Абсолютное количественное определение пирофосфатов инозитола методом масс-спектрометрии капиллярного электрофореза Электрораспылительная ионизация масс-спектрометрии

Резюме

Описана процедура электрораспылительной ионизационной масс-спектрометрии капиллярного электрофореза для абсолютного количественного определения пирофосфатов инозитола из экстрактов клеток млекопитающих.

Аннотация

Пирофосфаты инозитола (PP-InsPs) являются важной группой внутриклеточных сигнальных молекул. Полученные из инозитолфосфатов (InsPs), эти молекулы характеризуются присутствием по меньшей мере одного энергичного пирофосфатного фрагмента на мио-инозитоловом кольце. Они повсеместно существуют у эукариот и действуют как метаболические мессенджеры, исследующие фосфатный гомеостаз, чувствительность к инсулину и заряд клеточной энергии. Из-за отсутствия хромофора в этих метаболитах, очень высокой плотности заряда и низкой численности, их анализ требует радиоактивного индикатора, а значит, он запутанный и дорогой. Здесь в исследовании представлен подробный протокол для выполнения абсолютного и высокопроизводительного количественного определения пирофосфатов инозитола из клеток млекопитающих с помощью масс-спектрометрии капиллярного электрофореза с электрораспылением ионизации (CE-ESI-MS). Этот метод позволяет проводить чувствительное профилирование всех биологически значимых видов PP-InsPs в клетках млекопитающих, что позволяет проводить базовое разделение региоизомеров. Представлены абсолютные клеточные концентрации PP-InsPs, включая второстепенные изомеры, и мониторинг их временных изменений в клетках HCT116 в нескольких экспериментальных условиях.

Введение

С момента первоначального открытия пирофосфатов мио-инозитола (PP-InsPs) в 1993 ^{году 1,2} был достигнут значительный прогресс в выяснении их биосинтеза, оборота и функций 3. Пирофосфаты инозитола повсеместно встречаются в эукариотических клетках⁴ и служат метаболическими сигнальными молекулами, критически участвующими, например, в фосфатном гомеостазе ^5,6, ^{чувствительности} к инсулину⁷, колебаниях кальция ^8,9, везикулярном трафике¹⁰, апоптозе¹¹, репарации ДНК¹², иммунной сигнализации¹³ и др. Множество важных процессов под контролем пирофосфатов инозитола требует более глубокого понимания их клеточного изобилия, флуктуации и локализации.

Хотя InsPs и PP-InsPs привлекли внимание во всех дисциплинах, анализ их количества обычно выполняется с использованием метода, разработанного в 80-х годах, состоящего из маркировки клеток тритиированным инозитолом, разрешения извлеченных PP-InsPs с помощью сильной анионообменной хроматографии Sax-HPLC с последующим подсчетом сцинтилляций. Новые методы, основанные на масс-спектрометрии, по-прежнему сталкиваются со значительными проблемами: пирофосфаты инозитола с восемью фосфатными установками содержат эфиры фосфатов и ангидриды, что приводит к значительному отрицательному заряду и потенциальным потерям фосфатов во время ионизации. Существует четыре основных типа PP-InsPs, обнаруженных у млекопитающих (рисунок 1): 1,5-(PP)2-InsP₄ (или 1,5-InsP₈), 5-PP-InsP₅ (или 5-InsP₇), 1-PP-InsP₅ (или 1-InsP₇) и 5-PP-Ins(1,3,4,6)P₄ (или 5-PP-InsP₄)^3,14. Физиологические уровни PP-InsPs обычно находятся в нано- и низкомикромолярном диапазоне, причем 5-PP-InsP₅ является наиболее распространенным с клеточными концентрациями 0,5 - 5 мкм. 1,5-(PP)2-InsP ₄ и 1-PP-InsP₅, как полагают, составляют до 10% пула 5-PP-InsP₅ и их трудно отследить во многих клетках¹⁵. 5-PP-InsP₄ со свободной группой OH еще ниже по количеству и обычно обнаруживается только тогда, когда фосфатные гидролазы ингибируются фторидом натрия (NaF)¹⁶.

Высокая плотность заряда PP-InsPs затрудняет их разделение, а появление региоизомеров PP-InsP еще больше усложняет эти усилия. В результате большинство экспериментов опирались на количественное определение метаболической радиоактивной маркировкой клеток с использованием [³H]-инозитола, так как фон из матрицы исключен и высокая чувствительность достигается^17,18. Однако этот метод является дорогостоящим, трудоемким и не позволяет правильно различать родственные PP-InsP региоизомеры. Кроме того, маркировка [³H]-инозитола не учитывает эндогенный синтез инозитола из глюкозы. Метод электрофореза на основе полиакриламидного геля (PAGE) является широко применяемой недорогой альтернативой, но ограниченной по своей^{чувствительности} 19,20,21,22. Были опубликованы другие подходы, избегающие радиомаркировки, включая ионную хроматографию, за которой следует постколоночная дериватизация УФ-детектирования²³, гидрофильная хроматография взаимодействия (HILIC)²⁴ или слабый анионный обмен (WAX) в сочетании с масс-спектрометрией (MS)²⁵. Однако они (пока) не находятся на одном уровне с классическим протоколом [³H]-инозитол SAX-HPLC.

Недавно капиллярная электрофорезная электрораспылительная масс-спектрометрия с ионизацией (CE-ESI-MS) была введена в качестве преобразующей стратегии для анализа метаболизма InsPs и PP-InsPs, отвечающей всем требованиям, рассмотренным выше¹⁶. В сочетании с современной экстракцией InsP хлорной кислотой с последующим обогащением шариками диоксида титана²⁶, CE-ESI-MS преуспел в каждом организме, протестированном до сих пор, от дрожжей до растений и млекопитающих. Было легко достигнуто одновременное профилирование InsPs и PP-InsPs, включая все возможные региоизомеры. Внутренние стандарты со стабильной изотопной маркировкой (SIL) позволили быстро и точно дать абсолютное количественное определение, независимо от матричного воздействия. Поскольку РС может захватывать изотопные различия масс, CE-ESI-MS также может быть применен для изучения компартментированных клеточных путей синтеза InsPs и PP-InsPs, например, путем питания клеток [¹³_C6]-мио-инозитолом или [¹³_C6]-D-глюкозой.

Здесь описан подробный пошаговый протокол для абсолютного количественного определения PP-InsPs и InsPs из клеток млекопитающих CE-ESI-MS. Помимо основного изомера 5-PP-InsP₅, в этом исследовании также количественно определены 1,5-(PP)2-InsP₄ и 1-PP-InsP₅, несмотря на их более низкое содержание. Изучаются две клеточные линии HCT116 из разных лабораторий (NIH, UCL), и подтверждено, что клетки HCT116^UCL содержат в 7 раз более высокие уровни 1,5-(PP)2-InsP₄, чем в HCT116^NIH, в то время как концентрации 5-PP-InsP₅ сопоставимы. Кроме того, синтез 1-PP-InsP₅ в HCT116^UCL достоверно не увеличивается. Также количественно изучается повышение уровня PP-InsP путем блокирования их дефосфорилирования с использованием фторида натрия.

протокол

1. Настройка системы CE-ESI-MS

1. Настройте систему CE-ESI-MS, состоящую из коммерческой системы CE и тройного квадрупольного тандемного масс-спектрометра, оснащенного источником электрораспылительной ионизации (ESI) Agilent Jet Stream (AJS). Необходим комплект опрыскивателя CE-ESI-MS и изократический насос LC (жидкостная хроматография).
2. Подключите разветвитель потока оболочки 1:100 (входит в комплект опрыскивателя CE-MS) и выход изократического насоса LC.
3. Убедитесь, что входной флакон системы CE находится на той же высоте, что и наконечник опрыскивателя анализатора массы.
4. Используйте рабочую станцию MassHunter (версия 10.1) или аналогичное программное обеспечение MS для управления всей системой, а также для сбора и анализа данных.

2. Подготовка буферной, капиллярной и CE-MS системы

1. Подготовьте рабочий буфер CE: Отрегулируйте рН 40 мМ ацетата аммония до 9,0 с гидроксидом аммония. Рекомендуется использовать объемную колбу объемом 250 мл. Фильтруйте буфер 250 мл с помощью мембранных фильтров размером 0,2 мкм. Обязательно используйте только сверхчистую деионизированную воду и реагенты ms-класса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот буфер можно хранить при комнатной температуре в течение 2-3 недель или в течение нескольких месяцев в холодильнике.
2. Приготовьте жидкость для оболочки: смешайте 100 мл сверхчистой воды и 100 мл изопропанола марки LC-MS в бутылке емкостью 250 мл. Меняйте оболочку жидкостью не реже одного раза в неделю. Добавьте эталон массы в оболочку жидкости при использовании масс-спектрометра высокого разрешения.
3. Установите оболочку жидкости: Продувка со скоростью 5 мл/мин в течение 5 мин и установка расхода на уровне 1 мл/мин (10 мкл/мин в опрыскиватель CE-MS). Давление насоса составит около 180 бар. Убедитесь, что трубка для рециркуляции соединяется обратно в бутылку с жидкостью для оболочки для повторного использования растворителя.
4. Подготовьте капилляр: Приобретите капилляр CE-MS (50 мкм в.д. и 365 мкМ в сутки длиной 125 см) с окном обнаружения УФ-излучения. Пользователь также может получить гораздо более дешевые бар-плавленые кварцевые капилляры от специализированных дистрибьюторов. Вырежьте капилляр длиной 100 см. Правильно вырежьте оба конца капилляра капиллярным колонкорезом с вращающимся алмазным лезвием и удалите 2-3 см полиимидного покрытия с обоих концов зажигалкой. Очистите поверхность капилляров изопропанолом.
5. Установка капилляра: сопоставьте капилляр с кассетой CE-MS. Нажмите кнопку Изменить кассету и установите кассету в устройство CE. Входной конец капилляра примерно на 2 мм ниже, чем электрод. Убедитесь, что входной конец находится ниже поверхности образца во время процесса впрыска.
6. Активация капилляра: Перед первым использованием промывайте капилляр 1 M NaOH, затем водой в течение 10 минут и буфером CE в течение 15 минут.
7. Вставьте капиллярный конец в опрыскиватель CE-MS: аккуратно поместите капилляр в опрыскиватель CE-MS и убедитесь, что капиллярный конец выступает примерно на 0,1 мм из наконечника опрыскивателя. Убедитесь, что вы делаете точную регулировку выходного конца капилляра с помощью увеличительного стекла и регулировочного винта в опрыскивателе. Вставьте распылитель обратно в источник ионов и избегайте прикосновения к регулировочному винту. Ms находится в режиме ожидания при выполнении этой операции.
8. Проверьте спрей ESI: Проверьте стабильность опрыскивателя ESI в режиме полного сканирования. Флуктуация общих ионных электроферограмм должна быть в пределах 5%.
9. Выполните тестовый запуск со стандартами InsP: Используйте смесь стандартов InsP 3-InsP₈ (скорректированных по количественным ³¹P ЯМР ^15,27) для тестовых запусков с инъекцией при 50 мбар в течение 10 с (10 нЛ). Задайте подробные параметры ESI и MS, как показано в таблице 1. Ток CE составляет около 26 мкА. Пиковая ширина составляет около 0,4-0,5 мин. Убедитесь, что отношение сигнал/шум достигает не менее 400.

3. Извлечение растворимых инозитолфосфатов из клеток млекопитающих

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки HCT116^NIH были своеобразным подарком от Стивена^{Ширса 28}. Клетки HCT116^UCL были из лаборатории Сайарди²⁶.

1. Посевные ячейки
   1. Культивирование клеток HCT116^NIH или HCT116^UCL в колбах T75 при 37 °C в атмосфере CO₂ с высокой влажностью 5% (далее называемой стандартными условиями) в модифицированной орлиной среде Dulbecco (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS).
   2. Промыть стоковые культуры HCT116^NIH и HCT116^UCL фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) (5 мл) и инкубировать клетки трипсин-этилендиаминовой тетрауксусной кислотой (ЭДТА) (3 мл, 0,25%) в стандартных условиях до полного отделения. Гасит активность трипсина путем добавления среды (7 мл), собирает клетки в центрифужную трубку и центрифугу (200 х г, 3 мин).
   3. Удалить супернатант и повторно суспендировать клетки в среде (10 мл). Подсчитайте клетки и определите жизнеспособность с помощью исключения синего трипана.
   4. Посейте клетки (6 миллионов клеток HCT116 на анализ) в тарелку толщиной 150 мм и отрегулируйте в общей сложности 20 мл клеточной питательной среды. Предварительно смешайте среду и клетки в центрифужной трубке перед посевом, чтобы добиться равного распределения клеток в чашке. Приготовьте параллельное блюдо, когда требуется нормализация по номеру ячейки.
   5. Культивировать клетки в стандартных условиях в течение 72 ч. Клетки достигнут около 80%-90% слияния.
2. Модуляция уровней инозитолфосфата с помощью NaF и сбора клеток
   1. Обработка NaF: Добавьте NaF (10 мМ) за 1 ч перед сбором урожая в среду. Смешайте среду путем закручивания пластины/пипетки и инкубируйте клетки в течение 60 мин в стандартных условиях.
   2. После лечения NaF удалите среду из клеток и поместите клетки на лед.
   3. Дважды вымойте ячейки PBS (5 мл, 4 °C) и полностью удалите PBS из посуды.
   4. Добавить хлорную кислоту (ПА) (1 мл, 1 М, 4 °C). Убедитесь, что вся поверхность покрыта ПА (клетки станут белыми, когда белки выпадают в осадок). Инкубировать клетки в течение 10 мин на наклонном столе при 4 °C.
   5. Соберите ПА в центрифужную трубку и удалите загрязняющий мусор центрифугированием (17 000 х г, 5 мин, 4 °C). Добавьте супернатант в подготовленные шарики TiO₂ для вытягивания InsPs.
   6. Дважды вымойте посуду после экстракции PBS (5 мл, р.т.) для раскисления; полностью удалить PBS из блюда.
   7. Солюбилизируют белки на пластине путем добавления буфера лизиса клеток (1,5 мл, r.t.; 0,1% додецилсульфата натрия [SDS] в 0,1 М NaOH). Инкубировать блюдо в течение 15 мин на наклонном столе при r.t. Переложите лизат ячейки в центрифужную трубку и центрифугу (17 000 х г, 5 мин, 4 °C). Храните супернатант при -80 °C до тех пор, пока концентрация белка не будет определена с помощью анализа белка DC с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве калибровочного стандарта (обычно одна чашка размером 150 мм содержит около 10 мг белков).
   8. Определение количества клеток из параллельных блюд: Соберите клетки параллельной чашки с помощью трипсина, как описано в шаге 3.1.2 (используйте 5 мл трипсина-ЭДТА для чашки 150 мм) и удалите среду. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в PBS (5 мл), правильно перемешайте и подсчитайте клетки. Выполните этот шаг непосредственно перед сбором урожая с помощью прямого закалки, чтобы получить репрезентативное количество клеток. Кроме того, измеряют объем ячеек соответствующим методом (например, с помощью мультисайзерной машины).
3. TiO₂ обогащение инозитолфосфатов
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать кислотного разложения фосфорилированных соединений, выполните все этапы обогащения до элюирования на льду и охладите все реагенты до 4 °C. Сведите время экстракции к минимуму (1,5-2 ч). Выполните все шаги извлечения с 1 МПА.
   1. Приготовление шариков: Промыть TiO₂ шарика (5 мг на образец) с ddH₂O (1 мл) и центрифугу (3 500 х г, 1 мин, 4 °C). Удалите ddH_2Oи вымойте шарики ПА (1 мл). Удаляют ПА центрифугированием (3 500 х г, 1 мин, 4 °C). Повторное суспендирование шариков в ПА (50 мкл на образец).
   2. Добавьте супернатант, содержащий фосфорилированные соединения (сравните раздел 3.2, этап 3.2.5), к шариковой суспензии, вихрю, а затем поверните образец в течение 20 мин при 4°С.
   3. Центрифугируйте образец (3 500 х г, 1 мин, 4 °C) и выбросьте супернатант. Вымойте шарики ПА (500 мкл) и центрифугой (3 500 х г, 1 мин, 4 °C). Выбросьте супернатант и повторите этап промывки.
   4. Добавьте NH₄OH (200 мкл, 3%) к шарикам и повторно суспендируйте. Поверните образец в течение 5 мин при r.t.
   5. Центрифугируйте образец (3 500 х г, 1 мин) и перенесите супернатант в новую центрифужную трубку.
   6. Повторите этапы элюирования 3.3.4 и 3.3.5 и объедините элюенты. Выбросьте бусины.
   7. Центрифугируйте комбинированные элюенты (17 000 х г, 1 мин, 4 °C) для удаления нерастворимых остатков.
   8. Полностью высушите супернатант под вакуумным выпариванием (70 мин, 60 °C, V-AQ). Добавляют ddH_2O(50 мкл) к высушенным экстрактам, содержащим InsPs. Вихрь для смешивания образца до полного растворения. Храните образец при -20 °C до анализа CE-ESI-MS.

4. Выполнение запусков CE-ESI-MS

1. Готовят смесь внутренних эталонов, содержащую 40 мкМ [¹³С₆]1,5-(PP)2-InsP₄, 80 мкМ [¹³C₆]5-PP-InsP₅, 80 мкМ [¹³C₆]1-PP-InsP₅, 400 мкМ [¹³C₆]InsP₆ и 400 мкМ [¹³C₆]Ins(1,3,4,5,6)P₅. Определить концентрации растворов SIL IS с помощью количественных ^{ЯМР 31}Р и ¹Ч, с помощью сертифицированного эталонного стандарта, т.е. фосфоуксусной кислоты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все внутренние стандарты (IS) выше SIL с чистотой выше 96% были синтезированы и предоставлены группой Фидлера^15,27. Как и в случае с нуклеотидами, эти ИГ могут нести много кристаллических молекул воды и различные встречные ионы. Вместо взвешивания вещества и расчета концентрации рекомендуется определение концентрации ^{стандартных растворов 13}_С6 с помощью количественного ^{ЯМР 31}.
2. Смешайте 10 мкл образца с 0,5 мкл внутренней эталонной смеси во флаконе образца CE. 2 мкМ [¹³С₆]1,5-(PP)2-InsP₄, 4 мкМ [¹³C₆]5-PP-InsP₅, 4 мкМ [¹³C₆]1-PP-InsP₅, 20 мкМ [¹³C₆]InsP₆ и 20 мкМ [¹³C₆]Ins(1,3,4,5,6)P₅ являются конечными концентрациями внутри образцов.
3. При использовании системы пополнения нажмите кнопку «Изменить бутылку », поместите подготовленные 250 мл рабочего буфера CE в бутылку с электролитом и нажмите « Чистые трубки». Храните иглу для пополнения в флаконе с водой.
4. Задайте параметры ESI и MS, как показано в таблице 1. Оптимизируйте исходные параметры с помощью Оптимизатора исходного кода со смесью стандартов инозитолполифосфата. Получите настройки мониторинга нескольких реакций (MRM) с помощью Masshunter Optimizer со всеми стандартами. Настройте параметры ESI и MS/MS для различных приборов.
5. Выполните запуск insP-экстрактов и проверьте результат (рисунок 2). Задайте последовательность при наличии большего количества образцов.
6. Пусть MS находится в режиме ожидания после измерений. Не выключайте насос LC. Поток оболочки жидкости защищает иглу опрыскивателя. Замените опрыскиватель CE-ESI-MS опрыскивателем LC-ESI-MS при отсутствии подачи жидкости в оболочку.

5. Анализ данных

1. Откройте программное обеспечение количественный анализ (для QQQ), создайте пакет для всех образцов.
2. Создайте новый метод из полученных данных управления записями сообщений. Установите [¹³C₆]InsPs в качестве внутренних стандартов - (ISTD). Проверьте настройку состава MRM, настройку времени удержания, настройку ISTD, настройку концентрации и настройку квалификатора. Пройдите проверку и выйдите, чтобы применить метод к текущему пакету. Сохраните метод.
3. Проверьте, правильно ли интегрирован каждый пик в пакете; в противном случае вручную интегрируйте пик.
4. Экспортируйте результаты в электронную таблицу. Выполните количественное определение инозитол(пиро)фосфатов, сравнив пиковую реакцию анализируемого вещества с соответствующей пиковой реакцией SIL IS с известными концентрациями. Теоретические и экспериментальные калибровочные кривые приведены в таблице 2 для 5-PP-InsP₅, InsP₆ и Ins(1,3,4,5,6)P₅ с линейным диапазоном.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительным условием применения теоретической калибровочной кривой является использование высококачественной изотопной картины целевых аналитов с достоверной концентрацией. Оцените линейный диапазон. Калибровочная кривая имеет важное значение для абсолютного количественного определения, когда полное получение вышеупомянутых изотопных стандартов нецелесообразно.
5. С учетом измеренной концентрации в растворе экстракта InsP и его объема рассчитывают абсолютные количества. Кроме того, нормализуйте количество по количеству клеток или содержанию белка. Рассчитайте клеточную концентрацию на основе количества клеток и среднего объема клеток HCT116 (1,68 fL).

Результаты

Результаты, показанные здесь, призваны проиллюстрировать потенциал анализа CE-ESI-MS. Приведенные цифры описывают технически безупречный запуск CE-ESI-MS. Во-первых, представлена смесь стандартов пирофосфата инозитола (рисунок 1) и экстракта клеток млекопитающих (рисунок 2). Во-вторых, приведено сравнение двух клеточных линий HCT116 (рисунок 3) и клеток HCT116, обработанных NaF (рисунок 4).

Экстрагированные ионные электроферограммы (EEI) инозитоловых (пиро)фосфатных эталонов в концентрации 2 мкМ показаны на фиг.1. Вставлен метаболизм пирофосфатов инозитола у млекопитающих с их упрощенной структурой. Четыре инозитолпирофосфата у млекопитающих, 1,5-(PP)2-InsP₄, 5-PP-InsP₅, 1-PP-InsP₅ и 5-PP-Ins(1,3,4,6)P₄ хорошо различаются с использованием описанного способа. Запуск CE-ESI-MS HCT116^UCL показан на рисунке 2. С помощью внутренних стандартов, меченных стабильными изотопами (SIL), абсолютное количественное определение может быть легко достигнуто путем сравнения отклика сигнала с шипованным SIL известной концентрации. Показаны интегрированные EEI инозитолфосфата от InsP₅ до (PP)2-InsP₄ и неинтегрированные EEI их изотопных паттернов. RSD всех аналитов из шести технических повторов находятся в пределах 4%. С измеренной концентрацией и объемом экстрактов можно рассчитать количество аналитов. С количеством клеток и объемом клеток или содержанием белка, абсолютная клеточная концентрация (мкМ) или количество, нормализованное содержанием белка (белок пмоль / мг), обычно являются окончательными результатами такого анализа.

Согласно более раннему исследованию, две партии расходящихся клеток HCT116 имеют вариацию уровней InsP₈, клетки HCT116^UCL содержат в 6 раз более высокие уровни InsP₈, чем HCT116^NIH клетки²⁹. С помощью метода CE-MS 1,5-(PP)2-InsP₄ в HCT116^NIH может быть легко количественно определен (рисунок 3), а клетки HCT116^UCL содержат в 7 раз более высокие уровни InsP₈, чем в HCT116^NIH. Кроме того, значительное накопление 1,5-(PP)2-InsP₄ в клетках HCT116^UCL сопровождается значительно увеличенным 1-PP-InsP₅, что теперь количественно показано на рисунке 3.

Уровни PP-InsPs увеличиваются за счет ингибирования их дефосфорилирования с использованием фторида натрия. Анализ CE-ESI-MS клеток HCT116^NIH , обработанных NaF, продемонстрировал повышение -5-PP-InsP₅ наряду со снижением InsP₆ и появлением 5-PP-Ins(1,3,4,6)P₄ (Рисунок 4). Кроме того, заметно повышение уровней InsP₈ , в то время как 1-PP-InsP₅ в некоторой степени снижается. 1-PP-InsP₅ не полностью отсутствует в HCT116^NIH, обработанном NaF, но в основном либо под пределом обнаружения, либо количественного определения.

Рисунок 1: Типичные экстрагированные ионные электроферограммы (EEI) стандартов инозитол (пиро)фосфатов в анализе CE-ESI-MS с использованием описанного протокола. Концентрация каждого анализируемого вещества составляет 2 мкМ. Объем вводимого образца составляет около 10 нл с инъекцией при 50 мбар в течение 10 с. Вставки показывают метаболизм пирофосфатов инозитола у млекопитающих. IPPK: инозитол пентакисфосфат 2-киназа, IP6K: инозитолгексакисфосфаткиназа, PPIP5K: дифосфоинозитол пентакисфосфаткиназа, DIPP1: дифосфоинозитолполифосфатфосфогидролаза 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Репрезентативный профиль InsP клеток HCT116^UCL. (A) EEI основных инозитоловых (пиро)фосфатов в HCT116^NIH и шипованных SIL ISs 2 мкМ [¹³C₆]1,5-(PP)2-InsP₄ (1), 4 мкМ [¹³C₆]5-PP-InsP₅ (2), 4 мкМ [¹³C₆]1-PP-InsP₅ (3), 20 мкМ [¹³C₆]InsP₆ (4), и 20 мкМ [¹³С₆]Ins(1,3,4,5,6)P₅ (5). Вкладыши показывают шесть технических повторов анализа InsP методом CE-ESI-MS, данные представлены в виде средств ± SD. (B) Клеточная концентрация PP-InsPs и InsPs в клеточных линиях человека HCT116^UCL и (C) PP-InsPs и InsPs, нормализованная содержанием белка. Данные являются средствами, ± SEM из трех независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Изменение уровней InsP₈ между двумя расходящимися ячейками HCT116. (А) EEI инозитолпирофосфата вHCT116^UCL и HCT116^NIH. InsP₈ в HCT116^UCL заметно более распространен, чем в HCT116^NIH. (B) Отношение пирофосфата инозитола к InsP₆ (%) в обеих клетках HCT116. Клетки HCT116^UCL содержат в 7 раз более высокие уровни InsP₈ по сравнению с HCT116^NIH, в то время как уровни 5-PP-InsP₅ равны. Данные являются средствами, ± SEM из трех независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Уровни инозитол (пиро)фосфатов в клетках HCT116^NIH при обработке NaF. (A) EEI инозитол (пиро)фосфата в HCT116^NIH с обработкой фторидом натрия (NaF, 10 мМ). Уровни инозитолпирофосфата, включая 1,5-(PP)2-InsP₄, 5-PP-InsP₅ и 5-PP-Ins(1,3,4,6)P₄, увеличиваются за счет блокирования их дефосфорилирования с помощью NaF. (B) Уровни инозитол(пиро)фосфата (количества нормируются содержанием белка) в необработанных и обработанных NaF клетках HCT116^NIH. Данные являются средствами, ± SEM из трех независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Настройки параметров CE-ESI-MS. Параметры Source и iFunnel оптимизированы с помощью Source и iFunnel Optimizer. Настройки параметров MSM для инозитоловых (пиро)фосфатов оптимизированы MassHunter Optimizer. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 2: Теоретическое и экспериментальное уравнение регрессии. Концентрация [¹³_C6]5-PP-InsP₅ [¹³C₆]InsP₆ и [¹³_C6]Ins (1, 3, 4, 5, 6)P₅ составляет 4 мкМ, 20 мкМ и 20 мкМ соответственно. Для уравнения регрессии концентрация 5-PP-InsP₅ составляет 0,04 мкМ, 0,1 мкМ, 0,2 мкМ, 0,4 мкМ, 1 мкМ, 2 мкМ, 4 мкМ, 8 мкМ, 16 мкМ, 24 мкМ. InsP₆ и Ins (1, 3, 4, 5, 6)P₅ концентрация составляет 0,2 мкМ, 0,5 мкМ, 1 мкМ, 2 мкМ, 5 мкМ, 10 мкМ, 20 мкМ, 20 мкМ, 40 мкМ, 80 мкМ, 120 мкМ. x - концентрация, y - (Площадь InsP)^12C/(Область InsP)^13C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Обсуждение

Здесь представлен практический и чувствительный метод количественного определения высокозаряженных пирофосфатов инозитола в клетках млекопитающих. Сочетая этот подход к анализу с современной экстракцией InsP с помощью хлорной кислоты с последующим обогащением TiO₂, анализ CE-ESI-MS имеет беспрецедентные преимущества. Что касается его пропускной способности, чувствительности, стабильности, абсолютного количественного определения, идентификации изомеров и зависимости от матрицы, этот метод выделяется по сравнению с другими подходами. Этот протокол применим к клеткам млекопитающих, но на самом деле эта стратегия преуспевает во многих различных образцах (например, дрожжи, растения, паразиты, ткани мыши и т. Д.).

Применяемый протокол экстракции полностью восстанавливает PP-InsPs и InsP₆ из экстрактов клеток млекопитающих^16,19. Он также будет извлекать многие другие анионные метаболиты, особенно фосфатсодержащие виды, например, сахарные фосфаты и нуклеотиды. Оценка восстановления и декомпозиции аналитов пользователя с помощью этого протокола будет необходима.

Как правило, система CE-ESI-MS работает бесперебойно и может вместить около 200 образцов каждую неделю с использованием этого протокола. Однако, в отличие от ВЭЖХ, СЕ долгое время рассматривалась как метод для экспертов и специализированных лиц, что ограничивало ее рынок и ограничивало ее применение. Таким образом, устройство CE-ESI-MS обычно отсутствует на аналитических факультетах. Люди, которые хотят провести анализ CE-ESI-MS, вероятно, не имеют опыта CE и будут тратить больше времени на устранение неполадок. Здесь выделены важнейшие шаги. В первую очередь это качество разреза капилляров. Чувствительность и стабильность спрея ESI в основном зависят от первоклассного капиллярного разреза. Во-вторых, капиллярный выходной конец должен находиться ровно на расстоянии 0,1 мм от наконечника опрыскивателя. Игла опрыскивателя и капилляр СЕ должны находиться в осевом направлении. Качество спрея ESI имеет решающее значение для количественного определения; для оценки повторяемости следует выполнить технические прогоны.

При описанном протоколе предел количественного определения (LOQ) для PP-InsPs составляет 40 нМ при впрыске при 50 мбар в течение 10 с (10 нЛ). Существует несколько подходов к дальнейшему повышению чувствительности метода. Во-первых, инъекция при 100 мбар в течение 20 с (40 нЛ) все равно приведет к хорошей пиковой форме и достаточному разрешению для региоизомеров 5-PP-InsP₅ и 1-PP-InsP₅. Во-вторых, экстракты InsP могут быть растворены в меньшем количестве воды. В-третьих, время ожидания может быть увеличено при использовании меньшего количества переходов MRM для количественного определения. Кроме того, источник ионов CE-MS, использующий поток жидкости со сверхнизкой оболочкой, значительно повысит чувствительность.

Работающий буфер CE с pH 9 обеспечивает наилучшее разрешение между InsP 6-InsP₈. При повышении pH до 9,7 разрешение среди InsP 3-InsP₆ значительно улучшится. Благодаря отличному разрешению для дальнейшего увеличения пропускной способности рекомендуется более короткая длина капилляра 72 см. Кроме того, более высокая температура кассеты CE при 40 °C снижает вязкость водного электрофоретического буфера и ускоряет их движение под EOF. В соответствии с различными исследовательскими требованиями модификации этого метода могут дополнительно облегчить анализ InsPs и PP-InsPs. Таким образом, описанные протоколы CE-ESI-MS могут открыть новые возможности для исследований в этом многогранном семействе сигнальных молекул.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
1.5 mL microcentrifuge tubes	Greiner Bio-One	616201	-
15 cm tissue culture dishes	Thermo Fisher	168381	-
2.0 mL microcentrifuge tubes	Greiner Bio-One	623201	-
50 mL centrifuge tubes	Greiner Bio-One	227261	-
96-well plates	Thermo Fisher	260836	for the DC protein assay
CE fused silica capillary	CS Chromatographie	105180	50 µM i.d. 360 µM o.d.
Pipette tips	Starlab	I1054-0001, S1111-6701, S1113-1700, S1111-3700	10 mL, 1000 µL, 200 µL, 10 µL pipette tips
Serological pipets	TPP	94550, 94525, 94010, 94005	50 mL, 25, mL, 10 mL, 5 mL serological pipettes
T75 flasks	TPP	90076	-
Chemicals and Reagents
NaOH	AppliChem	A6829,0500	sodium hydroxide pellets for molecular biology, for preparation of cell lysis buffer
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200056	-
Ammonium acetate	Thermo Fisher	1677373	HPLC grade
BSA	Thermo Fisher	23209	albumin standard (2.0 mg/mL) for standard curve preparation
DC protein assay	Biorad	5000116	DC protein assay reagents package
DMEM	Gibco	41966029	high glucose, pyruvate
FBS	Gibco	10270106, 10500064 (heat inactivated)	10270106 for HCT116UCL, 10500064 for HCT116NIH
Isopropanol	Carl Roth	AE73.2	99.95% LC-MS grade
NH4OH, 10%	Carl Roth	6756.1	for preparation of 3% NH4OH
PBS	Gibco	10010015	-
Perchloric acid, 70%	Carl Roth	9216.1	for preparation of 1 M perchloric acid
SDS	SERVA	20760.02	for preparation of cell lysis buffer
Sodium fluoride	Sigma Aldrich	S7920	-
TiO2 beads	GL Sciences	5020-75000	5 µm particle size
Trypan blue solution	Gibco	15250061	trypan blue stain (0.4%)
Ultrapure (Type 1) water	Milli-Q	ZRQSVP3WW	model: Direct-Q 3 UV Water Purification System
Equipment
Analytical balance	Mettler Toledo	30105893	model: XPE26; for weighing of beads (5-6 mg per sample)
Automated cell counter	Logos Biosystems	L40002	model: LUNA-II Automated Cell Counter
Benchtop centrifuge	Hettich	1401	model: UNIVERSAL 320
Benchtop centrifuge with cooling	VWR	521-1647P	model: Microstar 17R
CE system	Agilent	G7100A	-
CE/MS Adapter Kit	Agilent	G1603A	-
CE/MS Sprayer Kit	Agilent	G1607A	-
Cell counting slides	Logos Biosystems	L12001	LUNA Cell Counting Slides
Centrifugal evaporator	Eppendorf	5305000304	model: Concentrator plus complete system
ESI source	Agilent	AJS ESI	-
Super Support Film	Nisshin EM Co. Ltd, Tokyo	647
Humidified incubator	Binder	9040-0088	model: CB E6.1, for cultivation of mammalian cells
Ice box	-	-	should provide enough space for samples, dishes, etc.
Isocratic LC system	Agilent	G7110B 1260 Iso Pump	model: Infinity II Quaternary system
MSD	Agilent	G6495C	triple quadrupole
Multiplate reader	Tecan	30086375	model: SPARK 10 M
Pipette filler	Thermo Fisher	10072332	for serological pipettes
Pipettes	Brand	705884, 705880, 705878, 705872, 705870	various pipettes
Rotator	Labnet	H5500	model: Mini LabRoller Rotator
Shortix capillary column cutter	SGT	S0020	-
Test tube shaker (vortex mixer)	Carl Roth	HXH6.1	model: Rotilabo-Mini Vortex
Tilt table	Labnet	S0600	model: EDURO MiniMix Nutating Mixer
Water bath	Thermo Fisher	FSGPD05	model: Isotemp GPD 05
Software
MassHunter Workstation	Agilent	Version 10.1	-
MassHunter Workstation LC/MS Data Acquisition	Agilent	Version 10.1	-
MassHunter Workstation Optimizer	Agilent	Version 10.1	-
MassHunter Workstation Qualitative Analysis	Agilent	Version 10.0	-
QQQ Quantitaion Analysis	Agilent	Version 10.1	-