גישה גנטית הפוכה לזיהוי מווסתי פיגמנטציה באמצעות דגי זברה

Summary

רגולטורים של פונקציות מלנוציטים שולטים בהבדלים גלויים בתוצאות הפיגמנטציה. פענוח הפונקציה המולקולרית של גן הפיגמנטציה המועמד מציב אתגר. כאן אנו מדגימים את השימוש במערכת מודל דגי זברה כדי לזהות מועמדים ולסווג אותם לווסתים של תכולת המלנין ומספר המלנוציטים.

Abstract

מלנוציטים הם תאים מיוחדים שמקורם בפסגה עצבית הנמצאים בעור האפידרמיס. תאים אלה מסנתזים פיגמנט מלנין המגן על הגנום מפני קרינה אולטרה סגולה מזיקה. הפרעות בתפקוד המלנוציטים מובילות להפרעות פיגמנטריות כגון פיבלדיזם, לבקנות, ויטיליגו, מלזמה ומלנומה. דג זברה הוא מודל מצוין להבנת תפקודי מלנוציטים. נוכחותם של מלנוציטים פיגמנטיים בולטים, קלות המניפולציה הגנטית והזמינות של קווים פלואורסצנטיים טרנסגניים מקלים על חקר הפיגמנטציה. מחקר זה משתמש בקווי דגי זברה מסוג בר ודגי זברה טרנסגניים המניעים ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת מקדמי Mitfa ו - tyrp1 המסמנים שלבים שונים של מלנוציטים.

השתקה מבוססת מורפולינו של גנים מועמדים מושגת כדי להעריך את התוצאה הפנוטיפית על פיגמנטציה של הזחל והיא ישימה לסינון מווסתי פיגמנטציה. פרוטוקול זה מדגים את השיטה ממיקרו-הזרקה לדימות ומיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) מבוסס נתיחה של פנוטיפים באמצעות שני גנים מועמדים, פחמן אנהידראז 14 (Ca14) וגרסת היסטון (H2afv), כדי להעריך באופן מקיף את תוצאת הפיגמנטציה. יתר על כן, פרוטוקול זה מדגים הפרדת גנים מועמדים למפרטים ומבדילים של מלנוציטים המשנים באופן סלקטיבי את מספרי המלנוציטים ואת תכולת המלנין בכל תא, בהתאמה.

Introduction

בעוד שהשימוש במלנין להגנה מפני אור התפתח מספר פעמים ברחבי ממלכת החי, נראה כי בעלי חוליות שכללו את התהליך. תאים ייעודיים מייצרי פיגמנט עם מנגנון משוכלל לסנתז ולהכיל מלנין נשמרים מדגים לבני אדם¹. עם זאת, התוצאה של פיגמנטציה היא מגוונת באופן דרמטי, נע בצבע כדי הדדיות ומציג דפוסים חיים על אינטגמנטים, העור, ושיער². למרות הגיוון, רפרטואר הגנים המעורבים בתגובת פיגמנטציה נשמר להפליא. מרכיבי הליבה של מנגנון סינתוז המלנין, כגון אנזימי המפתח המסנתזים מלנין, מרכיבי המלנוזומים, והקישוריות במעלה הזרם למסלול האיתות, נשארים זהים במהותם בין אורגניזמים. הבדלים גנטיים עדינים מביאים לשינויים דרמטיים בדפוסי הפיגמנטציה שנצפו בין מינים³. לפיכך, גישה גנטית הפוכה באורגניזם בעל חוליות נמוך יותר, דג הזברה (Danio rerio), מציעה הזדמנות מצוינת לפענח את מעורבות הגנים בהפיכת מצב פיגמנטי⁴.

עוברים של דגי זברה מתפתחים מזיגוטה מופרית חד-תאית לזחל בטווח של ~24 שעות לאחר ההפריה (HPF)⁵. באופן מדהים, התאים המקבילים למלנוציטים - המלנופורים - הם תאים גדולים הנמצאים בדרמיס ובולטים בשל תכולת המלנין הכהה⁶. תאים עצביים אלה שמקורם בסמל העצבי נובעים ~ 11 hpf ומתחילים פיגמנט ~ 24 hpf ^6,7. מודולי ביטוי גנים שמורים אפשרו זיהוי של גורמי מפתח המתזמרים תפקודי מלנוציטים והובילו לפיתוח קווי כתב פלואורסצנטיים טרנסגניים Tg(sox10:GFP), Tg (mitfa:GFP) ו- Tg (ftyrp1:GFP)8,9,10 המסמנים שלבים סלקטיביים של התפתחות מלנוציטים. שימוש בקווי דגים טרנסגניים אלה מאפשר לחקור את הביולוגיה התאית של מלנוציטים ברמת האורגניזם בהקשר הרקמתי עם רמזים מתאימים בהתאם לצירי הזמן ההתפתחותיים. כתבים אלה משלימים כימות מבוסס פיגמנט של מלנוציטים ומאפשרים הערכה ברורה של מספרי המלנוציטים ללא קשר לתכולת המלנין.

מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט לפענוח הביולוגיה של מלנוציטים על ידי הערכת שני פרמטרים קריטיים, כלומר תכולת המלנין ומספרי המלנוציטים. בעוד הראשון הוא קריאה פונקציונלית נפוצה הנובעת מתגובת היפופיגמנטציה, האחרון קשור לירידה במפרט או הישרדות של מלנוציטים והוא קשור לעתים קרובות עם תנאי פיגמנטציה גנטיים או נרכשים. האסטרטגיה הכוללת של מסך גנטי הפוך זה היא להשתיק גנים נבחרים באמצעות מורפולינו ולחקור את התוצאות הספציפיות למלנוציטים. תוכן המלנין מנותח באמצעות כימות מבוסס תמונה של ערכים אפורים ממוצעים, ולאחר מכן אישור באמצעות בדיקת תוכן מלנין. מספר המלנוציטים בשלבים שונים של הבשלה מנותח באמצעות כימות מבוסס תמונה ומאושר עוד יותר באמצעות ניתוח FACS. כאן, פרוטוקול הסינון מודגם באמצעות שני גנים מועמדים, כלומר פחמן אנהידראז 14, המעורב במלנוגנזה, ווריאנט היסטון H2AFZ.2 המעורב באפיון מלנוציטים מאוכלוסיית קודמני הפסגה העצבית. בעוד הראשון משנה את תכולת המלנין ולא את מספרי המלנוציטים, האחרון משנה את מספר המלנוציטים שצוינו, וכתוצאה מכך, את תכולת המלנין בעובר. בסך הכל, שיטה זו מספקת פרוטוקול מפורט לזיהוי תפקידו של גן מועמד בפיגמנטציה ולהבחנה בין תפקידו בשליטה על מספרי המלנוציטים לעומת תכולת המלנין.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ניסויים בדגי זברה בוצעו בהתאמה קפדנית לאישור האתיקה המוסדית של בעלי חיים (IAEC) של CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology (IGIB), הודו (הצעה מספר 45a). כל המאמצים נעשו כדי למזער את סבלם של בעלי החיים.

1. הזרקת מורפולינו לעוברים של דגי זברה

1. באמצעות מושך מחטים סטנדרטי, ציירו פיפטים חדים מאוד וסגורים.
2. טען את התמיסה המכילה מורפולינו לתוך micropipettes באמצעות קצה microloader ולהכניס אותו לתוך מנגנון microinjector. הדקו את הבורג כראוי כדי לנעול את המיקרופיפטה.
   הערה: יש צורך בסטנדרטיזציה של מינון מורפולינוס. למינון המתאים יש שיעור הישרדות של >70% ופנוטיפ ספציפי ב 24 hpf.
3. חותכים את קצה המיקרופיפטה באמצעות מלקחיים עדינים ומכיילים אותה¹¹.
4. כדי לכייל, הזריקו נפח 1 של תמיסת מורפולינו לתוך צינור הנימים מהמיקרופיפטה, תוך שמירה על זמן הזרקה של 1 שניות. חזור על פעולה זו חמש פעמים. באמצעות התקן 1 מ"מ = 30 nL נפח, למצוא את נפח מוזרק 5 s על ידי שמירה על צינור נימי כנגד סולם מדידה. באמצעות המידע לעיל, חשב את הזמן (בשניות) הדרוש כדי להזריק 1-3 nL לכל זריקה¹².
   הערה: התקן, 1 מ"מ = 30 nL, הוא ספציפי להגדרות לחץ מיקרו-מזרק וקוטר הנימים המשמש לכיול. באופן אידיאלי, ההזרקה חייבת להתבצע לתוך ממשק תא החלמון, אשר נוצר בתוך 15-20 דקות לאחר ההפריה. כדי להקל על זריקות מרובות, הפיתוח יכול להיות מעוכב מעט על ידי שמירה על עוברים בטמפרטורה נמוכה יותר (18 ° C). עם זאת, זה צריך להישמר למינימום ולא להאריך מעבר 30 דקות בשל ההשפעה המורכבת של טמפרטורה נמוכה יותר על שינויים ביטוי גנים.
5. הרכיבו את העוברים על צלחת פטרי יצוקה באגרוס (60 מ"מ). עורמים את העוברים בחוזקה בתוך הרכסים. בעזרת פיפטות זכוכית מלוטשות אש, מיישרים אותן בכיוון הנכון להזרקה.
6. תחת מיקרוסקופ, השתמש במניפולטורים כדי לקרב את המיקרופיפטה לעובר ולהזריק בתוך ממשק תא החלמון על ידי לחיצה על מתג הרגל.
7. להזריק את כל העוברים באופן דומה; לאסוף אותם בצלחת פטרי המכילה מים עוברים טריים בינוני לדגור ב 28 ° C.
8. בדוק את העוברים המוזרקים לאחר 6-8 שעות. הסר את כל העוברים המתים הניתנים לזיהוי בשל האטימות הגבוהה שלהם והמשך להחליף את מי העובר לפחות פעם ביום כדי למנוע זיהום.

2. ניתוח פיגמנטציה

1. הכנה לספירת מלנופורים צדיים בקו האמצע ב-3 עוברי דגי זברה dpf
   1. לטפל בעוברים עם 0.016% הרדמה נוירו-שרירית כדי לשתק אותם.
   2. כדי להרכיב את העוברים להדמיה, להוסיף כמה מיליליטר של 1.5-2% methylcellulose בצלחת פטרי (60 מ"מ) כך שהוא יוצר שכבה דקה. בעזרת פיפטה של פסטר, בחרו עוברים ומקמו אותם בעדינות במתילצלולוז כדי להגביל תנועה נוספת במהלך ההדמיה.
   3. התאימו את מיקומם להדמיית רוחב אופטימלית (פס גבי, פס גחון, פס חלמון ומלנופורים בקו האמצע) או גביים (מלנופורים בחלק הגבי של הראש). לרזולוציה טובה יותר של מלנופורים סמוכים, תמונה בהגדלה גבוהה יותר (>5x)
2. הדמיה של ברייטפילד
   הערה: הדמיית Brightfield מתבצעת באמצעות סטריאומיקרוסקופ עם הגדלה של 8-10x.
   1. הניחו את צלחת הפטרי המכילה את עוברי דגי הזברה מתחת למיקרוסקופ. באמצעות מניפולטור, התאימו את הדג בכיוון כזה כך שכל חמשת הפסים העובריים של המלנוציטים ייראו בו זמנית (גבי, גחוני, שני רוחביים, חלמון) (איור 1C). צלם תמונות במהירות באמצעות תוכנת הרכישה. במקרה שבו בעל החיים חוזר לתנועה לפני שהוא מצולם, לטבול אותו מחדש בהרדמה ולהמשיך עם הדמיה ברגע שהוא משותק מספיק.
   2. חזור על כך עם כל הדגים וודא שההגדלה נשארת זהה בכל תמונה.
3. חישוב ערך אפור ממוצע באמצעות תוכנת ImageJ
   1. צלם תמונות גביות וצדדיות של 2 עוברי דגי זברה dpf.
   2. פתחו את התמונה לכימות ב-ImageJ באמצעות הכלי Open . השתמש בכלי צורה ביד חופשית כדי לשרטט את האזור לניתוח. עבור אל האפשרות קבע מידות ובחר ערך אפור ממוצע | אזור. הקש M (או נתח | מדידה) כדי לחשב את הערך האפור הממוצע עבור האזור שנבחר.
   3. שמירה על השטח לניתוח קבוע, לחשב את השטח האפור הממוצע עבור כל חיה בנפרד.
   4. שרטט גרף עמודות עם הנתונים שנרכשו (איור 2F).
4. בדיקת תוכן מלנין
   1. ב 2 dpf, להשתמש פיפטה פסטר זכוכית לאסוף ~ 25 עוברים דגי זברה.
   2. בצע dechorionation ידני באמצעות 1 מ"ל מחטי אינסולין ולהוסיף אותם 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge.
   3. יש להשליך את מדיום העובר בזהירות ולהוסיף 1 מ"ל של חיץ ליזה קר כקרח (20 מ"מ נתרן פוספט (pH 6.8), 1% טריטון X-100, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA) עם קוקטייל מעכב פרוטאז ולהכין חלבון ליזט על ידי סוניקציה.
   4. להמיס את lysates ב 1 מ"ל של 1 N NaOH ולדגור את הדגימות ב 100 ° C במשך 50 דקות באמבט מים. מערבולת זה לסירוגין הומוגניזציה של lysates לחלוטין.
   5. בצע קריאות ספיגה של הדגימות ב- 490 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר.
   6. חשבו את תכולת המלנין על-ידי השוואת ספיגת הדגימה לעקומה סטנדרטית של ריכוזים ידועים של מלנין סינתטי (איור 2G).

3. ספירת מלנופורים

הערה: ניתוח פלואורסצנטי בעוברים של דגי זברה טרנסגניים יכול להיעשות בשתי שיטות: 1) ספירת תאים חיוביים ל- GFP; 2) מדידת עוצמת פלואורסצנטיות.

1. הכנה לספירה מבוססת FAC של תאים חיוביים ל-GFP בעוברים מוקדמים של דגי זברה
   1. אספו עוברים בגודל 200-250 ftyrp:GFP ושטפו אותם במסננת באמצעות מי עוברים רגילים. כבקרה שלילית, יש לעבד עוברי בר שליליים ל-GFP ומותאמים לשלב (Assam Wildtype)¹².
   2. בהתבסס על שלב העניין, להעביר את העוברים לצלחת פטרי המכילה 0.6 מ"ג / מ"ל pronase. לאחר 5-10 דקות, באמצעות פיפטה של פסטר, מעבירים את העוברים המפורקים לצלחת פטרי טרייה המכילה מי עובר רגילים. באמצעות פיפטה פסטר זכוכית, לאסוף ~ 100 עוברים ולהעביר אותם צינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל.
   3. יש להשליך את התווך בזהירות ולהוסיף 200 מיקרוליטר של תמיסת רינגר קרה כקרח (חיץ החלמון). שומרים את הצינור על קרח, פיפטה את התוכן למעלה ולמטה ~ 20 פעמים עד החלמון מומס. צנטריפוגה את הצינורות ב 100 × גרם למשך דקה אחת בצנטריפוגה שולחנית ב 4 ° C. שוב צנטריפוגה ובזהירות להשליך את הסופרנטנט.
   4. באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, מעבירים את העוברים החלמונים לצלחת פטרי המכילה 10 מ"ל של תמיסת טריפסין (מאגר דיסוציאציה של תאים). בצעו אותו בצלחות פטרי מרובות כדי למנוע צפיפות יתר של העוברים וטריפסיניזציה לא יעילה. השתמש פיפטה 1 מ"ל, לערבב את התמיסה המכילה את גוף העובר פעם או פעמיים כדי להקטין את הצבירה.
   5. יש לדגור על צלחות הפטרי בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות (<24 עוברי HPF) או 30 דקות (24-30 עוברי HPF). שאפו ושחררו את התרחיף מדי פעם באמצעות פיפטה של 1 מ"ל כדי לסייע להתפוררות התאים.
   6. במהלך תקופת הדגירה, אתחל את מכונת ציטומטר הזרימה לספירת תאים.
   7. מניחים מסננת תאים של 70 מיקרומטר מעל צינור חרוטי של 50 מ"ל ומעבירים את המתלה הטריפסיני דרך המסננת כדי לקבל תרחיף חד-תאי. שטפו את כלי הפטרי עם אותו תרחיף כמה פעמים כדי להסיר תאים שנצמדו לפני השטח.
   8. סובב את הדגימות ב 450 × גרם, 4 ° C במשך 5 דקות ברוטור דלי מתנדנד.
   9. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של מלח חוצץ פוספט 1x קר כקרח (PBS).
   10. סובבים שוב ב 450 × גרם, 4 ° C במשך 5 דקות ו להשליך את supernatant.
   11. לבסוף, יש להשעות מחדש את הגלולה בסרום PBS + 5% בקר עוברי ולשמור אותה על קרח עד להפעלת FACS.
2. הכנת ציטומטר הזרימה
   1. הפעל את ציטומטר הזרימה והתחל בהפעלה.
      הערה: לפני הפעלת המכונה, רוקן את פח האשפה ומלא את מיכל נוזל הנדן.
   2. נרמל את זרימת הנחל עבור זרבובית 70 מיקרומטר (או 85 מיקרומטר). השאירו אותו ללא הפרעה למשך 10-15 דקות אם הוא לא יציב.
3. ספירת תאים המסומנים באופן פלואורסצנטי באמצעות ציטומטר זרימה
   1. אתחל תיקיית ניסוי חדשה וצור תרשים פיזור של פיזור קדימה לעומת פיזור צדדי והיסטוגרמה של עוצמת איזותיוציאנט פלואורסצאין (FITC).
   2. טען תחילה את התאים מסוג Wild כדי להגדיר את שערי הפיזור קדימה וצדדית (כדי לא לכלול כפילים ופסולת) ואת סף FITC.
   3. לאחר הגדרת השערים, הסר את הדגימה וטען את התאים שבודדו מעוברים Tg (ftyrp1:GFP) כדי לספור מלנוציטים.
      הערה: כאן, מכיוון ש - ftyrp1:GFP מסמן באופן ספציפי מלנוציטים בוגרים, מספר התאים החיוביים ל- GFP מתחת לשער FITC יתאים למספר המלנוציטים.
   4. חזור על השלב לעיל עם דגימות מוזרק מורפולינו כדי להעריך ולהשוות את מספר המלנוציטים עם הביקורת.
4. מדידת עוצמת הפלואורסצנטיות בעוברים של דגי זברה
   1. בעזרת פיפטה מזכוכית פסטר אוספים 100-120 עוברים ומעבירים אותם לצלחת פטרי המכילה מי עוברים רגילים.
   2. ב ~ 10-12 hpf, להעביר את העוברים ל 0.003% 1-phenyl-2-thiourea כדי לעכב פיגמנטציה.
   3. ביצוע דכוריונציה ידנית באמצעות מחטי אינסולין להדמיית <48 עוברי HPF.
   4. כדי לשתק עוברים, לטפל בהם עם 0.016% טריקאין.
   5. כדי להרכיב עוברים להדמיה, לשים כמה מ"ל של 1.5-2% methylcellulose בצלחת פטרי (60 מ"מ) כך שהוא יוצר שכבה דקה. הוסף את העוברים למתילצלולוז כדי להגביל כל תנועה נוספת במהלך ההדמיה. הניחו את צלחת הפטרי המכילה את הדגימות מתחת למיקרוסקופ. באמצעות קצה פיפטה, להתאים את החיה בכיוון הרצוי.
   6. רכוש תמונות באמצעות תוכנת הרכישה. עבור עוברים <24 hpf, ללכוד את כל העובר בבת אחת תחת הגדלה פי 10. עבור שלבי >24 HPF, רכוש שדות סריקה מרובים ולאחר מכן הרכיב (תפר) אותם יחד.
   7. חזור על כך עם כל הדגים וודא שההגדרה לרכישה נשארת קבועה לאורך כל הניסוי.
5. כימות
   1. נתח את התמונה עוד יותר באמצעות תוכנת ImageJ.
   2. פתחו את התמונה לכימות ב-ImageJ באמצעות הכלי Open .
   3. השתמשו בכלי צורת היד החופשית כדי לשרטט את האזור לניתוח (איור 3E).
   4. הקש M (או נתח | מדידה) כדי לקבל מדידת עוצמת שטח שנבחר .
   5. שמירה על השטח לניתוח קבוע, לחשב את העוצמה הממוצעת לכל אזור עבור כל חיה בנפרד.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

תהליך העבודה המתואר באיור 1 שימש לביצוע הפרעה גנטית מבוססת מורפולינו בשלב החד-תאי של דג הזברה. ניתוח פיגמנטציה בוצע בשיטות שונות, כמפורט להלן. כדי להמחיש את התוצאות המייצגות, הוזרקו כמויות מתוקננות של אנטיסנס מורפולינו המכוון לגנים h2afv ו-ca14 בשלב החלמון או התא האחד...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פנוטיפ פיגמנטציה מתבטא לעיתים קרובות כשינויים בתכולת המלנין או במספר המלנוציטים נושאי הפיגמנט. השיטה המתוארת כאן מאפשרת דיסקציה של דיכוטומיה זו ומאפשרת הערכה איכותית וכמותית של תכולת המלנין ומספר המלנופורים לעובר, ללא קשר לתכולת המלנין. הפריון הגבוה של דגי הזברה, הטבע הנראה לעין של מלנו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microtubes	Axygen	MCT-150-A	For preparing MO solution
2 mL Microtubes	Axygen	MCT-200-C	For washing steps in FACS protocol
Agarose	Sigma-Aldrich	A-9539-500G	For microinjection
BD FACSAria II	BD Biosciences	NA	For cell sorting
Capillary tube	Drummond	1-000-0010
Corning cell strainer	Corning	CLS431751	For making single cell suspension
DMEM High Glucose Media	Sigma-Aldrich	D5648	FACS protocol
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)	Sigma-Aldrich	E10521-50G	to immobilize ZF for imaging
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134	For cold lysis buffer
FACS tubes	BD-Biosciences	342065	FACS protocol
Fetal bovine serum (FBS)	Invitrogen	10270	FACS protocol
Graphpad prism Software	Graphstats Technologies	NA	For data representation
ImageJ Software	National Institute of health	NA	For image analysis
Insulin Syringes (1 mL)	DispoVan	NA	For manual dechorionation
Melanin, Synthetic	Sigma-Aldrich	M8631	For melanin content assay
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M7027-250G	to immobilize ZF for imaging
Microloader tips	Eppendorf	5242956003	For microinjection
Morpholino	Gene-tools	NA	For knock-down experiments
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629	to inhibit melanin formation
Needle puller	Sutter Instrument	P-97	For microinjection
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	FACS protocol
Petridish (60 mm)	Tarsons	460090	For embryo plates
Phenylmethylsulphonyl fluoride	Sigma-Aldrich	10837091001	For cold lysis buffer
Phosphate buffer saline (PBS)	HiMedia	TL1099-500mL	For washing cells
Pronase	Sigma-Aldrich	53702	For dechorionation
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	For cold lysis buffer
Sheath fluid	BD FACSFlowTM	342003	FACS protocol
Sodium phosphate	Merck	7558-79-4	Cold lysis buffer
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML	For cold lysis buffer
TrypLE	Gibco	1677119	For trypsinization