ゼブラフィッシュを用いた色素沈着制御因子同定のための逆遺伝学的アプローチ

要約

メラノサイト機能の調節因子は、色素沈着の結果の目に見える違いを支配します。候補色素沈着遺伝子の分子機能を解読することは課題となる。ここでは、ゼブラフィッシュモデルシステムを使用して候補を特定し、メラニン含有量とメラノサイト数の調節因子に分類する方法を示します。

要約

メラノサイトは、表皮皮膚に存在する特殊な神経堤由来細胞です。これらの細胞は、有害な紫外線からゲノムを保護するメラニン色素を合成します。メラノサイト機能の摂動は、ピエバルディズム、白皮症、白斑、肝斑、黒色腫などの色素障害を引き起こします。ゼブラフィッシュは、メラノサイトの機能を理解するための優れたモデルシステムです。顕著な色素性メラノサイトの存在、遺伝子操作の容易さ、およびトランスジェニック蛍光線の利用可能性は、色素沈着の研究を容易にする。この研究では、メラノサイトのさまざまな段階を示す mitfa および tyrp1 プロモーターの下で緑色蛍光タンパク質(GFP)発現を駆動する野生型およびトランスジェニックゼブラフィッシュ系統の使用を採用しています。

候補遺伝子のモルホリノベースのサイレンシングは、幼虫の色素沈着の表現型転帰を評価するために達成され、色素沈着の調節因子のスクリーニングに適用できます。このプロトコルは、色素沈着結果を包括的に評価するために、炭酸脱水酵素14(Ca14)とヒストン変異体(H2afv)の2つの候補遺伝子を使用して、マイクロインジェクションからイメージングおよび蛍光活性化セルソーティング(FACS)ベースの表現型の解剖までの方法を実証します。さらに、このプロトコルは、候補遺伝子をメラノサイト指定因子と分化因子に分離し、細胞あたりのメラノサイト数とメラニン含有量をそれぞれ選択的に変化させることを示しています。

概要

光防護のためのメラニンの使用は動物界全体で数回進化してきましたが、脊椎動物はこのプロセスを完成させたようです。メラニンを合成して含むための精巧な機械を備えた専用の色素産生細胞は、魚からヒトまで保存されています¹。しかし、色素沈着の結果は劇的に変化し、色から反射までさまざまであり、外皮、皮膚、髪に鮮やかなパターンとして現れます²。多様性にもかかわらず、色素沈着応答に関与する遺伝子のレパートリーは著しく保存されています。主要なメラニン合成酵素、メラノソームの成分、シグナル伝達経路への上流の接続など、メラニン合成機構のコアコンポーネントは、生物間で本質的に同じままです。微妙な遺伝的差異は、種全体で観察される色素沈着のパターンに劇的な変化をもたらします³。したがって、低等脊椎動物であるゼブラフィッシュ(Danio rerio)における逆遺伝的アプローチは、色素沈着状態のレンダリングにおける遺伝子の関与を解読する絶好の機会を提供します⁴。

ゼブラフィッシュの胚は、受精後~24時間以内に単細胞受精接合子から幼虫に成長します(hpf)⁵。驚くべきことに、メラノサイトと同等の細胞であるメラノフォアは、真皮に存在する大きな細胞であり、メラニン含有量が暗いために目立ちます⁶。これらの神経堤由来の細胞は~11 hpfを発し、~24 hpf ^6,7を色素沈着させ始めます。保存された遺伝子発現モジュールは、メラノサイトの機能を調節する重要な因子の同定を可能にし、メラノサイト発生の選択段階を標識するトランスジェニック蛍光レポーター株Tg(sox10:GFP)、Tg(mitfa:GFP)、およびTg(ftyrp1:GFP)^8,9,10の開発につながりました。これらのトランスジェニックフィッシュラインを使用することで、発生タイムラインに応じた適切な手がかりを使用して、組織コンテキストでの生物レベルでのメラノサイトの細胞生物学の調査が可能になります。これらのレポーターは、色素ベースのメラノサイトの定量を補完し、メラニン含有量に関係なくメラノサイト数の明確な評価を可能にします。

この記事では、メラニン含有量とメラノサイト数という2つの重要なパラメータを評価することにより、メラノサイトの生物学を解読するための詳細なプロトコルを提供します。前者は色素沈着低下反応から生じる一般的な機能的読み出しであるが、後者はメラノサイトの仕様または生存率の低下に関連しており、しばしば遺伝的または後天的な色素脱失状態と関連している。この逆遺伝子スクリーニングの全体的な戦略は、モルホリノを使用して選択された遺伝子をサイレンシングし、メラノサイト特異的な結果を調査することです。メラニン含有量は、平均グレー値の画像ベースの定量を使用して分析され、その後メラニン含有量アッセイを使用して確認されます。成熟のさまざまな段階にあるメラノサイトの数は、画像ベースの定量を使用して分析され、FACS分析を使用してさらに確認されます。ここでは、スクリーニングプロトコルは、メラニン形成に関与する炭酸脱水酵素14と、神経堤前駆集団からのメラノサイトの仕様に関与するヒストン変異体H2AFZ.2の2つの候補遺伝子を使用して実証されます。前者はメラニン細胞数ではなくメラニン含有量を変化させるが、後者は特定のメラノサイト数を変更し、その結果、胚のメラニン含有量を変化させる。全体として、この方法は、色素沈着における候補遺伝子の役割を特定し、メラノサイト数とメラニン含有量の制御におけるその役割を区別するための詳細なプロトコルを提供します。

プロトコル

ゼブラフィッシュの実験は、インドのCSIR-ゲノミクス統合生物学研究所(IGIB)の制度的動物倫理承認(IAEC)に厳密に従って実施されました(提案番号45a)。動物の苦しみを最小限に抑えるためにあらゆる努力が払われました。

1.ゼブラフィッシュ胚へのモルホリノ注入

1. 標準のニードルプラーを使用して、非常に鋭くて先端が閉じたピペットを描きます。
2. モルホリノを含む溶液をマイクロローダーチップを使用してマイクロピペットにロードし、マイクロインジェクター装置に挿入します。ネジを適切に締めて、マイクロピペットをロックします。
   注:モルホリノスの投与量の標準化が必要です。.適切な投与量は、>70%の生存率と24hpfの特定の表現型を有する。
3. 細かい鉗子を使用してマイクロピペットの先端を切り取り、それを較正します¹¹。
4. 校正するには、マイクロピペットからキャピラリーチューブに1容量のモルホリノ溶液を注入し、注入時間を1秒に保ちます。これを5回繰り返します。標準の1 mm = 30 nL容量を使用して、キャピラリーチューブを測定スケールに当てて、5秒で注入される体積を見つけます。上記の情報を使用して、注入¹²あたり1〜3nLを注入するのに必要な時間(秒単位)を計算します。
   注意: 標準である1 mm = 30 nLは、マイクロインジェクターの圧力設定とキャリブレーションに使用されるキャピラリーの直径に固有です。理想的には、注射は受精後15〜20分以内に形成される卵黄 - 細胞界面に行われなければならない。複数回の注射を容易にするために、胚をより低い温度(18°C)に維持することによって発生をわずかに遅らせることができる。ただし、これは最小限に抑え、遺伝子発現の変化に対する低温の複合効果のために30分を超えて延長しないでください。
5. 胚をアガロースキャストペトリ皿(60 mm)にマウントします。胚を尾根の中にしっかりと積み重ねます。ファイアポリッシュされたガラスピペットを使用して、注射に適した方向に位置合わせします。
6. 顕微鏡下で、マニピュレーターを使用してマイクロピペットを胚に近づけ、フットスイッチを押して卵黄細胞界面の内側に注入します。
7. すべての胚を同様に注入します。新鮮な胚水培地を含むペトリ皿にそれらを集め、28°Cでインキュベートします。
8. 6〜8時間後に注入された胚を確認します。不透明度が高いために識別可能なすべての死んだ胚を取り除き、感染を避けるために少なくとも1日1回胚の水を交換し続けます。

2.色素沈着分析

1. 3 dpfゼブラフィッシュ胚における側正中線メラノフォアをカウントするための準備
   1. 胚を0.016%神経筋麻酔薬で治療して固定化します。
   2. イメージングのために胚を取り付けるには、ペトリ皿(60 mm)に数ミリリットルの1.5〜2%メチルセルロースを加えて、薄層を形成します。パスツールピペットを使用して、胚をピックし、メチルセルロースにそっと配置して、イメージング中のさらなる動きを制限します。
   3. 最適な側方(背側縞、腹側縞、卵黄縞、および正中線メラノフォア)または背側(頭の背側のメラノフォア)イメージングのために位置を調整します。隣接するメラノフォアの解像度を高めるために、より高い倍率(>5倍)での画像
2. 明視野イメージング
   注:明視野イメージングは、8〜10倍の倍率の実体顕微鏡を使用して実行されます。
   1. ゼブラフィッシュ胚を含むペトリ皿を顕微鏡下に置きます。マニピュレーターを使用して、5つのメラノサイト胚の縞模様がすべて同時に見えるように魚をそのような方向に調整します(背側、腹側、2つの外側、卵黄)(図1C)。取得ソフトウェアを使用して画像をすばやくキャプチャします。動物が画像化される前に動きを取り戻した場合は、麻酔薬に再度浸し、十分に固定されたら画像化を進めてください。
   2. すべての魚でこれを繰り返し、すべての画像で倍率が同じままであることを確認してください。
3. ImageJソフトウェアを使用した平均グレイ値の計算
   1. 2 dpfゼブラフィッシュ胚の背側および側面の画像を撮影します。
   2. 開くツールを使用して、ImageJで定量化する画像を開きます。フリーハンド形状ツールを使用して、解析する領域の輪郭を描きます。[測定値の設定]オプションに移動し、[平均グレー値|領域]を選択します。M キーを押します (または [分析] |メジャー)を使用して、選択した領域の平均グレー値を計算します。
   3. 分析する領域を一定に保ち、すべての動物の平均灰色領域を個別に計算します。
   4. 集録したデータで棒グラフをプロットします(図2F)。
4. メラニン含有量アッセイ
   1. 2 dpfで、ガラス製のパスツールピペットを使用して、~25個のゼブラフィッシュ胚を採取します。
   2. 1 mLのインスリン針を使用して手動の脱絨毛処理を行い、1.5 mLの微量遠心チューブに追加します。
   3. 胚培地を注意深く廃棄し、1mLの氷冷溶解バッファー(20mMリン酸ナトリウム(pH 6.8)、1%トリトンX-100、1mM PMSF、1mM EDTA)をプロテアーゼ阻害剤カクテルとともに加え、超音波処理によってタンパク質溶解物を調製する。
   4. ライセートを1 mLの1 N NaOHに溶解し、サンプルを100°Cで水浴中で50分間インキュベートします。断続的にボルテックスして、ライセートを完全に均質化します。
   5. 分光光度計を使用して、490 nmでサンプルの吸光度測定値を取得します。
   6. サンプルの吸光度を既知の濃度の合成メラニンの標準曲線と比較することにより、メラニン含有量を計算します(図2G)。

3.メラノフォア数

注:トランスジェニックゼブラフィッシュ胚における蛍光分析は、2つの方法で行うことができます:1)GFP陽性細胞をカウントします。2)蛍光強度の測定。

1. 初期ゼブラフィッシュ胚におけるGFP陽性細胞のFACSベースの計数のための調製
   1. 200〜250 ftyrp:GFP胚を収集し、普通の胚水を使用してストレーナーで洗浄します。陰性対照として、GFP陰性、ステージマッチした野生型(アッサムワイルドタイプ)胚¹²を処理する。
   2. 目的の段階に基づいて、胚を0.6 mg / mLプロナーゼを含むペトリ皿に移します。5〜10分後、パスツールピペットを使用して、脱絨毛胚を普通の胚水を含む新鮮なペトリ皿に移します。ガラス製パスツールピペットを使用して、~100個の胚を採取し、2 mLの微量遠心チューブに移します。
   3. 培地を注意深く廃棄し、200 μLの氷冷リンゲル溶液(脱ヨーリングバッファー)を加えます。チューブを氷の上に保ち、卵黄が溶けるまで内容物を~20回上下にピペットで入れます。チューブを100 × g で4°Cの卓上遠心分離機で1分間遠心分離します。 再度遠心分離し、上清を慎重に廃棄する。
   4. 1 mLピペットを使用して、脱卵した胚を10 mLのトリプシン溶液(細胞解離バッファー)を含むペトリ皿に移します。胚の過密や非効率的なトリプシン処理を避けるために、複数のペトリ皿でそれを実行します。1 mLピペットを使用し、胚体を含む溶液を1〜2回混合して凝集を減少させます。
   5. ペトリ皿を室温で15分間(<24 hpfの胚)または30分間(24-30 hpfの胚)インキュベートします。細胞の崩壊を助けるために、1 mLピペットを使用して懸濁液を吸引および分注します。
   6. インキュベーション期間中に、細胞計数用のフローサイトメーターマシンを初期化します。
   7. 70 μmのセルストレーナーを50 mLのコニカルチューブの上に置き、トリプシン処理した懸濁液をストレーナーに通してシングルセル懸濁液を得ます。同じ懸濁液でシャーレを数回洗浄して、表面に付着した細胞を取り除きます。
   8. サンプルを450 × g、4°Cでスイングバケットローターで5分間回転させます。
   9. 上清を廃棄し、ペレットを1mLの氷冷1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁します。
   10. 再度450× g、4°Cで5分間回転させ、上清を捨てる。
   11. 最後に、ペレットをPBS + 5%ウシ胎児血清に再懸濁し、FACSが実行されるまで氷上に保ちます。
2. フローサイトメーターの準備
   1. フローサイトメーターのスイッチを入れ、起動を開始します。
      注意: 機械の電源を入れる前に、ゴミ箱を空にしてシース液タンクを満たしてください。
   2. 70 μm(または85 μm)のノズルのストリームの流れを正規化します。不安定な場合は、10〜15分間邪魔しないでください。
3. フローサイトメーターを使用した蛍光標識細胞のカウント
   1. 新しい実験フォルダーを初期化し、前方散乱と側方散乱の散布図とフルオレセインイソチオシアネート(FITC)強度のヒストグラムを作成します。
   2. 最初にワイルドタイプのセルをロードして、前方および側面散乱ゲート(ダブレットとデブリを除く)とFITCしきい値を設定します。
   3. ゲートが設定されたら、サンプルを取り出し、Tg(ftyrp1:GFP)胚から分離された細胞をロードしてメラノサイトをカウントします。
      注:ここで、 ftyrp1:GFPは成熟メラノサイトを特異的に標識しているため、FITCゲート下のGFP陽性細胞の数はメラノサイトの数に対応します。
   4. モルホリノ注入サンプルで上記の手順を繰り返して、メラノサイトの数を推定し、コントロールと比較します。
4. ゼブラフィッシュ胚における蛍光強度の測定
   1. ガラス製のパスツールピペットを使用して、100〜120個の胚を収集し、それらを普通の胚水を含むペトリ皿に移します。
   2. ~10-12 hpfで、胚を0.003%の1-フェニル-2-チオ尿素に移し、色素沈着を抑制します。
   3. <48 hpfの胚をイメージングするために、インスリン針を使用して手動でデコリオン処理を行います。
   4. 胚を固定するには、0.016%トリカインで治療します。
   5. イメージングのために胚をマウントするには、ペトリ皿(60 mm)に数mLの1.5〜2%メチルセルロースを入れて、薄層を形成します。胚をメチルセルロースに追加して、イメージング中のそれ以上の動きを制限します。サンプルを入れたシャーレを顕微鏡下に置きます。ピペットチップを使用して、動物を希望の方向に調整します。
   6. 取得ソフトウェアを使用して画像を取得します。24 hpf<胚の場合、10倍の倍率で一度に胚全体をキャプチャします。>24 hpfステージの場合、複数のスキャンフィールドを取得し、その後それらを組み立て(ステッチ)します。
   7. すべての魚でこれを繰り返し、実験を通して取得の設定が一定であることを確認してください。
5. 定量化
   1. ImageJソフトウェアを使用して画像をさらに分析します。
   2. 開くツールを使用して、ImageJで定量化する画像を開きます。
   3. フリーハンド形状ツールを使用して、解析する領域の輪郭を描きます(図3E)。
   4. M キーを押します (または [分析] |測定)を選択して、選択した領域強度測定値を取得します。
   5. 分析する面積を一定に保ち、すべての動物の面積あたりの平均強度を個別に計算します。

結果

図1に記述したワークフローを用いて、ゼブラフィッシュの 1 細胞段階でモルホリノベースの遺伝的摂動を行った。色素沈着分析は、後述するように様々な方法を用いて行った。代表的な結果を例示するために、 h2afv および ca14 遺伝子を標的とするアンチセンスモルホリノの標準化された量を、ゼブラフィッシュ胚の卵黄または1細胞期に注入した。明視野?...

ディスカッション

色素沈着表現型は、メラニンの含有量または色素含有メラノサイトの数の変化として現れることがよくあります。本明細書に記載の方法は、この二分法の解剖を可能にし、メラニン含量に関係なく、メラニン含量および胚当たりのメラノフォア数の定性的および定量的評価を可能にする。ゼブラフィッシュの高い繁殖力、色素性メラノサイトの目に見える性質、およびメラノソーム転写の欠?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microtubes	Axygen	MCT-150-A	For preparing MO solution
2 mL Microtubes	Axygen	MCT-200-C	For washing steps in FACS protocol
Agarose	Sigma-Aldrich	A-9539-500G	For microinjection
BD FACSAria II	BD Biosciences	NA	For cell sorting
Capillary tube	Drummond	1-000-0010
Corning cell strainer	Corning	CLS431751	For making single cell suspension
DMEM High Glucose Media	Sigma-Aldrich	D5648	FACS protocol
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)	Sigma-Aldrich	E10521-50G	to immobilize ZF for imaging
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134	For cold lysis buffer
FACS tubes	BD-Biosciences	342065	FACS protocol
Fetal bovine serum (FBS)	Invitrogen	10270	FACS protocol
Graphpad prism Software	Graphstats Technologies	NA	For data representation
ImageJ Software	National Institute of health	NA	For image analysis
Insulin Syringes (1 mL)	DispoVan	NA	For manual dechorionation
Melanin, Synthetic	Sigma-Aldrich	M8631	For melanin content assay
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M7027-250G	to immobilize ZF for imaging
Microloader tips	Eppendorf	5242956003	For microinjection
Morpholino	Gene-tools	NA	For knock-down experiments
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629	to inhibit melanin formation
Needle puller	Sutter Instrument	P-97	For microinjection
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	FACS protocol
Petridish (60 mm)	Tarsons	460090	For embryo plates
Phenylmethylsulphonyl fluoride	Sigma-Aldrich	10837091001	For cold lysis buffer
Phosphate buffer saline (PBS)	HiMedia	TL1099-500mL	For washing cells
Pronase	Sigma-Aldrich	53702	For dechorionation
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	For cold lysis buffer
Sheath fluid	BD FACSFlowTM	342003	FACS protocol
Sodium phosphate	Merck	7558-79-4	Cold lysis buffer
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML	For cold lysis buffer
TrypLE	Gibco	1677119	For trypsinization