Absolute Quantifizierung von Inositolpyrophosphaten durch Kapillarelektrophorese Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie

Zusammenfassung

Ein Verfahren zur Kapillarelektrophorese Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie zur absoluten Quantifizierung von Inositolpyrophosphaten aus Säugetierzellextrakten wird beschrieben.

Zusammenfassung

Inositolpyrophosphate (PP-InsPs) sind eine wichtige Gruppe intrazellulärer Signalmoleküle. Abgeleitet von Inositolphosphaten (InsPs) weisen diese Moleküle das Vorhandensein mindestens einer energetischen Pyrophosphateinheit auf dem myo-Inositolring auf. Sie existieren ubiquitär in Eukaryoten und fungieren als metabolische Botenstoffe, die die Phosphathomöostase, die Insulinsensitivität und die zelluläre Energieladung überwachen. Aufgrund des Fehlens eines Chromophors in diesen Metaboliten, einer sehr hohen Ladungsdichte und geringen Häufigkeit erfordert ihre Analyse radioaktiven Tracer und ist daher kompliziert und teuer. Hier präsentiert die Studie ein detailliertes Protokoll zur Durchführung einer absoluten und Hochdurchsatzquantifizierung von Inositolpyrophosphaten aus Säugetierzellen mittels Kapillarelektrophorese-Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (CE-ESI-MS). Diese Methode ermöglicht die sensitive Profilierung aller biologisch relevanten PP-InsPs-Spezies in Säugetierzellen und ermöglicht so die Baseline-Trennung von Regioisomeren. Absolute zelluläre Konzentrationen von PP-InsPs, einschließlich kleinerer Isomere, und die Überwachung ihrer zeitlichen Veränderungen in HCT116-Zellen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen werden vorgestellt.

Einleitung

Seit der ersten Entdeckung von myo-Inositolpyrophosphaten (PP-InsPs) im Jahr 1993^1,2 wurden bedeutende Fortschritte bei der Aufklärung ihrer Biosynthese^, ihres Umsatzes und ihrer Funktionen erzielt³. Inositolpyrophosphate kommen ubiquitär in eukaryotischen Zellen^{vor 4} und dienen als metabolische Signalmoleküle, die kritisch an z. B. Phosphathomöostase^5,6, Insulinsensitivität⁷, Kalziumoszillationen^8,9, vesikulärem Transport¹⁰, Apoptose 11, DNA-Reparatur^12, Immunsignalisierung¹³ beteiligt sind und andere. Die Fülle wichtiger Prozesse unter der Kontrolle von Inositolpyrophosphaten erfordert ein tieferes Verständnis ihrer zellulären Abundanz, Fluktuation und Lokalisation.

Obwohl InsPs und PP-InsPs disziplinübergreifend Aufmerksamkeit erregten, wird die Analyse ihrer Häufigkeit routinemäßig mit einer in den 80er Jahren entwickelten Methode durchgeführt, die aus der Markierung von Zellen mit tritiiertem Inositol besteht, wobei die extrahierten PP-InsPs durch starke Anionenaustauschchromatographie Sax-HPLC mit anschließender Szintillationszählung aufgelöst werden. Neuere Methoden, die auf Massenspektrometrie basieren, stehen noch vor großen Herausforderungen: Inositolpyrophosphate mit bis zu acht Phosphateinheiten beherbergen Phosphatester und Anhydride, was zu einer signifikanten negativen Ladung und einem möglichen Phosphatverlust während der Ionisation führt. Es gibt vier Haupttypen von PP-InsPs bei Säugetieren (Abbildung 1): 1,5-(PP)_2-InsP 4 (oder 1,5-InsP₈), 5-PP-InsP 5 (oder 5-InsP 7), 1-PP-InsP 5 (oder 1-InsP₇) und 5-PP-Ins(1,3,4,6)P 4 (oder_{5-PP-InsP 4})^3,14. Die physiologischen Konzentrationen von PP-InsPs liegen typischerweise im nano- bis niedrigen mikromolaren Bereich, wobei 5-PP-InsP 5 mit Zellkonzentrationen von 0,5 - 5 μM am häufigsten vorkommt. Es wird angenommen, dass 1,5-(PP)_{2-InsP 4} und 1-PP-InsP 5 bis zu etwa 10% des 5-PP-InsP _5-Pools ausmachen und in vielen Zellen schwer zu verfolgen^{sind 15}. 5-PP-InsP₄ mit einer freien OH-Gruppe ist noch geringer und wird in der Regel erst nachweisbar, wenn Phosphathydrolasen mit Natriumfluorid (NaF)¹⁶ gehemmt werden.

Die hohe Ladungsdichte von PP-InsPs erschwert ihre Trennung, und das Auftreten von PP-InsP-Regioisomeren erschwert diese Bemühungen zusätzlich. Infolgedessen stützten sich die meisten Experimente auf die Quantifizierung durch metabolische radioaktive Markierung von Zellen unter Verwendung von [³H]-Inositol, da der Hintergrund aus der Matrix ausgeschlossen ist und eine hohe Empfindlichkeit erreicht wird^17,18. Diese Methode ist jedoch kostspielig, zeitaufwendig und ermöglicht es nicht, verwandte PP-InsP-Regioisomere richtig zu unterscheiden. Darüber hinaus berücksichtigt die [³H]-Inositol-Markierung nicht die endogene Inositolsynthese aus Glukose. Eine auf Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) basierende Methode ist eine weit verbreitete kostengünstige Alternative, aber in ihrer Empfindlichkeit begrenzt 19,20,21,22. Andere Ansätze zur Vermeidung der radioaktiven Markierung wurden veröffentlicht, darunter die Ionenchromatographie, gefolgt von der UV-Detektion nach der Säulen²³, der hydrophilen Interaktionschromatographie (HILIC)24 oder dem schwachen Anionenaustausch (WAX) in Verbindung mit Massenspektrometrie (MS)²⁵. Sie sind jedoch (noch) nicht auf Augenhöhe mit dem klassischen [³H]-Inositol SAX-HPLC-Protokoll.

Vor kurzem wurde die Kapillarelektrophorese-Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (CE-ESI-MS) als transformative Strategie für die Analyse des InsPs- und PP-InsPs-Stoffwechsels eingeführt, die alle oben genannten Anforderungen erfüllt¹⁶. In Kombination mit der aktuellen State-of-the-Art-InsP-Extraktion durch Perchlorsäure und anschließender Anreicherung mit Titandioxidperlen²⁶ gelang CE-ESI-MS in jedem bisher getesteten Organismus, von Hefe über Pflanzen bis hin zu Säugetieren. Die gleichzeitige Profilierung von InsPs und PP-InsPs, einschließlich aller möglichen Regioisomere, war problemlos möglich. Stabile isotopenmarkierte (SIL) interne Standards ermöglichten eine schnelle und präzise absolute Quantifizierung, unabhängig von Matrixeffekten. Da MS isotopische Massenunterschiede erfassen kann, kann CE-ESI-MS auch zur Untersuchung kompartimentierter zellulärer Synthesewege von InsPs und PP-InsPs angewendet werden, z. B. durch Fütterung von Zellen mit [13 C 6]-myo-Inositol oder [¹³C₆]-D-Glucose.

Hier ist ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll für die absolute Quantifizierung von PP-InsPs und InsPs aus Säugetierzellen mittels CE-ESI-MS beschrieben. Neben dem Hauptisomer 5-PP-InsP 5 werden in dieser Studie trotz ihrer geringeren Häufigkeit auch 1,5-(PP)_{2-InsP 4} und 1-PP-InsP₅ quantifiziert. Zwei HCT116-Zelllinien aus verschiedenen Laboratorien (NIH, UCL) werden untersucht, und es wurde bestätigt, dass HCT116-UCL-Zellen 7-fach höhere Konzentrationen von 1,5-(PP)_{2-InsP 4} enthalten als in HCT116^NIH, während 5-PP-InsP_{5-Konzentrationen} vergleichbar sind. Darüber hinaus ist die 1-PP-InsP_5-Synthese in HCT116^UCL nicht signifikant erhöht. Auch die Erhöhung der PP-InsP-Spiegel durch Blockierung ihrer Dephosphorylierung mit Natriumfluorid wird quantitativ untersucht.

Protokoll

1. Aufbau des CE-ESI-MS-Systems

1. Aufbau eines CE-ESI-MS-Systems, bestehend aus einem kommerziellen CE-System - und einem Triple-Quadrupol-Tandem-Massenspektrometer, ausgestattet mit einer Agilent Jet Stream (AJS) Elektrospray-Ionisationsquelle (ESI). Ein CE-ESI-MS-Sprühset und eine isokratische LC-Pumpe (Flüssigkeitschromatographie) sind erforderlich.
2. Verbinden Sie den Mantelstrom-1:100-Splitter (im CE-MS-Sprühset enthalten) und den isokratischen LC-Pumpenauslass.
3. Stellen Sie sicher, dass sich die Durchstechflasche mit dem CE-Systemeinlass auf derselben Höhe wie die Sprühspitze des Massenanalysators befindet.
4. Nutzen Sie die MassHunter Workstation (Version 10.1) oder eine vergleichbare MS-Software zur Steuerung des gesamten Systems sowie zur Datenerfassung und -analyse.

2. Vorbereitung des Puffer-, Kapillar- und CE-MS-Systems

1. CE-Laufpuffer vorbereiten: Stellen Sie den pH-Wert von 40 mM Ammoniumacetat mit Ammoniumhydroxid auf 9,0 ein. Ein 250-ml-Messkolben wird empfohlen. Filtern Sie die 250 mL Puffer mit 0,2 μm porengroßen Membranfiltern. Stellen Sie sicher, dass Sie nur ultrareines entionisiertes Wasser und MS-Reagenzien verwenden.
   HINWEIS: Dieser Puffer kann 2-3 Wochen oder mehrere Monate im Kühlschrank bei Raumtemperatur aufbewahrt werden.
2. Hüllenflüssigkeit vorbereiten: Mischen Sie 100 ml Reinstwasser und 100 ml LC-MS-Isopropanol in einer 250-ml-Flasche. Wechseln Sie die Hüllenflüssigkeit mindestens einmal pro Woche. Fügen Sie der Hüllenflüssigkeit Massenreferenz hinzu, wenn Sie ein hochauflösendes Massenspektrometer verwenden.
3. Mantelflüssigkeit installieren: Bei 5 ml/min für 5 min spülen und die Durchflussrate auf 1 mL/min einstellen (10 μL/min in das CE-MS-Sprühgerät). Der Pumpendruck wird bei ca. 180 bar liegen. Stellen Sie sicher, dass der Recyclingschlauch wieder in die Hüllenflüssigkeitsflasche integriert wird, um das Lösungsmittel wiederzuverwenden.
4. Kapillare vorbereiten: Erwerben Sie eine CE-MS-Kapillare (50 μm i.d. und 365 μM o.d. mit einer Länge von 125 cm) mit einem UV-Detektionsfenster. Der Benutzer kann auch viel billigere Kieselsäurekapillaren von spezialisierten Händlern erhalten. Schneiden Sie eine Kapillare mit einer Länge von 100 cm. Schneiden Sie beide Kapillarenden mit einem Kapillarsäulenschneider mit einer rotierenden Diamanttrennscheibe richtig ab und entfernen Sie 2-3 cm Polyimidbeschichtung an beiden Enden mit einem Feuerzeug. Reinigen Sie die Kapillaroberfläche mit Isopropanol.
5. Kapillare installieren: Passen Sie die Kapillare an die CE-MS-Kassette an. Klicken Sie auf die Schaltfläche Kassette wechseln und legen Sie die Kassette in das CE-Gerät ein. Das Einlassende der Kapillare ist etwa 2 mm niedriger als die Elektrode. Stellen Sie sicher, dass das Einlassende während des Injektionsvorgangs niedriger als die Probenoberfläche ist.
6. Kapillare aktivieren: Vor dem ersten Gebrauch spülen Sie die Kapillare mit 1 M NaOH, gefolgt von Wasser für 10 min und CE-Laufpuffer für 15 min.
7. Führen Sie das Kapillarende in die CE-MS-Spritze ein: Stecken Sie die Kapillare vorsichtig in die CE-MS-Spritze und stellen Sie sicher, dass das Kapillarende ca. 0,1 mm aus der Sprühspitze herausragt. Stellen Sie sicher, dass das Kapillarauslassende mit einer Lupe und der Einstellschraube im Sprühgerät präzise eingestellt wird. Führen Sie das Spritzgerät wieder in die Ionenquelle ein und vermeiden Sie es, die Einstellschraube zu berühren. Der MS befindet sich im Standby-Modus, wenn dieser Vorgang ausgeführt wird.
8. ESI-Spray prüfen: Überprüfen Sie die Stabilität des ESI-Sprühgeräts im Full-Scan-Modus. Die Schwankung der Gesamtionenelektropherogramme muss innerhalb von 5% liegen.
9. Führen Sie einen Testlauf mit InsP-Standards durch: Verwenden Sie eine Mischung aus 2 μM InsP_{3-InsP 8-Standards} (angepasst durch quantitative ³¹P NMR 15,27) für Testläufe mit einer Injektion bei 50 mbar für 10 s (¹⁰ nL). Stellen Sie die detaillierten ESI- und MS-Parameter ein, wie in Tabelle 1 dargestellt. Der CE-Strom beträgt ca. 26 μA. Die Spitzenbreite beträgt ca. 0,4-0,5 min. Stellen Sie sicher, dass das Signal-Rausch-Verhältnis mindestens 400 erreicht.

3. Extraktion löslicher Inositolphosphate aus Säugetierzellen

HINWEIS: HCT116^NIH-Zellen waren ein freundliches Geschenk von Stephen Shears²⁸. HCT116^UCL-Zellen stammten aus Saiardis Labor²⁶.

1. Säen von Zellen
   1. Kultur HCT116^NIH - oder HCT116^UCL-Zellen in T75-Kolben bei 37 °C in einer_{CO2-Atmosphäre} mit 5% hoher Luftfeuchtigkeit (im Folgenden als Standardbedingungen bezeichnet) in Dulbeccos modifiziertem Adlermedium (DMEM), ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS).
   2. Die HCT116^NIH - und HCT116^{UCL-Stammkulturen} werden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (5 ml) gewaschen und die Zellen mit Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (3 ml, 0,25%) unter Standardbedingungen inkubiert, bis sie vollständig abgelöst sind. Löschen Sie die Trypsinaktivität durch Zugabe von Medium (7 ml), sammeln Sie die Zellen in einem Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren (200 x g, 3 min).
   3. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in Medium (10 ml). Zählen Sie die Zellen und bestimmen Sie die Lebensfähigkeit durch Trypanblau-Ausschluss.
   4. Die Zellen (6 Millionen HCT116-Zellen pro Assay) werden in eine 150-mm-Schale gesät und insgesamt 20 ml Zellkulturmedium eingestellt. Mischen Sie das Medium und die Zellen vor der Aussaat in einem Zentrifugenröhrchen, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen in der Schale zu erreichen. Bereiten Sie eine parallele Schale vor, wenn eine Normalisierung nach Zellenzahl erforderlich ist.
   5. Kultur der Zellen unter Standardbedingungen für 72 h. Die Zellen erreichen etwa 80% -90% Konfluenz.
2. Modulation des Inositolphosphatgehalts mit NaF und Zellernte
   1. NaF-Behandlung: NaF (10 mM) 1 h vor der Ernte in das Medium geben. Mischen Sie das Medium, indem Sie die Platte schwenken / pipettieren und die Zellen unter Standardbedingungen 60 Minuten lang inkubieren.
   2. Entfernen Sie nach der NaF-Behandlung das Medium aus den Zellen und legen Sie die Zellen auf Eis.
   3. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS (5 ml, 4 °C) und entfernen Sie das PBS vollständig aus der Schale.
   4. Perchlorsäure (PA) zugeben (1 ml, 1 M, 4 °C). Stellen Sie sicher, dass Sie die gesamte Oberfläche mit PA bedecken (die Zellen werden weiß, wenn Proteine ausfallen). Die Zellen 10 min auf einem Kipptisch bei 4 °C inkubieren.
   5. Sammeln Sie PA in einem Zentrifugenröhrchen und entfernen Sie die kontaminierenden Ablagerungen durch Zentrifugieren (17.000 x g, 5 min, 4 °C). Fügen Sie den Überstand zu den vorbereiteten_TiO2-Perlen hinzu, um InsPs herunterzuziehen.
   6. Die Aufgussschale nach der Extraktion zweimal mit PBS (5 ml, r.t.) zur Entsäuerung waschen; Entfernen Sie PBS vollständig aus der Schale.
   7. Lösen Sie die Proteine auf der Platte durch Zugabe von Zelllysepuffer (1,5 ml, r.t.; 0,1% Natriumdodecylsulfat [SDS] in 0,1 M NaOH). Inkubieren Sie die Schale für 15 min auf einem Kipptisch bei r.t. Das Zelllysat in ein Zentrifugenröhrchen überführen und zentrifugieren (17.000 x g, 5 min, 4 °C). Lagern Sie den Überstand bei -80 °C, bis die Proteinkonzentration über den DC-Proteinassay unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Kalibrierstandard bestimmt ist (normalerweise enthält eine 150-mm-Schale etwa 10 mg Proteine).
   8. Bestimmung der Zellzahlen aus parallelen Schalen: Die Zellen der Parallelschale werden wie in Schritt 3.1.2 beschrieben über Trypsin entnommen (5 ml Trypsin-EDTA für die 150-mm-Schale verwenden) und das Medium entfernen. Resuspendieren Sie das Zellpellet in PBS (5 ml), mischen Sie es richtig und zählen Sie die Zellen. Führen Sie diesen Schritt direkt vor der Ernte durch direktes Abschrecken durch, um repräsentative Zellzahlen zu erhalten. Messen Sie zusätzlich das Volumen der Zellen mit einer geeigneten Methode (z. B. mit einer Multisizer-Maschine).
3. TiO2-Anreicherung von Inositolphosphaten
   HINWEIS: Um eine saure Zersetzung phosphorylierter Verbindungen zu vermeiden, führen Sie alle Anreicherungsschritte bis zur Elution auf Eis durch und kühlen Sie alle Reagenzien auf 4 °C ab. Halten Sie die Zeit für die Extraktion auf ein Minimum (1,5-2 h). Führen Sie alle Extraktionsschritte mit 1 M PA durch.
   1. Zubereitung der Kügelchen: TiO2 Perlen (5 mg pro Probe) mit_ddH2O (1 ml)und Zentrifuge (3.500 x g, 1 min, 4 °C) waschen. _ddH2Oentfernen und die Perlen mit PA (1 ml) waschen. PA durch Zentrifugation entfernen (3.500 x g, 1 min, 4 °C). Resuspendieren Sie die Beads in PA (50 μL pro Probe).
   2. Der Überstand, der phosphorylierte Verbindungen enthält (vgl. Abschnitt 3.2, Schritt 3.2.5), wird in die Kugelsuspension, den Wirbel gegeben und die Probe dann 20 min bei 4 °C gedreht.
   3. Zentrifugieren Sie die Probe (3.500 x g, 1 min, 4 °C) und verwerfen Sie den Überstand. Die Perlen mit PA (500 μL) und Zentrifuge (3.500 x g, 1 min, 4 °C) waschen. Entsorgen Sie den Überstand und wiederholen Sie den Waschschritt.
   4. NH₄OH (200 μL, 3%) zu den Perlen geben und resuspendieren. Drehen Sie die Probe für 5 min bei r.t.
   5. Zentrifugieren Sie die Probe (3.500 x g, 1 min) und überführen Sie den Überstand in ein neues Zentrifugenröhrchen.
   6. Wiederholen Sie die Elutionsschritte 3.3.4 und 3.3.5 und kombinieren Sie die Eluenten. Verwerfen Sie die Perlen.
   7. Zentrifugieren Sie die kombinierten Eluenten (17.000 x g, 1 min, 4 °C), um unlösliche Rückstände zu entfernen.
   8. Trocknen Sie den Überstand unter Vakuumverdampfung (70 min, 60 °C, V-AQ) vollständig ab. _ddH2O (50 μL) zu den getrockneten Extrakten geben, die InsPs enthalten. Wirbel, um die Probe zu mischen, bis sie vollständig aufgelöst ist. Lagern Sie die Probe bei -20 °C bis zur CE-ESI-MS-Analyse.

4. Durchführung der CE-ESI-MS-Läufe

1. Es wird eine Mischung interner Standards hergestellt, die 40 μM [13 C 6]1,5-(PP)_2-InsP 4, 80 μM [13 C 6]5-PP-InsP 5, 80 μM [13 C 6]1-PP-InsP 5, 400 μM [13 C 6]InsP 6 und 400 μM [¹³C 6]Ins(1,3,4,5,6)P ₅ enthalten. Bestimmung der Konzentrationen von SIL IS-Lösungen mittels quantitativer ³¹P und ¹H NMR mit Hilfe eines zertifizierten Referenzstandards, d.h. Phosphosesigsäure.
   HINWEIS: Alle oben genannten SIL-internen Standards (IS) mit Reinheiten von mehr als 96% wurden von der Fiedler-Gruppe^15,27 synthetisiert und bereitgestellt. Wie bei Nukleotiden könnten diese IS viele Kristallwassermoleküle und verschiedene Gegenionen tragen. Anstatt die Substanz zu wiegen und die Konzentration zu berechnen, wird die Konzentrationsbestimmung von ¹³C₆ Standardlösungen mittels quantitativer ³¹P NMR empfohlen.
2. Mischen Sie 10 μL der Probe mit 0,5 μL interner Standardmischung in einer CE-Probendurchstechflasche. 2 μM [13 C 6]1,5-(PP)_2-InsP 4, 4 μM [13 C 6]5-PP-InsP 5, 4 μM [13 C 6]1-PP-InsP 5, 20 μM [13 C 6]InsP 6 und 20 μM [¹³ C ₆]Ins(1,3,4,5,6)P ₅ sind die Endkonzentrationen in den Proben.
3. Wenn Sie das Nachschubsystem verwenden, klicken Sie auf die Schaltfläche Flasche wechseln , legen Sie den vorbereiteten 250 ml CE-Laufpuffer in die Elektrolytflasche und klicken Sie auf Saubere Röhrchen. Bewahren Sie die Nachschubnadel in einer Wasserdurchstechflasche auf.
4. Legen Sie ESI- und MS-Parameter fest, wie in Tabelle 1 dargestellt. Optimieren Sie die Quellparameter mit einem Source Optimizer mit einer Mischung aus Inositolpolyphosphat-Standards. Erhalten Sie die Einstellungen für die Mehrfachreaktionsüberwachung (MRM) mit Masshunter Optimizer mit allen Standards. Passen Sie die ESI- und MS/MS-Einstellungen für verschiedene Instrumente an.
5. Führen Sie einen Lauf für die InsP-Extrakte durch, und überprüfen Sie das Ergebnis (Abbildung 2). Legen Sie eine Reihenfolge fest, wenn mehr Samples vorhanden sind.
6. Lassen Sie den MS nach den Messungen im Standby-Modus sein. Schalten Sie die LC-Pumpe nicht aus. Der Fluss der Mantelflüssigkeit schützt die Sprühnadel. Ersetzen Sie das CE-ESI-MS Sprühgerät durch ein LC-ESI-MS Sprühgerät, wenn keine Mantelflüssigkeit zugeführt wird.

5. Datenanalyse

1. Öffnen Sie die Software Quantitative Analysis (für QQQ) und erstellen Sie eine Charge für alle Proben.
2. Erstellen Sie eine neue Methode aus den erfassten MRM-Daten. Setzen Sie die [¹³C₆]InsPs als interne Standards - (ISTD). Überprüfen Sie das MRM-Compound-Setup, das Retentionszeit-Setup, das ISTD-Setup, das Konzentrations-Setup und das Qualifier-Setup. Übergeben Sie die Validierung und beenden Sie, um die Methode auf den aktuellen Batch anzuwenden. Speichern Sie die Methode.
3. Überprüfen Sie, ob jeder Peak in der Charge ordnungsgemäß integriert ist. Andernfalls integrieren Sie den Peak manuell.
4. Exportieren Sie die Ergebnisse in eine Tabelle. Führen Sie die Quantifizierung von Inositol(pyro)phosphaten durch, indem Sie die Peakantwort des Analyten mit der jeweiligen Peakantwort von SIL IS mit bekannten Konzentrationen vergleichen. Theoretische und experimentelle Kalibrierkurven sind in Tabelle 2 für 5-PP-InsP 5, InsP₆ und Ins(1,3,4,5,6)P₅ mit dem linearen Bereich dargestellt.
   HINWEIS: Die Voraussetzung für die Anwendung der theoretischen Kalibrierkurve ist die Verwendung eines qualitativ hochwertigen Isotopenmusters von Zielanalyten mit glaubwürdiger Konzentration. Bewerten Sie den linearen Bereich. Eine Kalibrierkurve ist für die absolute Quantifizierung unerlässlich, wenn die vollständige Erfassung der oben genannten Isotopennormale nicht praktikabel ist.
5. Berechnen Sie mit der gemessenen Konzentration in der InsP-Extraktlösung und deren Volumen die absoluten Mengen. Normalisieren Sie außerdem die Menge durch Zellzahl oder Proteingehalt. Berechnen Sie die Zellkonzentration basierend auf der Zellzahl und dem durchschnittlichen Zellvolumen von HCT116 (1,68 fL).

Ergebnisse

Die hier gezeigten Ergebnisse sollen das Potenzial der CE-ESI-MS-Analyse verdeutlichen. Die gemeldeten Zahlen beschreiben einen technisch einwandfreien CE-ESI-MS-Lauf. Zunächst wird eine Mischung aus Inositolpyrophosphat-Standards (Abbildung 1) und einem Säugetierzellextrakt (Abbildung 2) vorgestellt. Zweitens wird ein Vergleich von zwei HCT116-Zelllinien (Abbildung 3) und NaF-behandelten HCT116-Zellen (Abbildung 4) bereitgestellt.

Extrahierte Ionenelektropherogramme (EIEs) von Inositol (pyro)phosphat-Standards in einer Konzentration von 2 μM sind in Abbildung 1 dargestellt. Der Metabolismus von Inositolpyrophosphaten in Säugetieren mit ihren vereinfachten Strukturen wird eingefügt. Die vier Inositolpyrophosphate in Säugetieren, 1,5-(PP)_2-InsP 4, 5-PP-InsP 5, 1-PP-InsP 5 und_5-PP-Ins(1,3,4,6)P₄ werden mit dem beschriebenen Verfahren gut unterschieden. Ein CE-ESI-MS-Lauf von HCT116^UCL ist in Abbildung 2 dargestellt. Mit Hilfe von SIL-internen Standards (Stable Isotope-Labeled) kann eine absolute Quantifizierung leicht erreicht werden, indem die Signalantwort mit dem eingespeisten SIL bekannter Konzentration verglichen wird. Die integrierten EIEs des Inositolphosphats von InsP₅ bis (PP)_{2-InsP 4} und unintegrierte EIEs ihrer Isotopenmuster werden angezeigt. RSDs aller Analyten aus sechs technischen Wiederholungen liegen innerhalb von 4%. Mit der gemessenen Konzentration und dem Volumen der Extrakte kann die Menge der Analyten berechnet werden. Mit der Zellzahl und dem Zellvolumen oder Proteingehalt sind die absolute Zellkonzentration (μM) oder die durch den Proteingehalt normalisierte Menge (pmol/mg-Protein) üblicherweise die Endergebnisse einer solchen Analyse.

Laut einer früheren Studie haben zwei Chargen divergenter HCT116-Zellen eine Variation von InsP 8-Spiegeln, HCT116^UCL-Zellen enthalten 6-fach höhere Konzentrationen von InsP₈ als HCT116^{NIH-Zellen 29}. Mit der CE-MS-Methode konnte 1,5-(PP)_{2-InsP 4} in HCT116 NIH leicht quantifiziert werden (Abbildung 3), und HCT116^UCL-Zellen enthalten 7-fach höhere Konzentrationen von InsP₈ als in HCT116^NIH. Darüber hinaus geht eine signifikante Akkumulation von 1,5-(PP)2-InsP₄ in HCT116^UCL-Zellen mit einem signifikant erhöhten 1-PP-InsP₅ einher, was nun quantitativ in Abbildung 3 dargestellt ist.

Der PP-InsPs-Gehalt steigt durch Hemmung ihrer Dephosphorylierung mit Natriumfluorid. Die CE-ESI-MS-Analyse von NaF-behandelten HCT116^NIH-Zellen zeigte die -5-PP-InsP_5-Erhöhung zusammen mit einer Reduktion von InsP₆ und einem Auftreten von 5-PP-Ins(1,3,4,6)P 4 (Abbildung 4). Außerdem ist die Erhöhung der InsP_8-Werte spürbar, während 1-PP-InsP₅ bis zu einem gewissen Grad abnimmt. 1-PP-InsP₅ fehlt in NaF-behandeltem HCT116^NIH nicht vollständig, sondern meist entweder unter der Nachweis- oder Quantifizierungsgrenze.

Abbildung 1: Typische extrahierte Ionenelektropherogramme (EIEs) von Inositol(pyro)phosphat-Standards in der CE-ESI-MS-Analyse unter Verwendung des beschriebenen Protokolls. Die Konzentration jedes Analyten beträgt 2 μM. Das injizierte Probenvolumen beträgt ca. 10 nL bei einer Injektion bei 50 mbar für 10 s. Inserts zeigen den Metabolismus von Inositolpyrophosphaten bei Säugetieren. IPPK: Inositolpentakisphosphat-2-Kinase, IP6K: Inositolhexakisphosphat-Kinase, PPIP5K: Diphosphoinositolpentakisphosphat-Kinase, DIPP1: Diphosphoinositolpolyphosphat-Phosphohydrolase 1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Repräsentatives InsP-Profil von HCT116 UCL-Zellen. (A) EIEs der wichtigsten Inositol(pyro)phosphate in HCT116 ^NIH und spiked SIL ISs 2 μM [13 C 6]1,5-(PP)2-InsP 4 (1), 4 μM [13 C 6]5-PP-InsP 5 (₂), 4 μM [13 C 6]1-PP-InsP₅ (3), 20 μM [¹³C 6]InsP ₆ (₄), und 20 μM [¹³C 6]Ins(1,3,4,5,6)_P5 (5). Beilagen zeigen sechs technische Wiederholungen der InsP-Analyse mittels CE-ESI-MS, die Daten werden als Mittel ± SD dargestellt. (B) Zelluläre Konzentration von PP-InsPs und InsPs in menschlichen Zelllinien HCT116^UCL und (C) PP-InsPs und InsPs Menge normalisiert durch Proteingehalt. Die Daten sind Mittelwerte ± REM aus drei unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Variation der InsP_8-Spiegel zwischen zwei divergierenden HCT116-Zellen. (A) EIEs von Inositolpyrophosphat in HCT116 ^UCL und HCT116^NIH. InsP₈ in HCT116^UCL ist deutlich häufiger als in HCT116^NIH. (B) Verhältnis von Inositolpyrophosphat zu InsP₆ (%) in beiden HCT116-Zellen. HCT116^UCL-Zellen enthalten 7-fach höhere Konzentrationen von InsP₈ im Vergleich zu HCT116^NIH, während die 5-PP-InsP_5-Spiegel gleich sind. Die Daten sind Mittelwerte ± REM aus drei unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Inositol (pyro)phosphatspiegel in HCT116^NIH-Zellen mit NaF-Behandlung. (A) EIEs von Inositol(pyro)phosphat in HCT116^NIH mit Natriumfluoridbehandlung (NaF, 10 mM). Der Gehalt an Inositolpyrophosphat einschließlich 1,5-(PP)_2-InsP 4, 5-PP-InsP 5 und_5-PP-Ins(1,3,4,6)P₄ steigt durch Blockierung ihrer Dephosphorylierung mit NaF. (B) Inositol (pyro)phosphatspiegel (Mengen werden durch Proteingehalt normalisiert) in unbehandelten und NaF-behandelten HCT116^NIH-Zellen. Die Daten sind Mittelwerte ± REM aus drei unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: CE-ESI-MS-Parametereinstellungen. Source-Parameter und iFunnel-Parameter werden von Source und iFunnel Optimizer optimiert. MSM-Parametereinstellungen für Inositol(pyro)phosphate werden von MassHunter Optimizer optimiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Theoretische und experimentelle Regressionsgleichung. Die Konzentration von [13 C 6]5-PP-InsP 5 [13 C 6]InsP 6 und [¹³C 6]Ins (1, 3, 4, 5, ₆)P₅ beträgt 4 μM, 20 μM bzw. 20 μM. Für die Regressionsgleichung liegt die 5-PP-InsP 5-Konzentration bei 0,04 μM, 0,1 μM, 0,2 μM, 0,4 μM, 1 μM, 2 μM, 4 μM, 8 μM, 16 μM, 24 μM. InsP 6 und Ins (1, 3, 4, 5,₆)P 5 Konzentration ist bei 0,2 μM,_0,5 μM, 1 μM, 2 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 120 μM. x ist Konzentration, y ist (Area InsP)^12C/(Area InsP)^13C. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Diskussion

Hier wird eine praktische und empfindliche Methode zur Quantifizierung hochgeladener Inositolpyrophosphate in Säugetierzellen vorgestellt. Durch die Kombination dieses Analyseansatzes mit der aktuellen InsP-Extraktion mit Perchlorsäure und anschließender Anreicherung mit TiO₂ bietet die CE-ESI-MS-Analyse beispiellose Vorteile. In Bezug auf Durchsatz, Empfindlichkeit, Stabilität, absolute Quantifizierung, Isomerenidentifizierung und Matrixabhängigkeit hebt sich diese Methode von anderen Ansätzen ab. Dieses Protokoll ist auf Säugetierzellen anwendbar, aber tatsächlich gelingt diese Strategie in vielen verschiedenen Proben (z. B. Hefe, Pflanzen, Parasiten, Mausgewebe usw.).

Das angewandte Extraktionsprotokoll gewinnt PP-InsPs und InsP₆ vollständig aus Säugetierzellextrakten^16,19 zurück. Es wird auch viele andere anionische Metaboliten extrahieren, insbesondere phosphathaltige Spezies, z. B. Zuckerphosphate und Nukleotide. Eine Bewertung der Rückgewinnung und Zersetzung für die Analyten des Anwenders mit diesem Protokoll wäre notwendig.

Im Allgemeinen läuft das CE-ESI-MS-System reibungslos und kann mit diesem Protokoll etwa 200 Proben pro Woche aufnehmen. Im Gegensatz zur HPLC galt CE jedoch lange Zeit als Methode für Experten und Spezialisten, was ihren Markt und ihre Anwendung einschränkte. So fehlt ein CE-ESI-MS-Gerät in analytischen Fakultäten in der Regel. Personen, die eine CE-ESI-MS-Analyse durchführen möchten, haben wahrscheinlich keine CE-Erfahrung und verbringen mehr Zeit mit der Fehlerbehebung. Hier werden die kritischen Schritte hervorgehoben. An erster Stelle steht die Qualität des Kapillarschnitts. Die Empfindlichkeit und Stabilität des ESI-Sprays beruht meist auf einem erstklassigen Kapillarschnitt. Zweitens sollte das Kapillarauslassende genau 0,1 mm aus der Sprühgerätespitze entfernt sein. Die Sprühnadel und die CE-Kapillare sollten in axialer Richtung sein. Die Qualität des ESI-Sprays ist entscheidend für die Quantifizierung; Es sollten technische Läufe durchgeführt werden, um die Wiederholbarkeit zu bewerten.

Mit dem beschriebenen Protokoll liegt die Bestimmungsgrenze (LOQ) für PP-InsPs bei 40 nM bei einer Injektion bei 50 mbar für 10 s (10 nL). Es gibt mehrere Ansätze, um die Methodensensitivität weiter zu erhöhen. Erstens führt eine Injektion bei 100 mbar für 20 s (40 nL) immer noch zu einer guten Peakform und ausreichender Auflösung für die Regioisomere 5-PP-InsP 5 und 1-PP-InsP₅. Zweitens können InsP-Extrakte in einer kleineren Menge Wasser gelöst werden. Drittens könnte die Verweilzeit erhöht werden, wenn weniger MRM-Übergänge für die Quantifizierung verwendet werden. Darüber hinaus würde eine CE-MS-Ionenquelle mit extrem niedrigem Mantelflüssigkeitsfluss die Empfindlichkeit signifikant erhöhen.

Der CE-Laufpuffer mit pH 9 bietet die beste Auflösung zwischen InsP 6-InsP ₈. Wenn der pH-Wert auf 9,7 erhöht wird, verbessert sich die Auflösung unter InsP_{3-InsP 6} signifikant. Aufgrund der hervorragenden Auflösung empfiehlt sich eine kürzere Kapillarlänge von 72 cm, um den Durchsatz weiter zu erhöhen. Außerdem verringert eine höhere CE-Kassettentemperatur bei 40 °C die Viskosität des wässrigen elektrophoretischen Puffers und beschleunigt ihre Bewegung unter EOF. Entsprechend den unterschiedlichen Forschungsanforderungen können Modifikationen dieser Methode die Analyse von InsPs und PP-InsPs weiter erleichtern. Daher haben die beschriebenen CE-ESI-MS-Protokolle das Potenzial, neue Forschungswege in dieser facettenreichen Familie von Signalmolekülen zu eröffnen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
1.5 mL microcentrifuge tubes	Greiner Bio-One	616201	-
15 cm tissue culture dishes	Thermo Fisher	168381	-
2.0 mL microcentrifuge tubes	Greiner Bio-One	623201	-
50 mL centrifuge tubes	Greiner Bio-One	227261	-
96-well plates	Thermo Fisher	260836	for the DC protein assay
CE fused silica capillary	CS Chromatographie	105180	50 µM i.d. 360 µM o.d.
Pipette tips	Starlab	I1054-0001, S1111-6701, S1113-1700, S1111-3700	10 mL, 1000 µL, 200 µL, 10 µL pipette tips
Serological pipets	TPP	94550, 94525, 94010, 94005	50 mL, 25, mL, 10 mL, 5 mL serological pipettes
T75 flasks	TPP	90076	-
Chemicals and Reagents
NaOH	AppliChem	A6829,0500	sodium hydroxide pellets for molecular biology, for preparation of cell lysis buffer
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200056	-
Ammonium acetate	Thermo Fisher	1677373	HPLC grade
BSA	Thermo Fisher	23209	albumin standard (2.0 mg/mL) for standard curve preparation
DC protein assay	Biorad	5000116	DC protein assay reagents package
DMEM	Gibco	41966029	high glucose, pyruvate
FBS	Gibco	10270106, 10500064 (heat inactivated)	10270106 for HCT116UCL, 10500064 for HCT116NIH
Isopropanol	Carl Roth	AE73.2	99.95% LC-MS grade
NH4OH, 10%	Carl Roth	6756.1	for preparation of 3% NH4OH
PBS	Gibco	10010015	-
Perchloric acid, 70%	Carl Roth	9216.1	for preparation of 1 M perchloric acid
SDS	SERVA	20760.02	for preparation of cell lysis buffer
Sodium fluoride	Sigma Aldrich	S7920	-
TiO2 beads	GL Sciences	5020-75000	5 µm particle size
Trypan blue solution	Gibco	15250061	trypan blue stain (0.4%)
Ultrapure (Type 1) water	Milli-Q	ZRQSVP3WW	model: Direct-Q 3 UV Water Purification System
Equipment
Analytical balance	Mettler Toledo	30105893	model: XPE26; for weighing of beads (5-6 mg per sample)
Automated cell counter	Logos Biosystems	L40002	model: LUNA-II Automated Cell Counter
Benchtop centrifuge	Hettich	1401	model: UNIVERSAL 320
Benchtop centrifuge with cooling	VWR	521-1647P	model: Microstar 17R
CE system	Agilent	G7100A	-
CE/MS Adapter Kit	Agilent	G1603A	-
CE/MS Sprayer Kit	Agilent	G1607A	-
Cell counting slides	Logos Biosystems	L12001	LUNA Cell Counting Slides
Centrifugal evaporator	Eppendorf	5305000304	model: Concentrator plus complete system
ESI source	Agilent	AJS ESI	-
Super Support Film	Nisshin EM Co. Ltd, Tokyo	647
Humidified incubator	Binder	9040-0088	model: CB E6.1, for cultivation of mammalian cells
Ice box	-	-	should provide enough space for samples, dishes, etc.
Isocratic LC system	Agilent	G7110B 1260 Iso Pump	model: Infinity II Quaternary system
MSD	Agilent	G6495C	triple quadrupole
Multiplate reader	Tecan	30086375	model: SPARK 10 M
Pipette filler	Thermo Fisher	10072332	for serological pipettes
Pipettes	Brand	705884, 705880, 705878, 705872, 705870	various pipettes
Rotator	Labnet	H5500	model: Mini LabRoller Rotator
Shortix capillary column cutter	SGT	S0020	-
Test tube shaker (vortex mixer)	Carl Roth	HXH6.1	model: Rotilabo-Mini Vortex
Tilt table	Labnet	S0600	model: EDURO MiniMix Nutating Mixer
Water bath	Thermo Fisher	FSGPD05	model: Isotemp GPD 05
Software
MassHunter Workstation	Agilent	Version 10.1	-
MassHunter Workstation LC/MS Data Acquisition	Agilent	Version 10.1	-
MassHunter Workstation Optimizer	Agilent	Version 10.1	-
MassHunter Workstation Qualitative Analysis	Agilent	Version 10.0	-
QQQ Quantitaion Analysis	Agilent	Version 10.1	-