Approccio genetico inverso per identificare i regolatori della pigmentazione usando il pesce zebra

Riepilogo

I regolatori delle funzioni dei melanociti governano le differenze visibili nel risultato della pigmentazione. Decifrare la funzione molecolare del gene candidato della pigmentazione rappresenta una sfida. Qui, dimostriamo l'uso di un sistema modello di zebrafish per identificare i candidati e classificarli in regolatori del contenuto di melanina e del numero di melanociti.

Abstract

I melanociti sono cellule derivate dalla cresta neurale specializzate presenti nella pelle epidermica. Queste cellule sintetizzano il pigmento di melanina che protegge il genoma dalle radiazioni ultraviolette nocive. Le perturbazioni nel funzionamento dei melanociti portano a disturbi pigmentari come piebaldismo, albinismo, vitiligine, melasma e melanoma. Zebrafish è un eccellente sistema modello per comprendere le funzioni dei melanociti. La presenza di melanociti pigmentati cospicui, la facilità di manipolazione genetica e la disponibilità di linee fluorescenti transgeniche facilitano lo studio della pigmentazione. Questo studio impiega l'uso di linee di zebrafish selvatiche e transgeniche che guidano l'espressione della proteina fluorescente verde (GFP) sotto i promotori mitfa e tyrp1 che segnano vari stadi dei melanociti.

Il silenziamento basato su morfolino dei geni candidati è ottenuto per valutare l'esito fenotipico sulla pigmentazione larvale ed è applicabile allo screening dei regolatori della pigmentazione. Questo protocollo dimostra il metodo dalla microiniezione all'imaging e alla dissezione basata sulla selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) dei fenotipi utilizzando due geni candidati, l'anidrasi carbonica 14 (Ca14) e una variante istonica (H2afv), per valutare in modo completo l'esito della pigmentazione. Inoltre, questo protocollo dimostra la segregazione dei geni candidati in specificatori e differenziatori di melanociti che alterano selettivamente il numero di melanociti e il contenuto di melanina per cellula, rispettivamente.

Introduzione

Mentre l'uso della melanina per la fotoprotezione si è evoluto più volte in tutto il regno animale, i vertebrati hanno apparentemente perfezionato il processo. Le cellule produttrici di pigmenti dedicate con un elaborato macchinario per sintetizzare e contenere la melanina sono conservate dal pesce all'uomo¹. Tuttavia, il risultato della pigmentazione è drammaticamente vario, che varia nel colore alla ricetta e si presenta come modelli vivaci su tegumenti, pelle e capelli². Nonostante la diversità, il repertorio di geni coinvolti nella risposta alla pigmentazione è sorprendentemente conservato. I componenti principali de....

Protocollo

Gli esperimenti sui pesci zebra sono stati condotti in stretta conformità con l'approvazione istituzionale dell'etica animale (IAEC) del CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology (IGIB), India (proposta n. 45a). Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo la sofferenza degli animali.

1. Iniezione di morfolino in embrioni di zebrafish

1. Utilizzando un estrattore di aghi standard, disegnare pipet molto affilati e con punta chiusa.
2. Caricare la soluzione contenente morpholino nelle micropipette utilizzando una punta di microcaricatore e inserirla nell'apparecchio del microiniettore. String....

Risultati

Il flusso di lavoro descritto nella Figura 1 è stato utilizzato per eseguire perturbazioni genetiche basate sul morfolino allo stadio monocellulare del pesce zebra. L'analisi della pigmentazione è stata eseguita utilizzando vari metodi, come indicato di seguito. Per illustrare i risultati rappresentativi, volumi standardizzati di morfolino antisenso mirati ai geni h2afv e ca14 sono stati iniettati nello stadio tuorlo o unicellulare dell'embrione di zebrafish. La fenotipiz.......

Discussione

Il fenotipo della pigmentazione si manifesta spesso come alterazioni del contenuto di melanina o del numero di melanociti portatori di pigmento. Il metodo qui descritto consente di dissezionare questa dicotomia e consente una valutazione qualitativa e quantitativa del contenuto di melanina e del numero di melanofori per embrione, indipendentemente dal contenuto di melanina. L'elevata fecondità del pesce zebra, la natura visibile dei melanociti pigmentati e la mancanza di trasferimento dei melanosomi consentono la dissez.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microtubes	Axygen	MCT-150-A	For preparing MO solution
2 mL Microtubes	Axygen	MCT-200-C	For washing steps in FACS protocol
Agarose	Sigma-Aldrich	A-9539-500G	For microinjection
BD FACSAria II	BD Biosciences	NA	For cell sorting
Capillary tube	Drummond	1-000-0010
Corning cell strainer	Corning	CLS431751	For making single cell suspension
DMEM High Glucose Media	Sigma-Aldrich	D5648	FACS protocol
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)	Sigma-Aldrich	E10521-50G	to immobilize ZF for imaging
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134	For cold lysis buffer
FACS tubes	BD-Biosciences	342065	FACS protocol
Fetal bovine serum (FBS)	Invitrogen	10270	FACS protocol
Graphpad prism Software	Graphstats Technologies	NA	For data representation
ImageJ Software	National Institute of health	NA	For image analysis
Insulin Syringes (1 mL)	DispoVan	NA	For manual dechorionation
Melanin, Synthetic	Sigma-Aldrich	M8631	For melanin content assay
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M7027-250G	to immobilize ZF for imaging
Microloader tips	Eppendorf	5242956003	For microinjection
Morpholino	Gene-tools	NA	For knock-down experiments
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629	to inhibit melanin formation
Needle puller	Sutter Instrument	P-97	For microinjection
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	FACS protocol
Petridish (60 mm)	Tarsons	460090	For embryo plates
Phenylmethylsulphonyl fluoride	Sigma-Aldrich	10837091001	For cold lysis buffer
Phosphate buffer saline (PBS)	HiMedia	TL1099-500mL	For washing cells
Pronase	Sigma-Aldrich	53702	For dechorionation
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	For cold lysis buffer
Sheath fluid	BD FACSFlowTM	342003	FACS protocol
Sodium phosphate	Merck	7558-79-4	Cold lysis buffer
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML	For cold lysis buffer
TrypLE	Gibco	1677119	For trypsinization