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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

I regolatori delle funzioni dei melanociti governano le differenze visibili nel risultato della pigmentazione. Decifrare la funzione molecolare del gene candidato della pigmentazione rappresenta una sfida. Qui, dimostriamo l'uso di un sistema modello di zebrafish per identificare i candidati e classificarli in regolatori del contenuto di melanina e del numero di melanociti.

Abstract

I melanociti sono cellule derivate dalla cresta neurale specializzate presenti nella pelle epidermica. Queste cellule sintetizzano il pigmento di melanina che protegge il genoma dalle radiazioni ultraviolette nocive. Le perturbazioni nel funzionamento dei melanociti portano a disturbi pigmentari come piebaldismo, albinismo, vitiligine, melasma e melanoma. Zebrafish è un eccellente sistema modello per comprendere le funzioni dei melanociti. La presenza di melanociti pigmentati cospicui, la facilità di manipolazione genetica e la disponibilità di linee fluorescenti transgeniche facilitano lo studio della pigmentazione. Questo studio impiega l'uso di linee di zebrafish selvatiche e transgeniche che guidano l'espressione della proteina fluorescente verde (GFP) sotto i promotori mitfa e tyrp1 che segnano vari stadi dei melanociti.

Il silenziamento basato su morfolino dei geni candidati è ottenuto per valutare l'esito fenotipico sulla pigmentazione larvale ed è applicabile allo screening dei regolatori della pigmentazione. Questo protocollo dimostra il metodo dalla microiniezione all'imaging e alla dissezione basata sulla selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) dei fenotipi utilizzando due geni candidati, l'anidrasi carbonica 14 (Ca14) e una variante istonica (H2afv), per valutare in modo completo l'esito della pigmentazione. Inoltre, questo protocollo dimostra la segregazione dei geni candidati in specificatori e differenziatori di melanociti che alterano selettivamente il numero di melanociti e il contenuto di melanina per cellula, rispettivamente.

Introduzione

Mentre l'uso della melanina per la fotoprotezione si è evoluto più volte in tutto il regno animale, i vertebrati hanno apparentemente perfezionato il processo. Le cellule produttrici di pigmenti dedicate con un elaborato macchinario per sintetizzare e contenere la melanina sono conservate dal pesce all'uomo1. Tuttavia, il risultato della pigmentazione è drammaticamente vario, che varia nel colore alla ricetta e si presenta come modelli vivaci su tegumenti, pelle e capelli2. Nonostante la diversità, il repertorio di geni coinvolti nella risposta alla pigmentazione è sorprendentemente conservato. I componenti principali de....

Protocollo

Gli esperimenti sui pesci zebra sono stati condotti in stretta conformità con l'approvazione istituzionale dell'etica animale (IAEC) del CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology (IGIB), India (proposta n. 45a). Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo la sofferenza degli animali.

1. Iniezione di morfolino in embrioni di zebrafish

  1. Utilizzando un estrattore di aghi standard, disegnare pipet molto affilati e con punta chiusa.
  2. Caricare la soluzione contenente morpholino nelle micropipette utilizzando una punta di microcaricatore e inserirla nell'apparecchio del microiniettore. String....

Risultati

Il flusso di lavoro descritto nella Figura 1 è stato utilizzato per eseguire perturbazioni genetiche basate sul morfolino allo stadio monocellulare del pesce zebra. L'analisi della pigmentazione è stata eseguita utilizzando vari metodi, come indicato di seguito. Per illustrare i risultati rappresentativi, volumi standardizzati di morfolino antisenso mirati ai geni h2afv e ca14 sono stati iniettati nello stadio tuorlo o unicellulare dell'embrione di zebrafish. La fenotipiz.......

Discussione

Il fenotipo della pigmentazione si manifesta spesso come alterazioni del contenuto di melanina o del numero di melanociti portatori di pigmento. Il metodo qui descritto consente di dissezionare questa dicotomia e consente una valutazione qualitativa e quantitativa del contenuto di melanina e del numero di melanofori per embrione, indipendentemente dal contenuto di melanina. L'elevata fecondità del pesce zebra, la natura visibile dei melanociti pigmentati e la mancanza di trasferimento dei melanosomi consentono la dissez.......

Divulgazioni

Tutti gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Riconoscimenti

Riconosciamo il sostegno finanziario del Consiglio per la ricerca scientifica e industriale vide progetto MLP2008 e il Dipartimento di Scienza e Tecnologia per il progetto GAP165 per sostenere il lavoro presentato in questo manoscritto. Ringraziamo Jeyashri Rengaraju e Chetan Mishra per il loro aiuto con gli esperimenti.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL MicrotubesAxygenMCT-150-AFor preparing MO solution
2 mL MicrotubesAxygenMCT-200-CFor washing steps in FACS protocol
AgaroseSigma-AldrichA-9539-500GFor microinjection
BD FACSAria IIBD BiosciencesNAFor cell sorting
Capillary tubeDrummond1-000-0010
Corning cell strainerCorningCLS431751For making single cell suspension
DMEM High Glucose MediaSigma-AldrichD5648FACS protocol
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)Sigma-AldrichE10521-50Gto immobilize ZF for imaging
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)Sigma-AldrichE5134For cold lysis buffer
FACS tubesBD-Biosciences342065FACS protocol
Fetal bovine serum (FBS)Invitrogen10270FACS protocol
Graphpad prism SoftwareGraphstats TechnologiesNAFor data representation
ImageJ SoftwareNational Institute of healthNAFor image analysis
Insulin Syringes (1 mL)DispoVanNAFor manual dechorionation
Melanin, SyntheticSigma-AldrichM8631For melanin content assay
MethylcelluloseSigma-AldrichM7027-250Gto immobilize ZF for imaging
Microloader tipsEppendorf5242956003For microinjection
MorpholinoGene-toolsNAFor knock-down experiments
N-Phenylthiourea (PTU)Sigma-AldrichP7629to inhibit melanin formation
Needle pullerSutter InstrumentP-97For microinjection
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge TubesThermo Fisher Scientific339650FACS protocol
Petridish (60 mm)Tarsons460090For embryo plates
Phenylmethylsulphonyl fluorideSigma-Aldrich10837091001For cold lysis buffer
Phosphate buffer saline (PBS)HiMediaTL1099-500mLFor washing cells
PronaseSigma-Aldrich53702For dechorionation
Protease inhibitor cocktailSigma-AldrichP8340For cold lysis buffer
Sheath fluidBD FACSFlowTM342003FACS protocol
Sodium phosphateMerck7558-79-4Cold lysis buffer
Triton X-100Sigma-AldrichT9284-500MLFor cold lysis buffer
TrypLEGibco1677119For trypsinization

Riferimenti

  1. Kelsh, R. N. Genetics and evolution of pigment patterns in fish. Pigment Cell Research. 17 (4), 326-336 (2004).
  2. Jablonski, N. G. The evolution of human skin and skin color. Annual Review of Anthropology. 33, 585-....

Ristampe e Autorizzazioni

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BiologiaNumero 181

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