Approccio genetico inverso per identificare i regolatori della pigmentazione usando il pesce zebra

Riepilogo

I regolatori delle funzioni dei melanociti governano le differenze visibili nel risultato della pigmentazione. Decifrare la funzione molecolare del gene candidato della pigmentazione rappresenta una sfida. Qui, dimostriamo l'uso di un sistema modello di zebrafish per identificare i candidati e classificarli in regolatori del contenuto di melanina e del numero di melanociti.

Abstract

I melanociti sono cellule derivate dalla cresta neurale specializzate presenti nella pelle epidermica. Queste cellule sintetizzano il pigmento di melanina che protegge il genoma dalle radiazioni ultraviolette nocive. Le perturbazioni nel funzionamento dei melanociti portano a disturbi pigmentari come piebaldismo, albinismo, vitiligine, melasma e melanoma. Zebrafish è un eccellente sistema modello per comprendere le funzioni dei melanociti. La presenza di melanociti pigmentati cospicui, la facilità di manipolazione genetica e la disponibilità di linee fluorescenti transgeniche facilitano lo studio della pigmentazione. Questo studio impiega l'uso di linee di zebrafish selvatiche e transgeniche che guidano l'espressione della proteina fluorescente verde (GFP) sotto i promotori mitfa e tyrp1 che segnano vari stadi dei melanociti.

Il silenziamento basato su morfolino dei geni candidati è ottenuto per valutare l'esito fenotipico sulla pigmentazione larvale ed è applicabile allo screening dei regolatori della pigmentazione. Questo protocollo dimostra il metodo dalla microiniezione all'imaging e alla dissezione basata sulla selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) dei fenotipi utilizzando due geni candidati, l'anidrasi carbonica 14 (Ca14) e una variante istonica (H2afv), per valutare in modo completo l'esito della pigmentazione. Inoltre, questo protocollo dimostra la segregazione dei geni candidati in specificatori e differenziatori di melanociti che alterano selettivamente il numero di melanociti e il contenuto di melanina per cellula, rispettivamente.

Introduzione

Mentre l'uso della melanina per la fotoprotezione si è evoluto più volte in tutto il regno animale, i vertebrati hanno apparentemente perfezionato il processo. Le cellule produttrici di pigmenti dedicate con un elaborato macchinario per sintetizzare e contenere la melanina sono conservate dal pesce all'uomo¹. Tuttavia, il risultato della pigmentazione è drammaticamente vario, che varia nel colore alla ricetta e si presenta come modelli vivaci su tegumenti, pelle e capelli². Nonostante la diversità, il repertorio di geni coinvolti nella risposta alla pigmentazione è sorprendentemente conservato. I componenti principali del meccanismo di sintesi della melanina, come gli enzimi chiave che sintetizzano la melanina, i componenti dei melanosomi e la connettività a monte alla via di segnalazione, rimangono essenzialmente identici tra gli organismi. Sottili differenze genetiche determinano cambiamenti drammatici nei modelli di pigmentazione osservati in tutte le specie³. Quindi, un approccio genetico inverso in un organismo vertebrato inferiore, il pesce zebra (Danio rerio), offre un'eccellente opportunità per decifrare il coinvolgimento dei geni nel rendere lo stato pigmentato⁴.

Gli embrioni di zebrafish si sviluppano da uno zigote fecondato unicellulare a una larva entro un arco di ~ 24 ore dopo la fecondazione (hpf) ⁵. Sorprendentemente, le cellule equivalenti ai melanociti - i melanofori - sono grandi cellule che sono presenti nel derma e sono evidenti a causa del contenuto di melanina scura⁶. Queste cellule derivate dalla cresta neurale emanano ~11 hpf e iniziano a pigmentare ~24 hpf ^6,7. I moduli di espressione genica conservati hanno permesso l'identificazione di fattori chiave che orchestrano le funzioni dei melanociti e hanno portato allo sviluppo di linee reporter fluorescenti transgeniche Tg(sox10:GFP), Tg(mitfa:GFP) e Tg(ftyrp1:GFP)8,9,10 che marcano gli stadi selettivi dello sviluppo dei melanociti. L'utilizzo di queste linee di pesci transgenici consente l'interrogazione della biologia cellulare dei melanociti a livello dell'organismo nel contesto tissutale con segnali appropriati in base alle tempistiche di sviluppo. Questi reporter integrano la quantificazione dei melanociti basata sul pigmento e consentono una valutazione distinta del numero di melanociti indipendentemente dal contenuto di melanina.

Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per decifrare la biologia dei melanociti valutando due parametri critici, vale a dire il contenuto di melanina e il numero di melanociti. Mentre il primo è una lettura funzionale comune che emana da una risposta di ipopigmentazione, il secondo è associato a una riduzione della specifica o della sopravvivenza dei melanociti ed è spesso associato a condizioni genetiche o di depigmentazione acquisite. La strategia complessiva di questo screening genetico inverso è quella di silenziare geni selezionati utilizzando un morfolino e studiare i risultati specifici dei melanociti. Il contenuto di melanina viene analizzato utilizzando la quantificazione basata su immagini dei valori medi di grigio seguita dalla conferma mediante un test del contenuto di melanina. Il numero di melanociti nelle varie fasi di maturazione viene analizzato utilizzando la quantificazione basata su immagini e ulteriormente confermato utilizzando l'analisi FACS. Qui, il protocollo di screening è dimostrato utilizzando due geni candidati, vale a dire l'anidrasi carbonica 14, coinvolta nella melanogenesi, e una variante istonica H2AFZ.2 coinvolta nella specifica dei melanociti della popolazione precursore della cresta neurale. Mentre il primo altera il contenuto di melanina e non il numero di melanociti, il secondo altera il numero di melanociti specificati e, di conseguenza, il contenuto di melanina nell'embrione. Nel complesso, questo metodo fornisce un protocollo dettagliato per identificare il ruolo di un gene candidato nella pigmentazione e distinguere il suo ruolo nel controllo del numero di melanociti rispetto al contenuto di melanina.

Protocollo

Gli esperimenti sui pesci zebra sono stati condotti in stretta conformità con l'approvazione istituzionale dell'etica animale (IAEC) del CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology (IGIB), India (proposta n. 45a). Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo la sofferenza degli animali.

1. Iniezione di morfolino in embrioni di zebrafish

1. Utilizzando un estrattore di aghi standard, disegnare pipet molto affilati e con punta chiusa.
2. Caricare la soluzione contenente morpholino nelle micropipette utilizzando una punta di microcaricatore e inserirla nell'apparecchio del microiniettore. Stringere correttamente la vite per bloccare la micropipetta.
   NOTA: È necessaria la standardizzazione del dosaggio dei morfolinos. Il dosaggio appropriato ha un tasso di sopravvivenza del >70% e un fenotipo specifico a 24 hpf.
3. Tagliare la punta della micropipetta con una pinza fine e calibrarla¹¹.
4. Per calibrare, iniettare 1 volume di soluzione di morfolino nel tubo capillare dalla micropipetta, mantenendo il tempo di iniezione a 1 s. Ripeti questa operazione cinque volte. Utilizzando lo standard, 1 mm = 30 nL volume, trovare il volume iniettato in 5 s mantenendo il tubo capillare contro una scala di misura. Utilizzando le informazioni di cui sopra, calcolare il tempo (in secondi) necessario per iniettare 1-3 nL per iniezione¹².
   NOTA: Lo standard, 1 mm = 30 nL, è specifico per le impostazioni di pressione del microiniettore e il diametro del capillare utilizzato per la calibrazione. Idealmente, l'iniezione deve essere effettuata nell'interfaccia tuorlo-cellula, che si forma entro 15-20 minuti dopo la fecondazione. Per facilitare le iniezioni multiple, lo sviluppo può essere leggermente ritardato mantenendo gli embrioni a una temperatura più bassa (18 °C). Tuttavia, questo dovrebbe essere ridotto al minimo e non esteso oltre i 30 minuti a causa dell'effetto combinato della temperatura più bassa sui cambiamenti di espressione genica.
5. Montare gli embrioni su una capsula di Petri colata di agarosio (60 mm). Impilare gli embrioni strettamente all'interno delle creste. Utilizzando pipette di vetro lucidate a fuoco, allinearle nel corretto orientamento per l'iniezione.
6. Al microscopio, utilizzare manipolatori per avvicinare la micropipetta all'embrione e iniettare all'interno dell'interfaccia tuorlo-cellula premendo l'interruttore a pedale.
7. Iniettare tutti gli embrioni in modo simile; raccoglierli in una capsula di Petri contenente acqua fresca embrionale e incubarli a 28 °C.
8. Controllare gli embrioni iniettati dopo 6-8 ore. Rimuovere tutti gli embrioni morti identificabili a causa della loro elevata opacità e continuare a cambiare l'acqua dell'embrione almeno una volta al giorno per evitare l'infezione.

2. Analisi della pigmentazione

1. Preparazione per il conteggio dei melanofori della linea mediana laterale in 3 embrioni di zebrafish dpf
   1. Trattare gli embrioni con anestetico neuro-muscolare allo 0,016% per immobilizzarli.
   2. Per montare gli embrioni per l'imaging, aggiungere alcuni millilitri di metilcellulosa all'1,5-2% nella capsula di Petri (60 mm) in modo che formi uno strato sottile. Utilizzando una pipetta Pasteur, prelevare gli embrioni e posizionarli delicatamente nella metilcellulosa per limitare ulteriori movimenti durante l'imaging.
   3. Regolare la loro posizione per l'imaging ottimale laterale (striscia dorsale, striscia ventrale, striscia di tuorlo e melanofori della linea mediana) o dorsale (melanofori sulla parte dorsale della testa). Per una migliore risoluzione dei melanofori adiacenti, immagine a ingrandimento più elevato (>5x)
2. Imaging in campo chiaro
   NOTA: l'imaging in campo chiaro viene eseguito utilizzando uno stereomicroscopio con ingrandimento 8-10x.
   1. Posizionare la capsula di Petri contenente gli embrioni di zebrafish al microscopio. Utilizzando un manipolatore, regolare il pesce in tale orientamento in modo che tutte e cinque le strisce embrionali dei melanociti siano visibili (dorsale, ventrale, due laterali, tuorlo) contemporaneamente (Figura 1C). Acquisisci rapidamente immagini utilizzando il software di acquisizione. Nel caso in cui l'animale riacquisti il movimento prima di essere ripreso, immergerlo nuovamente in anestetico e procedere con l'imaging una volta che è sufficientemente immobilizzato.
   2. Ripeti questa operazione con tutti i pesci e assicurati che l'ingrandimento rimanga lo stesso per ogni immagine.
3. Calcolo del valore grigio medio con il software ImageJ
   1. Scatta immagini dorsali e laterali di 2 embrioni di zebrafish dpf.
   2. Aprire l'immagine da quantificare in ImageJ utilizzando lo strumento Apri . Utilizzate lo strumento forma a mano libera per delineare l'area da analizzare. Vai all'opzione Imposta misure e seleziona l'area Valore grigio medio | . Premere M (o Analizza | Misura) per calcolare il valore di grigio medio per l'area selezionata.
   3. Mantenendo costante l'area da analizzare, calcolare separatamente l'area grigia media per ogni animale.
   4. Tracciare un grafico a barre con i dati acquisiti (Figura 2F).
4. Saggio del contenuto di melanina
   1. A 2 dpf, utilizzare una pipetta Pasteur di vetro per raccogliere ~ 25 embrioni di zebrafish.
   2. Eseguire la decorionazione manuale utilizzando aghi da insulina da 1 mL e aggiungerli a provette da microcentrifuga da 1,5 ml.
   3. Scartare attentamente il terreno embrionale e aggiungere 1 mL di tampone di lisi ghiacciato (20 mM di fosfato di sodio (pH 6,8), 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA) con cocktail di inibitori della proteasi e preparare lisati proteici mediante sonicazione.
   4. Sciogliere i lisati in 1 mL di 1 N NaOH e incubare i campioni a 100 °C per 50 minuti a bagnomaria. Vortice a intermittenza per omogeneizzare completamente i lisati.
   5. Prendere letture di assorbanza dei campioni a 490 nm utilizzando uno spettrofotometro.
   6. Calcolare il contenuto di melanina confrontando l'assorbanza del campione con una curva standard di concentrazioni note di melanina sintetica (Figura 2G).

3. Conta dei melanofori

NOTA: L'analisi della fluorescenza negli embrioni transgenici di Zebrafish può essere effettuata con due metodi: 1) conteggio delle cellule GFP-positive; 2) misurazione dell'intensità della fluorescenza.

1. Preparazione per il conteggio basato su FACS di cellule GFP-positive in embrioni di zebrafish precoci
   1. Raccogliere 200-250 embrioni ftyrp:GFP e lavarli in un colino usando acqua embrionale naturale. Come controllo negativo, elaborare embrioni wild-type GFP-negativi, abbinati allo stadio (Assam Wildtype)¹².
   2. In base allo stadio di interesse, trasferire gli embrioni in una capsula di Petri contenente 0,6 mg/ml di pronasi. Dopo 5-10 minuti, utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire gli embrioni dechorionati in una capsula di Petri fresca contenente acqua embrionale naturale. Utilizzando una pipetta Pasteur di vetro, raccogliere ~ 100 embrioni e trasferirli in una provetta da microcentrifuga da 2 ml.
   3. Scartare accuratamente il mezzo e aggiungere 200 μL di soluzione di Ringer ghiacciata (tampone di deyolking). Mantenendo il tubo sul ghiaccio, pipettare il contenuto su e giù ~ 20 volte fino a quando il tuorlo è sciolto. Centrifugare i tubi a 100 × g per 1 minuto in una centrifuga da tavolo a 4 °C. Centrifugare di nuovo e scartare con attenzione il surnatante.
   4. Utilizzando una pipetta da 1 mL, trasferire gli embrioni deyolked in una capsula di Petri contenente 10 mL di soluzione di tripsina (tampone di dissociazione cellulare). Eseguilo in più piastre di Petri per evitare il sovraffollamento degli embrioni e la tripsinizzazione inefficiente. Utilizzare una pipetta da 1 ml, mescolare la soluzione contenente i corpi embrionali una o due volte per ridurre l'aggregazione.
   5. Incubare le piastre di Petri a temperatura ambiente per 15 minuti (embrioni <24 hpf) o 30 min (embrioni 24-30 hpf). Aspirare ed erogare la sospensione di tanto in tanto utilizzando una pipetta da 1 mL per favorire la disintegrazione delle cellule.
   6. Durante il periodo di incubazione, inizializzare la macchina citometrica a flusso per il conteggio delle cellule.
   7. Posizionare un filtro cellulare da 70 μm sopra un tubo conico da 50 mL e far passare la sospensione tripsinizzata attraverso il filtro per ottenere una sospensione monocellulare. Lavare le piastre di Petri con la stessa sospensione alcune volte per rimuovere le cellule aderenti alla superficie.
   8. Far ruotare i campioni a 450 × g, 4 °C per 5 minuti in un rotore a benna oscillante.
   9. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di soluzione salina ghiacciata tamponata con fosfato (PBS) ghiacciata.
   10. Ruotare nuovamente a 450 × g, 4 °C per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
   11. Infine, risospendere il pellet in PBS + siero fetale bovino al 5% e tenerlo in ghiaccio fino all'esecuzione del FACS.
2. Preparazione del citometro a flusso
   1. Accendere il citometro a flusso e avviare l'avvio.
      NOTA: Prima di accendere la macchina, svuotare il cestino dei rifiuti e riempire il serbatoio del liquido della guaina.
   2. Normalizzare il flusso del flusso per un ugello da 70 μm (o 85 μm). Lasciarlo indisturbato per 10-15 minuti se è instabile.
3. Conteggio di cellule marcate con fluorescenza utilizzando un citometro a flusso
   1. Inizializzare una nuova cartella dell'esperimento e creare un grafico a dispersione di dispersione diretta rispetto alla dispersione laterale e un istogramma dell'intensità dell'isotiocianato di fluoresceina (FITC).
   2. Caricare prima le celle wild-type per impostare le porte di dispersione in avanti e laterali (per escludere doppiette e detriti) e la soglia FITC.
   3. Dopo aver impostato le porte, rimuovere il campione e caricare le cellule isolate dagli embrioni Tg (ftyrp1: GFP) per contare i melanociti.
      NOTA: Qui, poiché ftyrp1:GFP etichetta specificamente i melanociti maturi, il numero di cellule GFP-positive sotto il gate FITC corrisponderà al numero di melanociti.
   4. Ripetere il passaggio precedente con campioni iniettati da morfolino per stimare e confrontare il numero di melanociti con il controllo.
4. Misurazione dell'intensità di fluorescenza negli embrioni di zebrafish
   1. Utilizzando una pipetta Pasteur di vetro, raccogliere 100-120 embrioni e trasferirli in una capsula di Petri contenente acqua embrionale semplice.
   2. A ~ 10-12 hpf, trasferire gli embrioni allo 0,003% 1-fenil-2-tiourea per inibire la pigmentazione.
   3. Eseguire la decorionazione manuale utilizzando aghi da insulina per l'imaging di embrioni <48 hpf.
   4. Per immobilizzare gli embrioni, trattarli con tricaina allo 0,016%.
   5. Per montare gli embrioni per l'imaging, mettere alcuni ml di metilcellulosa all'1,5-2% nella capsula di Petri (60 mm) in modo che formi uno strato sottile. Aggiungere gli embrioni alla metilcellulosa per limitare qualsiasi ulteriore movimento durante l'imaging. Posizionare la capsula di Petri contenente i campioni al microscopio. Utilizzando una punta per pipetta, regolare l'animale nell'orientamento desiderato.
   6. Acquisire immagini utilizzando il software di acquisizione. Per gli embrioni <24 hpf, catturare l'intero embrione contemporaneamente con un ingrandimento 10x. Per >24 stadi hpf, acquisire più campi di scansione e successivamente assemblarli (cucirli) insieme.
   7. Ripeti questo con tutti i pesci e assicurati che l'impostazione per l'acquisizione rimanga costante durante l'esperimento.
5. Quantificazione
   1. Analizza ulteriormente l'immagine utilizzando il software ImageJ.
   2. Aprire l'immagine da quantificare in ImageJ utilizzando lo strumento Apri .
   3. Utilizzare lo strumento forma a mano libera per delineare l'area da analizzare (Figura 3E).
   4. Premere M (o Analizza | Misura) per acquisire una misura dell'intensità dell'area selezionata .
   5. Mantenendo costante l'area da analizzare, calcolare separatamente l'intensità media per area per ogni animale.

Risultati

Il flusso di lavoro descritto nella Figura 1 è stato utilizzato per eseguire perturbazioni genetiche basate sul morfolino allo stadio monocellulare del pesce zebra. L'analisi della pigmentazione è stata eseguita utilizzando vari metodi, come indicato di seguito. Per illustrare i risultati rappresentativi, volumi standardizzati di morfolino antisenso mirati ai geni h2afv e ca14 sono stati iniettati nello stadio tuorlo o unicellulare dell'embrione di zebrafish. La fenotipiz...

Discussione

Il fenotipo della pigmentazione si manifesta spesso come alterazioni del contenuto di melanina o del numero di melanociti portatori di pigmento. Il metodo qui descritto consente di dissezionare questa dicotomia e consente una valutazione qualitativa e quantitativa del contenuto di melanina e del numero di melanofori per embrione, indipendentemente dal contenuto di melanina. L'elevata fecondità del pesce zebra, la natura visibile dei melanociti pigmentati e la mancanza di trasferimento dei melanosomi consentono la dissez...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microtubes	Axygen	MCT-150-A	For preparing MO solution
2 mL Microtubes	Axygen	MCT-200-C	For washing steps in FACS protocol
Agarose	Sigma-Aldrich	A-9539-500G	For microinjection
BD FACSAria II	BD Biosciences	NA	For cell sorting
Capillary tube	Drummond	1-000-0010
Corning cell strainer	Corning	CLS431751	For making single cell suspension
DMEM High Glucose Media	Sigma-Aldrich	D5648	FACS protocol
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)	Sigma-Aldrich	E10521-50G	to immobilize ZF for imaging
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134	For cold lysis buffer
FACS tubes	BD-Biosciences	342065	FACS protocol
Fetal bovine serum (FBS)	Invitrogen	10270	FACS protocol
Graphpad prism Software	Graphstats Technologies	NA	For data representation
ImageJ Software	National Institute of health	NA	For image analysis
Insulin Syringes (1 mL)	DispoVan	NA	For manual dechorionation
Melanin, Synthetic	Sigma-Aldrich	M8631	For melanin content assay
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M7027-250G	to immobilize ZF for imaging
Microloader tips	Eppendorf	5242956003	For microinjection
Morpholino	Gene-tools	NA	For knock-down experiments
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629	to inhibit melanin formation
Needle puller	Sutter Instrument	P-97	For microinjection
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	FACS protocol
Petridish (60 mm)	Tarsons	460090	For embryo plates
Phenylmethylsulphonyl fluoride	Sigma-Aldrich	10837091001	For cold lysis buffer
Phosphate buffer saline (PBS)	HiMedia	TL1099-500mL	For washing cells
Pronase	Sigma-Aldrich	53702	For dechorionation
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	For cold lysis buffer
Sheath fluid	BD FACSFlowTM	342003	FACS protocol
Sodium phosphate	Merck	7558-79-4	Cold lysis buffer
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML	For cold lysis buffer
TrypLE	Gibco	1677119	For trypsinization