatant. לשטוף את החרוזים עם PA (500 μL) וצנטריפוגה (3,500 x גרם, 1 דקה, 4 °C). יש להשליך את הסופר-נטנט ולחזור על שלב הכביסה.
   4. הוסף NH₄OH (200 μL, 3%) לחרוזים ולהחייאה. סובב את הדגימה במשך 5 דקות ב- r.t.
   5. צנטריפוגה את הדגימה (3,500 x גרם, 1 דקה) ולהעביר את supernatant לתוך צינור צנטריפוגה חדש.
   6. חזור על שלבים 3.3.4 ו- 3.3.5 ושלב את האלואנטים. השליכו את החרוזים.
   7. צנטריפוגה את eluents המשולבים (17,000 x גרם, 1 דקה, 4 °C) כדי להסיר כל שאריות מסיסות.
   8. יבש לחלוטין את הסופרנטנט תחת אידוי ואקום (70 דקות, 60 מעלות צלזיוס, V-AQ). יש להוסיף ddH₂O (50 μL) לתמציות המיובשות המכילות InsPs. מערבולת לערבב את הדגימה עד להמסה מלאה. אחסן את הדגימה בטמפרטורה של -20 °C עד לניתוח CE-ESI-MS.

4. ביצוע ריצות CE-ESI-MS

1. הכינו תערובת של תקנים פנימיים המכילים 40 μM [13 C 6]1,5-(PP)_{2-InsP 4}, 80 μM [13 C 6]5-PP-InsP 5, 80 μM [13 C 6]1-PP-InsP 5, 400 μM [13 C 6]InsP 6 ו-400 μM [¹³C 6]Ins(1,3,4,5,6)P ₅. לקבוע את הריכוזים של תמיסות SIL IS על ידי NMR ^{כמותי של 31}P ו- ¹H, בעזרת תקן ייחוס מוסמך, כלומר, חומצה זרחתית.
   הערה: כל התקנים הפנימיים של SIL (IS) הנ"ל עם טוהרים גבוהים מ-96% סונתזו וסופקו על ידי קבוצת פידלר^15,27. בדומה לנוקלאוטידים, ה-IS האלה יכולים לשאת מולקולות רבות של מים גבישיים ויוני נגד מגוונים. במקום לשקול את החומר ולחשב את הריכוז, מומלץ לקבוע ריכוז של ¹³C₆ פתרונות סטנדרטיים על ידי NMR ^{כמותי 31}P.
2. מערבבים 10 μL של הדגימה עם 0.5 μL של תערובת תקנים פנימיים בבקבוקון מדגם CE. 2 μM [13 C 6]1,5-(PP)_2-InsP 4, 4 μM [13 C 6]5-PP-InsP 5, 4 μM [13 C 6]1-PP-InsP 5, 20 μM [13 C 6]InsP 6, ו-20 μM [¹³C 6]Ins(1,3,4,5,6)P ₅ הם הריכוזים הסופיים בתוך הדגימות.
3. בעת שימוש במערכת החידוש, לחץ על כפתור שינוי בקבוק, הכנס את 250 מ"ל מוכן של CE פועל חיץ לתוך בקבוק אלקטרוליטים, ולחץ על צינורות נקיים. שמור את מחט חידוש בבקבוקון מים.
4. הגדר פרמטרים של ESI ו- MS כפי שמוצג בטבלה 1. מטב את פרמטרי המקור באמצעות ממטב מקור עם תערובת של תקני פוליפוספט אינוזיטול. השג את הגדרות ניטור התגובות המרובות (MRM) באמצעות Masshunter Optimizer עם כל התקנים. התאם את הגדרות ESI ו- MS/MS עבור מכשור שונה.
5. בצע ריצה עבור תמציות InsP ובדוק את התוצאה (איור 2). קבעו רצף כשיש דוגמאות נוספות.
6. תן ל-MS להיות במצב המתנה לאחר המדידות. אין לכבות את משאבת ה-LC. זרימת נוזל הנדן מגנה על מחט המרסס. החלף את מרסס CE-ESI-MS במרסס LC-ESI-MS כאשר אין אספקת נוזל נדן.

5. ניתוח נתונים

1. פתח את תוכנת ניתוח כמותי (עבור QQQ), צור אצווה עבור כל הדגימות.
2. צור שיטה חדשה מנתוני MRM שנרכשו. הגדר את ה- INSPS [¹³C₆] כסטנדרטים פנימיים - (ISTD). בדוק את הגדרת תרכובת MRM, הגדרת זמן שמירה, הגדרת ISTD, הגדרת ריכוז והגדרת מזהה. העבר את האימות וצא כדי להחיל את השיטה על האצווה הנוכחית. שמור את השיטה.
3. בדוק אם כל שיא באצווה משולב כראוי; אחרת, שלב את השיא באופן ידני.
4. ייצא את התוצאות לגיליון אלקטרוני. בצע את הכמות של אינוזיטול (פירו)פוספטים על ידי השוואת תגובת השיא האנליטית עם תגובת השיא המתאימה של SIL IS עם ריכוזים ידועים. עקומות כיול תיאורטיות וניסיוניות מוצגות בטבלה 2 עבור 5-PP-InsP 5, InsP 6 ו- Ins(1,3,4,5,6)P ₅ עם הטווח הליניארי.
   הערה: התנאי המקדים להפעלת עקומת כיול תיאורטית הוא שימוש בתבנית איזוטופית איכותית של אנליטים ממוקדים ובריכוז אמין. הערך את הטווח הליניארי. עקומת כיול חיונית לכמות מוחלטת כאשר הרכישה המלאה של התקנים האיזוטופיים הנ"ל אינה מעשית.
5. עם הריכוז הנמדד בתמיסת תמצית InsP ונפחו, חשב את הכמויות המוחלטות. יתר על כן, לנרמל את הסכום על ידי ספירת תאים או תוכן חלבון. חשב את הריכוז התאי בהתבסס על ספירת תאים ונפח תא ממוצע של HCT116 (1.68 fL).

תוצאות

התוצאות המוצגות כאן נועדו להמחיש את הפוטנציאל של ניתוח CE-ESI-MS. הנתונים המדווחים מתארים ריצת CE-ESI-MS ללא רבב מבחינה טכנית. ראשית, מוצגת תערובת של תקני אינוזיטול פירופוספט (איור 1) ותמצית תאי יונקים (איור 2). שנית, ניתנת השוואה של שני קווי תאים מסוג HCT116 (איור 3) ותאי HCT116 שטופלו ב-NaF (איור 4).

אלקטרופרוגרמות יונים מופקות (EIEs) של תקני אינוזיטול (פירו)פוספט בריכוז של 2 μM מוצגות באיור 1. מטבוליזם של אינוזיטול pyrophosphates ביונקים עם מבנים פשוטים שלהם מוכנס. ארבעת הפירופוספטים של אינוזיטול ביונקים, 1,5-(PP)_2-InsP 4, 5-PP-InsP 5, 1-PP-InsP 5 ו-5-PP-Ins(1,3,4,6)P ₄ נבדלים היטב באמצעות השיטה המתוארת. הרצת CE-ESI-MS של HCT116^UCL מתוארת באיור 2. בעזרת תקנים פנימיים יציבים המסומנים באיזוטופים (SIL), ניתן להשיג בקלות כמות מוחלטת על ידי השוואת תגובת האות עם ה-SIL המחורץ של הריכוז הידוע. מוצגים ה- EIEs המשולבים של הפוספט של אינוזיטול מ- InsP₅ ל- (PP)_{2-InsP 4} ו- EIEs לא משולבים של התבניות האיזוטופיות שלהם. RSDs של כל האנליטים משש חזרות טכניות הם בטווח של 4%. עם הריכוז הנמדד ואת נפח התמציות, כמות האנליטים ניתן לחשב. עם ספירת התאים ונפח התא, או תכולת החלבון, ריכוז תאי מוחלט (μM) או כמות מנורמלת על ידי תכולת חלבון (pmol/mg חלבון) הם בדרך כלל התוצאות הסופיות של ניתוח כזה.

על פי מחקר קודם, שתי קבוצות של תאי HCT116 מתפצלים יש וריאציה של רמות InsP 8, תאי HCT116^UCL מכילים רמות גבוהות פי 6 של InsP₈ מאשר תאי HCT116^{NIH 29}. בשיטת CE-MS, ניתן לכמת בקלות 1,5-(PP)_{2-InsP 4} ב-HCT116 NIH (איור 3), ותאי HCT116 UCL מכילים רמות גבוהות פי 7 של InsP₈ מאשר ב-HCT116 ^NIH. בנוסף, הצטברות משמעותית של 1,5-(PP)_{2-InsP 4} בתאי HCT116^UCL מקבילה לעלייה משמעותית של 1-PP-InsP₅, המוצגת כעת באופן כמותי באיור 3.

רמות PP-InsPs עולות על ידי עיכוב הדה-פוספורילציה שלהם באמצעות נתרן פלואוריד. ניתוח CE-ESI-MS של תאי HCT116^NIH שטופלו ב-NaF הדגים את הגובה של -5-PP-InsP 5 יחד עם ירידה ב-InsP 6 והופעה של 5-PP-Ins(1,3,4,6)P 4 (איור 4). חוץ מזה, הגובה של רמות InsP₈ מורגש, בעוד 1-PP-InsP₅ יורד במידה מסוימת. 1-PP-InsP₅ אינו נעדר לחלוטין ב-HCT116^NIH שטופל ב-NAF, אך בעיקר תחת מגבלת הגילוי או הכמות.

איור 1: אלקטרופרוגרמות יונים טיפוסיות (EIEs) של תקני אינוזיטול (פירו)פוספט בניתוח CE-ESI-MS באמצעות הפרוטוקול המתואר. הריכוז של כל אנאליט הוא 2 μM. נפח הדגימה המוזרק הוא בערך 10 nL עם זריקה ב 50 mbar במשך 10 שניות. מוסיף להראות את חילוף החומרים של אינוזיטול pyrophosphates ביונקים. IPPK: אינוזיטול פנטקיספוספט 2-קינאז, IP6K: אינוזיטול הקסקיספוספט קינאז, PPIP5K: דיפוספינוזיטול פנטקיספוספט קינאז, DIPP1: דיפוספינוזיטולפוליפוספט פוספוהידרולאז 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: פרופיל InsP מייצג של תאי HCT116 UCL. (A) EIEs של האינוסיטול הראשי (פירו)פוספטים ^{ב-HCT116 NIH} ו-SIL ISs 2 μM [13 C 6]1,5-(PP)2-InsP 4 (1), 4 μM [13 C 6]5-PP-InsP 5 (₂), 4 μM [13 C 6]1-PP-InsP₅ (3), 20 μM [¹³C 6]InsP ₆ (₄), ו-20 μM [¹³C 6]Ins(1,3,4,5,6)P 5 (₅). התוספות מראות שש חזרות טכניות של ניתוח InsP על ידי CE-ESI-MS, הנתונים מוצגים כאמצעי ±SD. (B) ריכוז תאי של PP-InsPs ו- InsPs בקווי תאים אנושיים HCT116^UCL ו- (C) PP-InsPs ו- InsPs כמות מנורמלת על ידי תכולת חלבון. נתונים הם אמצעים ± SEM משלושה ניסויים עצמאיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: שונות ברמות InsP₈ בין שני תאי HCT116 מתפצלים. (א) EIEs של אינוזיטול פירופוספט ב- HCT116 ^UCL ו- HCT116^NIH. InsP₈ ב-HCT116^UCL נפוץ יותר באופן ניכר מאשר ב-HCT116^NIH. (B) היחס בין אינוזיטול פירופוספט ל-InsP₆ (%) בשני תאי HCT116. תאי HCT116^UCL מכילים רמות גבוהות פי 7 של InsP₈ בהשוואה ל-HCT116^NIH, בעוד שרמות 5-PP-InsP₅ שוות. נתונים הם אמצעים ± SEM משלושה ניסויים עצמאיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: רמות אינוזיטול (פירו)פוספט בתאי HCT116^NIH, עם טיפול ב-NAF. (A) EIEs של אינוזיטול (פירו)פוספט ב- HCT116^NIH עם טיפול בנתרן פלואוריד (NaF, 10 mM). רמות של אינוזיטול פירופוספט כולל 1,5-(PP)_2-InsP 4, 5-PP-InsP 5 ו-5-PP-Ins(1,3,4,6)P₄ עולות באמצעות חסימת הדה-פוספורילציה שלהם באמצעות NaF. (B) רמות אינוזיטול (פירו)פוספט (הכמויות מנורמלות לפי תכולת חלבונים) בתאי HCT116^NIH שלא טופלו וטופלו ב-NaF. נתונים הם אמצעים ± SEM משלושה ניסויים עצמאיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 1: הגדרות פרמטר CE-ESI-MS. פרמטרים של מקור ופרמטרים של iFunnel ממוטבים על-ידי Source ו-iFunnel Optimizer. הגדרות פרמטר MSM עבור אינוזיטול (פירו)פוספטים ממוטבות על ידי MassHunter Optimizer. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: משוואת רגרסיה תיאורטית וניסויית. הריכוז של [13 C 6]5-PP-InsP 5 [13 C 6]InsP 6, ו-[¹³C 6]Ins (1, 3, 4, 5, ₆)P₅ הוא 4 μM, 20 μM ו-20 μM, בהתאמה. עבור משוואת הרגרסיה, ריכוז 5-PP-InsP 5 הוא 0.04 μM, 0.1 μM, 0.2 μM, 0.4 μM, 1 μM, 2 μM, 4 μM, 8 μM, 16 μM, 24 μM. InsP 6 ו- Ins (1, 3, 4, 5,₆)P 5 הריכוז הוא 0.2 μM, 0.5 μM, 1 μM, 2 μM,₅ μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 120 μM. x הוא ריכוז, y הוא (שטח InsP)^12C/(שטח InsP)^13C. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Discussion

מוצגת כאן שיטה מעשית ורגישה לכמות של אינוזיטול pyrophosphates טעון מאוד בתאי יונקים. שילוב גישת ניתוח זו עם מיצוי InsP המתקדם הנוכחי עם חומצה פרכלורית ואחריו העשרה עם TiO₂, ניתוח CE-ESI-MS יש יתרונות חסרי תקדים. לגבי התפוקה, הרגישות, היציבות, הכמות האבסולוטית, זיהוי האיזומרים והתלות במטריצה, שיטה זו בולטת בהשוואה לגישות אחרות. פרוטוקול זה ישים לתאי יונקים, אך אכן אסטרטגיה זו מצליחה בדגימות רבות ושונות (למשל, שמרים, צמחים, טפילים, רקמות עכבר וכו ').

פרוטוקול המיצוי המיושם משחזר באופן מלא PP-InsPs ו- InsP₆ מתמציות תאי יונקים^16,19. הוא גם יחלץ מטבוליטים אניוניים רבים אחרים, במיוחד מינים המכילים פוספטים, כגון פוספטים סוכר ונוקלאוטידים. הערכה של התאוששות ופירוק עבור analytes של המשתמש עם פרוטוקול זה יהיה צורך.

באופן כללי, מערכת CE-ESI-MS פועלת בצורה חלקה ויכולה להכיל כ-200 דגימות מדי שבוע באמצעות פרוטוקול זה. שלא כמו HPLC, עם זאת, CE נחשב כשיטה עבור מומחים ואנשים מיוחדים במשך זמן רב, אשר הגביל את השוק שלה והגביל את היישום שלה. לפיכך, מכשיר CE-ESI-MS נעדר בדרך כלל בפקולטות אנליטיות. אנשים שרוצים לבצע ניתוח CE-ESI-MS כנראה חסרים ניסיון CE וישקיעו יותר זמן בפתרון בעיות. כאן, השלבים הקריטיים מודגשים. בראש ובראשונה איכות החתך הנימי. הרגישות והיציבות של ספריי ESI מסתמכות בעיקר על חתך נימי ממדרגה ראשונה. שנית, קצה היציאה הנימית צריך להיות בדיוק 0.1 מ"מ מקצה המרסס. מחט המרסס ונימי CE צריכים להיות בכיוון הצירי. איכות תרסיס ESI היא קריטית לכמות; יש לבצע ריצות טכניות כדי להעריך את יכולת החזרה.

עם הפרוטוקול המתואר, גבול הכמות (LOQ) עבור PP-InsPs הוא 40 ננומטר עם זריקה ב 50 mbar עבור 10 שניות (10 nL). ישנן מספר גישות כדי להגדיל עוד יותר את הרגישות לשיטה. ראשית, זריקה ב 100 mbar עבור 20 s (40 nL) עדיין יביא לצורת שיא טובה ורזולוציה מספקת עבור regioisomers 5-PP-InsP 5 ו 1-PP-InsP₅. שנית, תמציות InsP ניתן להמיס בכמות קטנה יותר של מים. שלישית, ניתן להאריך את זמן השהייה בעת שימוש בפחות מעברי MRM לכמות. בנוסף, מקור יונים CE-MS המשתמש בזרימת נוזל נדן נמוכה במיוחד יגדיל משמעותית את הרגישות.

מאגר CE פועל עם pH 9 מספק את הרזולוציה הטובה ביותר בין InsP_{6-InsP 8}. כאשר מגדילים את ה- pH ל -9.7, הרזולוציה בקרב InsP_{3-InsP 6} תשתפר באופן משמעותי. בשל הרזולוציה המצוינת, אורך נימי קצר יותר של 72 ס"מ מומלץ להגדלת התפוקה עוד יותר. חוץ מזה, טמפרטורת קלטת CE גבוהה יותר ב 40 מעלות צלזיוס מקטינה את צמיגות המאגר האלקטרופורטי מימי ומאיצה את תנועתם תחת EOF. על פי דרישות מחקר שונות, שינויים בשיטה זו יכולים להקל עוד יותר על ניתוח InsPs ו- PP-InsPs. לכן, לפרוטוקולי CE-ESI-MS המתוארים יש פוטנציאל לפתוח אפיקי מחקר חדשים למשפחה רבת פנים זו של מולקולות איתות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
1.5 mL microcentrifuge tubes	Greiner Bio-One	616201	-
15 cm tissue culture dishes	Thermo Fisher	168381	-
2.0 mL microcentrifuge tubes	Greiner Bio-One	623201	-
50 mL centrifuge tubes	Greiner Bio-One	227261	-
96-well plates	Thermo Fisher	260836	for the DC protein assay
CE fused silica capillary	CS Chromatographie	105180	50 µM i.d. 360 µM o.d.
Pipette tips	Starlab	I1054-0001, S1111-6701, S1113-1700, S1111-3700	10 mL, 1000 µL, 200 µL, 10 µL pipette tips
Serological pipets	TPP	94550, 94525, 94010, 94005	50 mL, 25, mL, 10 mL, 5 mL serological pipettes
T75 flasks	TPP	90076	-
Chemicals and Reagents
NaOH	AppliChem	A6829,0500	sodium hydroxide pellets for molecular biology, for preparation of cell lysis buffer
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200056	-
Ammonium acetate	Thermo Fisher	1677373	HPLC grade
BSA	Thermo Fisher	23209	albumin standard (2.0 mg/mL) for standard curve preparation
DC protein assay	Biorad	5000116	DC protein assay reagents package
DMEM	Gibco	41966029	high glucose, pyruvate
FBS	Gibco	10270106, 10500064 (heat inactivated)	10270106 for HCT116UCL, 10500064 for HCT116NIH
Isopropanol	Carl Roth	AE73.2	99.95% LC-MS grade
NH4OH, 10%	Carl Roth	6756.1	for preparation of 3% NH4OH
PBS	Gibco	10010015	-
Perchloric acid, 70%	Carl Roth	9216.1	for preparation of 1 M perchloric acid
SDS	SERVA	20760.02	for preparation of cell lysis buffer
Sodium fluoride	Sigma Aldrich	S7920	-
TiO2 beads	GL Sciences	5020-75000	5 µm particle size
Trypan blue solution	Gibco	15250061	trypan blue stain (0.4%)
Ultrapure (Type 1) water	Milli-Q	ZRQSVP3WW	model: Direct-Q 3 UV Water Purification System
Equipment
Analytical balance	Mettler Toledo	30105893	model: XPE26; for weighing of beads (5-6 mg per sample)
Automated cell counter	Logos Biosystems	L40002	model: LUNA-II Automated Cell Counter
Benchtop centrifuge	Hettich	1401	model: UNIVERSAL 320
Benchtop centrifuge with cooling	VWR	521-1647P	model: Microstar 17R
CE system	Agilent	G7100A	-
CE/MS Adapter Kit	Agilent	G1603A	-
CE/MS Sprayer Kit	Agilent	G1607A	-
Cell counting slides	Logos Biosystems	L12001	LUNA Cell Counting Slides
Centrifugal evaporator	Eppendorf	5305000304	model: Concentrator plus complete system
ESI source	Agilent	AJS ESI	-
Super Support Film	Nisshin EM Co. Ltd, Tokyo	647
Humidified incubator	Binder	9040-0088	model: CB E6.1, for cultivation of mammalian cells
Ice box	-	-	should provide enough space for samples, dishes, etc.
Isocratic LC system	Agilent	G7110B 1260 Iso Pump	model: Infinity II Quaternary system
MSD	Agilent	G6495C	triple quadrupole
Multiplate reader	Tecan	30086375	model: SPARK 10 M
Pipette filler	Thermo Fisher	10072332	for serological pipettes
Pipettes	Brand	705884, 705880, 705878, 705872, 705870	various pipettes
Rotator	Labnet	H5500	model: Mini LabRoller Rotator
Shortix capillary column cutter	SGT	S0020	-
Test tube shaker (vortex mixer)	Carl Roth	HXH6.1	model: Rotilabo-Mini Vortex
Tilt table	Labnet	S0600	model: EDURO MiniMix Nutating Mixer
Water bath	Thermo Fisher	FSGPD05	model: Isotemp GPD 05
Software
MassHunter Workstation	Agilent	Version 10.1	-
MassHunter Workstation LC/MS Data Acquisition	Agilent	Version 10.1	-
MassHunter Workstation Optimizer	Agilent	Version 10.1	-
MassHunter Workstation Qualitative Analysis	Agilent	Version 10.0	-
QQQ Quantitaion Analysis	Agilent	Version 10.1	-