Обратный генетический подход к выявлению регуляторов пигментации с использованием рыбок данио-рерио

Резюме

Регуляторы функций меланоцитов регулируют видимые различия в результатах пигментации. Расшифровка молекулярной функции гена-кандидата в пигментацию представляет собой сложную задачу. Здесь мы демонстрируем использование модельной системы рыбок данио-рерио для идентификации кандидатов и классификации их по регуляторам содержания меланина и количества меланоцитов.

Аннотация

Меланоциты представляют собой специализированные клетки, полученные из нервного гребня, присутствующие в эпидермальной коже. Эти клетки синтезируют пигмент меланин, который защищает геном от вредного ультрафиолетового излучения. Нарушения в функционировании меланоцитов приводят к пигментным нарушениям, таким как пипебалдизм, альбинизм, витилиго, меланодермия и меланома. Рыбки данио-рерио - отличная модельная система для понимания функций меланоцитов. Наличие заметных пигментированных меланоцитов, простота генетических манипуляций и наличие трансгенных флуоресцентных линий облегчают изучение пигментации. В этом исследовании используется использование линий рыбок данио-рерио дикого типа и трансгенных, которые управляют экспрессией зеленого флуоресцентного белка (GFP) под промоторами mitfa и tyrp1 , которые отмечают различные стадии меланоцитов.

Сайленсинг генов-кандидатов на основе морфолино достигается для оценки фенотипического результата при личиночной пигментации и применим для скрининга регуляторов пигментации. Этот протокол демонстрирует метод от микроинъекции до визуализации и рассечения фенотипов на основе флуоресцентно-активированной клеточной сортировки (FACS) с использованием двух генов-кандидатов, карбоангидразы 14 (Ca14) и варианта гистона (H2afv), для всесторонней оценки результата пигментации. Кроме того, этот протокол демонстрирует разделение генов-кандидатов на спецификаторы и дифференциаторы меланоцитов, которые избирательно изменяют количество меланоцитов и содержание меланина на клетку соответственно.

Введение

В то время как использование меланина для фотозащиты несколько раз развивалось в животном мире, позвоночные, по-видимому, усовершенствовали этот процесс. Специальные пигментные продуцирующие клетки со сложным механизмом синтеза и содержания меланина сохраняются от рыбы к человеку¹. Тем не менее, результат пигментации сильно варьируется, варьируясь от цвета до взаимности и проявляясь в виде ярких узоров на кожных покровах, коже и волосах². Несмотря на разнообразие, репертуар генов, участвующих в реакции пигментации, поразительно консервативен. Основные компоненты меланин-синтезирующего механизма, такие как ключевые меланин-синтезирующие ферменты, компоненты меланосом и восходящая связь с сигнальным путем, остаются по существу идентичными для всех организмов. Тонкие генетические различия приводят к резким изменениям в характере пигментации, наблюдаемых у разных видов³. Следовательно, обратный генетический подход в организме низших позвоночных, рыбок данио-рерио (Danio rerio), дает прекрасную возможность расшифровать участие генов в передаче пигментированного состояния⁴.

Эмбрионы рыбок данио-рерио развиваются от одноклеточной оплодотворенной зиготы до личинки в течение ~ 24 ч после оплодотворения (HPF)⁵. Поразительно, что клетки, эквивалентные меланоцитам - меланофоры - представляют собой крупные клетки, которые присутствуют в дерме и бросаются в глаза из-за содержания темного меланина⁶. Эти клетки, полученные из нервного гребня, излучают ~ 11 hpf и начинают пигментировать ~ 24 hpf ^6,7. Консервативные модули экспрессии генов позволили идентифицировать ключевые факторы, которые управляют функциями меланоцитов, и привели к разработке трансгенных флуоресцентных репортерных линий Tg (sox10: GFP), Tg (mitfa: GFP) и Tg (ftyrp1: GFP) ^8,9,10, которые маркируют селективные стадии развития меланоцитов. Использование этих трансгенных рыбных линий позволяет исследовать клеточную биологию меланоцитов на уровне организма в тканевом контексте с соответствующими сигналами в соответствии с временными линиями развития. Эти репортеры дополняют количественное определение меланоцитов на основе пигментов и позволяют четко оценить количество меланоцитов независимо от содержания меланина.

В этой статье представлен подробный протокол расшифровки биологии меланоцитов путем оценки двух критических параметров, а именно содержания меланина и количества меланоцитов. В то время как первый является общим функциональным считыванием, исходящим из реакции гипопигментации, второй связан со снижением спецификации или выживаемости меланоцитов и часто связан с генетическими или приобретенными состояниями депигментации. Общая стратегия этого обратного генетического скрининга состоит в том, чтобы заставить замолчать выбранные гены с помощью морфолино и исследовать специфические для меланоцитов результаты. Содержание меланина анализируется с использованием количественного определения средних значений серого на основе изображений с последующим подтверждением с помощью анализа содержания меланина. Количество меланоцитов на различных стадиях созревания анализируется с помощью количественного определения на основе изображений и дополнительно подтверждается с помощью анализа FACS. Здесь протокол скрининга демонстрируется с использованием двух генов-кандидатов, а именно карбоангидразы 14, участвующей в меланогенезе, и варианта гистона H2AFZ.2, участвующего в спецификации меланоцитов из популяции предшественников нервного гребня. В то время как первый изменяет содержание меланина, а не количество меланоцитов, второй изменяет количество определенных меланоцитов и, следовательно, содержание меланина в эмбрионе. В целом, этот метод предоставляет подробный протокол для определения роли гена-кандидата в пигментации и различения его роли в контроле количества меланоцитов по сравнению с содержанием меланина.

протокол

Эксперименты с рыбками данио-рерио проводились в строгом соответствии с институциональным одобрением этики животных (IAEC) CSIR-Института геномики и интегративной биологии (IGIB), Индия (предложение No 45a). Были приложены все усилия, чтобы свести к минимуму страдания животных.

1. Введение морфолино эмбрионам рыбок данио-рерио

1. Используя стандартный игольчатый съемник, нарисуйте очень острые пипетки с закрытыми наконечниками.
2. Загрузите раствор, содержащий морфолино, в микропипетки с помощью наконечника микрозагрузчика и вставьте его в аппарат микроинжектора. Правильно затяните винт, чтобы зафиксировать микропипетку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Необходима стандартизация дозировки морфолино. Подходящая дозировка имеет выживаемость >70% и специфический фенотип при 24 hpf.
3. Отрежьте кончик микропипетки с помощью тонких щипцов и откалибруйте его¹¹.
4. Для калибровки вводят 1 объем раствора морфолино в капиллярную трубку из микропипетки, выдерживая время введения на уровне 1 с. Повторите это пять раз. Используя стандарт 1 мм = объем 30 нл, найдите объем, введенный за 5 с, поднеся капиллярную трубку к измерительной шкале. Используя приведенную выше информацию, рассчитайте время (в секундах), необходимое для введения 1-3 нл на инъекцию¹².
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стандарт 1 мм = 30 нл зависит от настроек давления в микроинжекторе и диаметра капилляра, используемого для калибровки. В идеале инъекция должна быть сделана в границу раздела желток-клетка, которая образуется в течение 15-20 минут после оплодотворения. Чтобы облегчить многократные инъекции, развитие можно немного задержать, поддерживая эмбрионы при более низкой температуре (18 ° C). Однако это должно быть сведено к минимуму и не должно превышать 30 минут из-за сложного эффекта более низкой температуры на изменения экспрессии генов.
5. Установите эмбрионы на чашку Петри с агарозным литием (60 мм). Плотно уложите зародыши в гребни. Используя отполированные стеклянные пипетки, выровняйте их в правильной ориентации для инъекций.
6. Под микроскопом используйте манипуляторы, чтобы приблизить микропипетку к эмбриону и ввести внутрь границы раздела желток-клетка, нажав ножной переключатель.
7. Вводите все эмбрионы одинаково; собрать их в чашку Петри, содержащую свежую среду для зародышей, и инкубировать при температуре 28 °C.
8. Проверьте инъецированные эмбрионы через 6-8 ч. Удалите все мертвые эмбрионы, которые можно идентифицировать из-за их высокой непрозрачности, и продолжайте менять воду для эмбрионов не реже одного раза в день, чтобы избежать инфекции.

2. Анализ пигментации

1. Подготовка к подсчету латеральных срединных меланофоров у 3 эмбрионов рыбок данио-рерио
   1. Обработайте эмбрионы 0,016% нервно-мышечным анестетиком, чтобы обездвижить их.
   2. Чтобы смонтировать эмбрионы для визуализации, добавьте несколько миллилитров 1,5-2% метилцеллюлозы в чашку Петри (60 мм), чтобы она образовала тонкий слой. Используя пипетку Пастера, выберите эмбрионы и осторожно поместите их в метилцеллюлозу, чтобы ограничить дальнейшее движение во время визуализации.
   3. Отрегулируйте их положение для оптимального латерального (дорсальная полоса, вентральная полоса, желточная полоса и срединные меланофоры) или дорсального (меланофоры на дорсальной части головы) визуализации. Для лучшего разрешения соседних меланофоров изображение с большим увеличением (>5x)
2. Визуализация светлого поля
   ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация светлого поля выполняется с помощью стереомикроскопа с 8-10-кратным увеличением.
   1. Поместите чашку Петри, содержащую эмбрионы рыбок данио, под микроскоп. С помощью манипулятора отрегулируйте рыбу в такой ориентации так, чтобы были видны все пять эмбриональных полос меланоцитов (спинная, вентральная, две боковые, желток) одновременно (рис. 1В). Быстро делайте снимки с помощью программного обеспечения для сбора данных. В случае, если животное восстанавливает движение до того, как оно будет изображено, повторно погрузите его в анестетик и приступайте к визуализации, как только оно будет достаточно иммобилизовано.
   2. Повторите это со всеми рыбами и убедитесь, что увеличение остается одинаковым для каждого изображения.
3. Расчет среднего значения серого с помощью программного обеспечения ImageJ
   1. Сделайте дорсальные и боковые снимки 2 эмбрионов рыбок данио.
   2. Откройте изображение, подлежащее количественной оценке, в ImageJ с помощью инструмента «Открыть ». Используйте инструмент « Фигура от руки », чтобы обвести область для анализа. Перейдите к опции « Установить измерения » и выберите «Среднее значение серого | область». Нажмите клавишу M (или Analyze | Measure), чтобы вычислить среднее значение серого для выбранной области.
   3. Сохраняя площадь, подлежащую анализу, постоянной, рассчитайте среднюю серую область для каждого животного отдельно.
   4. Постройте гистограмму с полученными данными (рис. 2F).
4. Анализ на содержание меланина
   1. При 2 dpf используйте стеклянную пипетку Пастера, чтобы собрать ~ 25 эмбрионов рыбок данио.
   2. Выполните ручное дехорионирование с помощью инсулиновых игл объемом 1 мл и добавьте их в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл.
   3. Осторожно выбросьте среду эмбриона и добавьте 1 мл ледяного буфера лизиса (20 мМ фосфата натрия (pH 6,8), 1% Triton X-100, 1 мМ PMSF, 1 мМ ЭДТА) с коктейлем ингибитора протеазы и приготовьте белковые лизаты с помощью ультразвука.
   4. Растворяют лизаты в 1 мл 1 N NaOH и инкубируют образцы при 100 °C в течение 50 мин на водяной бане. Периодически встряхивайте его, чтобы полностью гомогенизировать лизаты.
   5. Снимите показания поглощения образцов на длине волны 490 нм с помощью спектрофотометра.
   6. Рассчитайте содержание меланина, сравнив поглощение образца со стандартной кривой известных концентраций синтетического меланина (рис. 2G).

3. Количество меланофоров

ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентный анализ у трансгенных эмбрионов рыбок данио-рерио может быть выполнен двумя методами: 1) подсчет GFP-положительных клеток; 2) измерение интенсивности флуоресценции.

1. Подготовка к подсчету GFP-положительных клеток на основе FACS ранних эмбрионов рыбок данио-рерио
   1. Соберите 200-250 эмбрионов ftyrp:GFP и промойте их в ситечке с использованием простой воды для эмбрионов. В качестве отрицательного контроля обработайте GFP-отрицательные эмбрионы дикого типа (Assam Wildtype)¹².
   2. В зависимости от интересующей стадии перенесите эмбрионы в чашку Петри, содержащую 0,6 мг/мл проназы. Через 5-10 минут с помощью пастеровской пипетки перенесите дехорионированные эмбрионы в свежую чашку Петри, содержащую простую эмбриональную воду. Используя стеклянную пипетку Пастера, соберите ~ 100 эмбрионов и перенесите их в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл.
   3. Тщательно откажитесь от среды и добавьте 200 мкл ледяного раствора Рингера (буфер для дежелтка). Держа тюбик на льду, пипеткой взбивайте содержимое вверх и вниз ~20 раз, пока желток не растворится. Центрифугируют пробирки при 100 × г в течение 1 мин в настольной центрифуге при температуре 4 °C. Снова центрифугу и аккуратно выбросьте надосадочную жидкость.
   4. С помощью пипетки объемом 1 мл перенесите дежелтованные эмбрионы в чашку Петри, содержащую 10 мл раствора трипсина (буфер диссоциации клеток). Выполняйте его в нескольких чашках Петри, чтобы избежать скученности эмбрионов и неэффективной трипсинизации. Используйте пипетку объемом 1 мл, смешайте раствор, содержащий тела эмбриона, один или два раза, чтобы уменьшить агрегацию.
   5. Инкубируйте чашки Петри при комнатной температуре в течение 15 мин (<24 эмбриона hpf) или 30 мин (24-30 эмбрионов hpf). Время от времени аспирируйте и дозируйте суспензию с помощью пипетки объемом 1 мл, чтобы способствовать распаду клеток.
   6. Во время инкубационного периода инициализируйте проточный цитометр для подсчета клеток.
   7. Поместите клеточный сетчатый фильтр размером 70 мкм над конической трубкой объемом 50 мл и пропустите трипсинизированную суспензию через сетчатый фильтр, чтобы получить одноклеточную суспензию. Вымойте чашки Петри той же суспензией несколько раз, чтобы удалить прилипшие к поверхности клетки.
   8. Отжим образцов при 450 × г, 4 °C в течение 5 мин в роторе качающегося ковша.
   9. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 1 мл ледяного 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
   10. Снова отжим при 450 × г, 4 °C в течение 5 мин и выбросьте надосадочную жидкость.
   11. Наконец, ресуспендируйте гранулу в PBS + 5% эмбриональной бычьей сыворотке и держите ее на льду до запуска FACS.
2. Подготовка проточного цитометра
   1. Включите проточный цитометр и начните запуск.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед включением машины опорожните мусорное ведро и заполните бак для жидкости в оболочке.
   2. Нормализуйте поток потока для сопла 70 мкм (или 85 мкм). Оставьте его нетронутым на 10-15 минут, если он нестабилен.
3. Подсчет флуоресцентно меченных клеток с помощью проточного цитометра
   1. Инициализируйте новую папку эксперимента и составьте точечную диаграмму прямого рассеяния и бокового рассеяния и гистограмму интенсивности флуоресцеина изотиоцианата (FITC).
   2. Сначала загрузите ячейки дикого типа, чтобы установить передние и боковые ворота рассеяния (чтобы исключить дублеты и мусор) и порог FITC.
   3. После того, как ворота установлены, удалите образец и загрузите клетки, выделенные из эмбрионов Tg (ftyrp1: GFP), для подсчета меланоцитов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь, поскольку ftyrp1: GFP специфически маркирует зрелые меланоциты, количество GFP-положительных клеток под воротами FITC будет соответствовать количеству меланоцитов.
   4. Повторите описанный выше шаг с образцами, введенными морфолино, чтобы оценить и сравнить количество меланоцитов с контролем.
4. Измерение интенсивности флуоресценции у эмбрионов рыбок данио-рерио
   1. Используя стеклянную пипетку Пастера, соберите 100-120 эмбрионов и перенесите их в чашку Петри, содержащую простую воду для эмбрионов.
   2. При ~ 10-12 hpf перенесите эмбрионы на 0,003% 1-фенил-2-тиомочевины, чтобы ингибировать пигментацию.
   3. Выполните ручное дехорионирование с использованием инсулиновых игл для визуализации эмбрионов <48 hpf.
   4. Чтобы обездвижить эмбрионы, обработайте их 0,016% трикаином.
   5. Чтобы смонтировать эмбрионы для визуализации, поместите несколько мл 1,5-2% метилцеллюлозы в чашку Петри (60 мм) так, чтобы она образовала тонкий слой. Добавьте эмбрионы в метилцеллюлозу, чтобы ограничить любое дальнейшее движение во время визуализации. Поместите чашку Петри с образцами под микроскоп. С помощью наконечника пипетки отрегулируйте животное в нужной ориентации.
   6. Получение изображений с помощью программного обеспечения для сбора данных. Для эмбрионов <24 hpf захватите весь эмбрион сразу под 10-кратным увеличением. Для ступеней >24 hpf приобретите несколько полей сканирования, а затем соберите (сшите) их вместе.
   7. Повторите это со всеми рыбами и убедитесь, что установка для приобретения остается постоянной на протяжении всего эксперимента.
5. Квантификация
   1. Проанализируйте изображение с помощью программного обеспечения ImageJ.
   2. Откройте изображение, подлежащее количественной оценке, в ImageJ с помощью инструмента «Открыть ».
   3. Используйте инструмент «Фигура от руки », чтобы наметить область для анализа (рис. 3E).
   4. Нажмите клавишу M (или Analyze | Measure), чтобы получить выбранное измерение интенсивности области.
   5. Сохраняя площадь, подлежащую анализу, постоянной, рассчитайте среднюю интенсивность на площадь для каждого животного отдельно.

Результаты

Рабочий процесс, описанный на рисунке 1 , был использован для выполнения генетического возмущения на основе морфолино на стадии одной клетки рыбок данио. Анализ пигментации проводился с использованием различных методов, как указано ниже. Чтобы проиллюстрировать репрез...

Обсуждение

Фенотип пигментации часто проявляется в виде изменения содержания меланина или количества пигментсодержащих меланоцитов. Способ, описанный в настоящем описании, позволяет вскрывать эту дихотомию и позволяет проводить как качественную, так и количественную оценку содержания меланин...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microtubes	Axygen	MCT-150-A	For preparing MO solution
2 mL Microtubes	Axygen	MCT-200-C	For washing steps in FACS protocol
Agarose	Sigma-Aldrich	A-9539-500G	For microinjection
BD FACSAria II	BD Biosciences	NA	For cell sorting
Capillary tube	Drummond	1-000-0010
Corning cell strainer	Corning	CLS431751	For making single cell suspension
DMEM High Glucose Media	Sigma-Aldrich	D5648	FACS protocol
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)	Sigma-Aldrich	E10521-50G	to immobilize ZF for imaging
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134	For cold lysis buffer
FACS tubes	BD-Biosciences	342065	FACS protocol
Fetal bovine serum (FBS)	Invitrogen	10270	FACS protocol
Graphpad prism Software	Graphstats Technologies	NA	For data representation
ImageJ Software	National Institute of health	NA	For image analysis
Insulin Syringes (1 mL)	DispoVan	NA	For manual dechorionation
Melanin, Synthetic	Sigma-Aldrich	M8631	For melanin content assay
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M7027-250G	to immobilize ZF for imaging
Microloader tips	Eppendorf	5242956003	For microinjection
Morpholino	Gene-tools	NA	For knock-down experiments
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629	to inhibit melanin formation
Needle puller	Sutter Instrument	P-97	For microinjection
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	FACS protocol
Petridish (60 mm)	Tarsons	460090	For embryo plates
Phenylmethylsulphonyl fluoride	Sigma-Aldrich	10837091001	For cold lysis buffer
Phosphate buffer saline (PBS)	HiMedia	TL1099-500mL	For washing cells
Pronase	Sigma-Aldrich	53702	For dechorionation
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	For cold lysis buffer
Sheath fluid	BD FACSFlowTM	342003	FACS protocol
Sodium phosphate	Merck	7558-79-4	Cold lysis buffer
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML	For cold lysis buffer
TrypLE	Gibco	1677119	For trypsinization