הדמיה תלת מימדית של המטריצה החוץ תאית של הכבד במודל עכבר של דלקת כבד לא אלכוהולית

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מייעל את שיטות זילוח / דה-צלולריזציה באתרו של הכבד ושיטות מיקרוסקופיה של שני פוטונים כדי ליצור פלטפורמה אמינה להמחשת הדינמיקה של עיצוב מחדש של מטריצה חוץ-תאית (ECM) במהלך סטאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NASH).

Abstract

סטיאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NASH) היא מחלת הכבד הכרונית הנפוצה ביותר בארצות הברית, המשפיעה על יותר מ -70 מיליון אמריקאים. NASH יכול להתקדם לפיברוזיס ובסופו של דבר לשחמת הכבד, גורם סיכון משמעותי לקרצינומה הפטוצלולרית. המטריצה החוץ תאית (ECM) מספקת תמיכה מבנית ושומרת על הומאוסטזיס בכבד באמצעות אותות מטריתיים. פיברוזיס בכבד נובע מחוסר איזון בתהליך העיצוב מחדש הדינמי של ECM ומאופיין בהצטברות יתר של אלמנטים מבניים ושינויים נלווים בגליקוזאמינוגליקנים. דפוס הפיברוזיס הטיפוסי של NASH נקרא "חוט עוף", אשר בדרך כלל מורכב מפיברוזיס perisinusoidal/pericellular zone 3, בהתבסס על תכונות שנצפו על ידי כתם טריכרום של Masson וכתמים אדומים Picrosirius. עם זאת, טכניקות הדמיה מסורתיות דו-ממדיות (2D) מבוססות שקופיות רקמה אינן יכולות להדגים את השינויים המבניים המפורטים של ECM תלת-ממדי (3D), ומגבילים את ההבנה של עיצוב מחדש דינמי של ECM בפיברוזיס בכבד.

העבודה הנוכחית אופטימיזציה פרוטוקול מהיר ויעיל כדי לדמות את מבנה ECM המקורי בכבד באמצעות decellularization כדי להתמודד עם האתגרים לעיל. עכברים הוזנו בצ'או או במזון מהיר במשך 14 שבועות. דה-צלולריזציה בוצעה לאחר זילוח ורידים פורטלי באתרו , וטכניקות המיקרוסקופ הדו-פוטוני יושמו כדי לצלם ולנתח שינויים ב-ECM המקורי. התמונות התלת-ממדיות של הכבד הנורמלי והכבד NASH שוחזרו ונותחו. ביצוע דה-צלולריזציה של זילוח באתרו וניתוח הפיגום על ידי מיקרוסקופ של שני פוטונים סיפקו פלטפורמה מעשית ואמינה לדמיין את העיצוב מחדש הדינמי של ECM בכבד.

Introduction

מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD) היא מחלת הכבד הנפוצה ביותר, המשפיעה על 20%-25% מהאוכלוסייה הבוגרת. 25% מחולי NAFLD מתקדמים לסטיאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NASH), שם הסיכון לשחמת, אי ספיקת כבד וקרצינומה הפטוצלולרית עולה¹. ב-20 השנים הבאות, ההערכה היא כי NASH יהיה אחראי ל-2 מיליון מקרי מוות הקשורים לכבד בארה"ב². מכיוון שאין טיפולים מאושרים, יש צורך דחוף לפענח את המנגנונים הגורמים לפיברוזיס בכבד בחולי NASH ולפתח טיפול ממוקד³.

המטריצה החוץ תאית (ECM) היא מיקרו-סביבה דינמית ומורכבת המפעילה תקשורת דו-כיוונית עם תאים כדי לווסת את הומאוסטזיס רקמות⁴. ECM הכבד מורכב מאלמנטים מבניים כגון פרוטאוגליקנים, קולגן, פיברונקטין (fibronectin), אלסטין וחלבונים לא מבניים אחרים (למשל, אולפקטומדין וטרומבוספונדין) כדי לספק תמיכה פיזית ומבנית⁴.

פיברוזיס בכבד היא תגובה כרונית לריפוי פצעים לנזק לכבד של אטיולוגיות שונות, כולל NASH³. היא נובעת מחוסר איזון בתהליך העיצוב מחדש הדינמי של מטריצת ECM ומאופיינת בעודף חלבונים מבניים בכבד הפגוע⁴. פיברוגנזה תלויה בתקשורת התא-תא הדינמית בין סוגים שונים של תאי כבד. תאי סטלט בכבד (HSCs), כאשר הם מופעלים, מתמיינים לתאים דמויי מיופיברובלסטים המבטאים, נודדים ומתרבים של אקטין שריר חלק ומסנתזים חלבוני ECM כפעולה לסגירת פצעים. HSCs פעילים הם התאים המרכזיים מייצרי הקולגן בכבד¹.

המנגנון המולקולרי של עיצוב מחדש של ECM, דפוסי פיברוזיס והקשר שלהם לאירועים תאיים אינם ברורים. עדיין נדרשת הבנה טובה יותר של מבנה ה-ECM התלת-ממדי (3D), למרות שטכניקות ספקטרומטריית מסות סייעו לנתח את הרכב החלבונים ECM⁴. באופן מסורתי, כתם הטריכרום של מאסון, הכתמים האדומים של פיקרו סיריוס והדמיית הדור ההרמוני השני (SHG) בוצעו על קטעי כבד דקים דו-ממדיים (דו-ממדיים). דפוס הפיברוזיס הטיפוסי של NASH נקרא "חוט תרנגולת", אשר משתרע לאזור 3 והוא פיברוזיס perisinusoidal/pericellular ^5,6. עם זאת, חסרים מחקרים המתמקדים במבנה התלת-ממדי של הכבד הטבעי, במיוחד אלה שאינם כרוכים בחתך רקמות. גישות הדמיה חזקות לזיהוי דפוסים ומאפיינים של פיברוזיס במהלך עיצוב מחדש דינמי של ECM בפיברוזיס בכבד יחזקו באופן משמעותי את ההבנה של מנגנוני NASH ויזהו מטרות טיפוליות חדשות.

כדי להתמודד עם אתגרים אלה, פרוטוקול מהיר ויעיל הותאם להדמיה של ECM הכבד המקורי באמצעות דה-צלולריזציה⁷. דה-צלולריזציה של כל הכבד היא גישה להסרת התוכן התאי בכבד תוך שמירה על רשת ECM תלת-ממדית מקורית באמצעות זילוח חומרי ניקוי. עכברים הוזנו בצ'או או בדיאטת מזון מהיר (FFD) במשך 14 שבועות. דה-צלולריזציה בוצעה לאחר זילוח ורידים פורטלי באתרו עם חומר ניקוי עדין וספיקות נמוכות כדי לשמר מבני קולגן תלת-סליליים ופיברילריים מקומיים. מיקרוסקופ שני פוטונים יושם כדי לנתח שינויים במבני קולגן ב- ECM. התמונות התלת-ממדיות של מבנה ה-ECM המקורי בכבדים רגילים ובכבדי NASH שוחזרו ונותחו. ביצוע דה-צלולריזציה של זילוח באתרו וניתוח הפיגום במיקרוסקופ של שני פוטונים מספק פלטפורמה מעשית ובמחיר סביר לדמיין את העיצוב מחדש הדינמי של ECM בכבד.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים מבוצעים על פי נהלי הניסוי שאושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUCs) של אוניברסיטת סטנפורד ובית החולים לענייני חיילים משוחררים בפאלו אלטו. עכברים זכרים בני 6-8 שבועות C57BL/6J הוזנו בצ'או או בתזונה של מזון מהיר בתוספת סירופ תירס עתיר פרוקטוז 4.2% (ראו טבלת חומרים) במי שתייה במשך 14 שבועות⁵. העכברים הוחזקו בכלובים סטנדרטיים במחזור חושך/אור של 12 שעות.

1. הכנה כירורגית ונהלים של זילוח הכבד

1. שקול את העכבר לפני ההליך.
2. מרדימים את העכבר על ידי מתן קטמין (90 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג) (ראו טבלת חומרים) באמצעות הזרקה תוך צפקית. ודא שהעכבר מורדם לחלוטין על ידי צביטת בוהן לפני שתמשיך לשלב הבא.
   הערה: אין צורך באיזופלורן כאן מכיוון שמדובר בניתוח שאינו הישרדותי.
3. יש לגלח את אזור הגחון באמצעות קוצץ שיער ולחטא את העור באתנול 70%. הנח את העכבר על גבו, ולשתק את הרגליים על לוח הניתוחים עם קלטת.
4. לאחר אישור מחדש של עומק ההרדמה על ידי צביטת בוהן, השתמש במספריים של מאיו ומלקחיים אדסון (ראה טבלת חומרים) כדי לבצע חתך של 3 ס"מ לרוחב בבטן התחתונה ולאחר מכן חתך של 5 ס"מ אנכית מהבטן התחתונה לתהליך הקסיפואיד. היזהר לא לפתוח את חלל החזה.
5. לאחר פתיחת הצפק, מניחים בעדינות את המעיים משמאל לבעל החיים, ומרימים את האונה הימנית של הכבד עם מוליך עם קרני ריון (ראו טבלת חומרים) כדי לחשוף את הווריד הפורטלי.
6. צנתור את הווריד הפורטלי באמצעות צנתר 24 G IV. הכנס את הצנתר לקצה הדיסטלי של וריד הפורטל. הניחו את קצה הצנתר לפני שווריד הפורטל מסתעף לאונות הכבד.
7. למשוך את המחט מיד כאשר הצנתר נכנס לווריד. בדוק כי הצנתר ממוקם כראוי בתוך הווריד על ידי ניקוב הכבד עם PBS באמצעות מזרק 1mL דרך הצנתר.
   הערה: עם זילוח PBS, כל האונות צריכות להתכווץ מיד. אם הצנתר ממוקם כראוי, דם ורידי יזרום במהירות דרך הצנתר.
8. השתמש במלקחיים מיקרו של Dumont, מחזיק מיקרו-מחט Castroviejo, ותפר 4-0 (ראה טבלת חומרים) כדי להניח תפר מתחת להסתעפות של וריד הפורטל ותפר שני 1 ס"מ מתחת כדי לאבטח את הצנתר.

2. דה-צלולריזציה של רקמות

1. חבר את הצנתר לצינור סיליקון (~ 1 מ 'אורך, 3 מ"מ קוטר פנימי וקוטר חיצוני 4.1 מ"מ) עם מחבר Luer. חברו את צינורות הסיליקון למשאבה פריסטלטית ולמאגר המכיל מים שעברו דה-יוניזציה (ראו טבלת חומרים).
2. הסר בזהירות את בועות האוויר בתוך הצינור והימנע מיצירת בועות חדשות במהלך הזילוח. הגדר את המשאבה הפריסטלטית בתפוקת זרימה של 0.2 מ"ל/דקה (כלומר, 288 מ"ל/24 שעות).
3. יש לערבב תחילה עם מים שעברו דה-יוניזציה (~ 50 מ"ל / עכבר) למשך שעתיים. צבע הכבד ישתנה מאדום לצהוב במהלך הזילוח.
   הערה: תוקף בעל החיים יפוג לאחר 10 דקות של זילוח.
4. החליפו את תמיסת הזילוח לנתרן דאוקסיכולאט 0.5% (wt/vol) (DOC, ראו טבלת חומרים) והמשיכו למשך הלילה (18 שעות, ~250 מ"ל/עכבר). הכבד יהפוך לבן בסוף הזילוח (איור 1).
5. החליפו את תמיסת הזילוח למים שעברו דה-יוניזציה (~ 50 מ"ל/עכבר) ונתזה למשך שעתיים.
6. השתמשו במלקחיים זעירים של Dumont ובמספריים מיקרו-קפיציים (ראו טבלת חומרים) כדי לאסוף את הכבד שעבר דה-צלולריזציה ולשטוף אותו בזהירות בצלוחית פטרי עם PBS.
7. חתכו את הרקמה הדה-צלולרית לחתיכות קטנות לצורך הדמיה מיידית או הקפיאו בטמפרטורה של -80°C לאנליזה ביוכימית נוספת כגון ספקטרומטריית מסות טנדם, ELISA או כתם מערבי.

3. הכנת שקופיות להדמיה (במיקרוסקופ פלואורסצנטי מולטיפוטון/קונפוקל)

1. מעבירים חתיכה קטנה של כבד נטול תאים (<3 x 3 x 3 מ"מ) לשקופית מיקרוסקופ ומניחים את הרקמה באמצע.
2. הוסף 10 μL של אמצעי הרכבה נגד דהייה (ראה טבלת חומרים) לרקמה עם פיפטה כדי למנוע התייבשות רקמות.
3. מכסים את הרקמה בזכוכית כיסוי ומפעילים כוח קטן כדי לשטח את הדגימה. אטמו את שולי זכוכית הכיסוי בלק חסר צבע ושקוף (איור 2).
   הערה: בשל קיבוע שני הפוטון הזקוף דרך המיקרוסקופ, נעשה שימוש בזכוכית כיסוי על הדגימה. עם זאת, ניתן למקם דגימות באופן שונה אם משתמשים במיקרוסקופ הפוך.

4. רכישת תמונות

1. הניחו טיפת שמן טבילה על החלק העליון של זכוכית הכיסוי והניחו את המגלשה על מחזיק המגלשה במיקרוסקופ. מנמיכים את עדשת האובייקט עם שמן 20x עד שהיא באה במגע עם שמן הטבילה.
2. עבור לערוץ הסגול (405 ננומטר), הפעל את התריס והתמקד בדגימה. נווט ומקם את תחום העניין להדמיה. כבה את התריס לפני המעבר לרכישת תמונה באמצעות אור לייזר.
3. עבור לפקד המחשב והפעל את הלייזר של שני פוטונים. הפעילו תחילה את הלייזר הדו-פוטוני (איור 3A), ואז הפעילו את בקר הלייזר הדו-פוטוני (ראו טבלת חומרים) ואת התריס (איור 3B,C). ודא שהספק המוצא גבוה מ- 2.5 ואט.
   הפחת את עוצמת הלייזר כדי למנוע מרווה פלואורסצנטית. בחר והתאם גלאים (הן מכפילי אור והן היברידיים) כדי להתאים לפלואורופורים שנבחרו.
   הערה: הדמיה של שני פוטונים בוצעה באורך גל עירור של 860 ננומטר. שתי תעלות נבחרו עבור תמונות קולגן SHG ושני פוטונים מעוררים פלואורסצנטיים (TPEF), בהתאמה. ערוץ אחד המתאים לטווח אורכי גל של 415-445 ננומטר זיהה את המבנה המפורט של קולגן מאותות SHG. ערוץ נוסף כיסה את הטווח של 465-669 ננומטר לאיסוף אותות TPEF.
4. בחר רכישות תמונה בו-זמניות או רציפות. התאם את חור הסיכה לערך הגבוה ביותר. התאם את אורכי הגל של הלייזר, הרווח, ההספק וההסטה. התאימו את זמן השהייה של הפיקסלים, את גודל הפיקסלים, הממוצע ואת הזום (איור 4A).
5. גלול בבקר z של המחשב והגדר את ממדי z, הגדר את נקודות ההתחלה והסיום, ובחר את מספר התמונות הנתון באמצעי אחסון (z-stack). רכוש תמונות.
   הערה: כאן נבחר נפח Z של 20 מיקרומטר וגודל של 1 מיקרומטר Z-step (איור 4B).

תוצאות

סיבי הקולגן זוהו באמצעות יצירה הרמונית שנייה ומיקרוסקופ של שני פוטונים. האות מגיע ממבני הקולגן התלת-סלילי והפיברילרי הטבעי. נוגדנים ספציפיים לא שימשו לניתוח תת-סוגים של קולגן; עם זאת, ניתן להוסיף זאת לטכניקת ההדמיה.

כאשר רקמת הכבד נחקרת ללא דה-צלולריזציה, מאתגר לקבל תמונות ?...

Discussion

הפרוטוקול הנוכחי מראה כי דה-צלולריזציה באמצעות זילוח DOC באתרו בקצב זרימה נמוך משמרת את מבני הקולגן התלת-סלילי והפיברילרי הטבעי, ומספקת פלטפורמה אמינה וחסכונית ללכידת עיצוב מחדש דינמי של ECM בפיברוזיס כבד NASH. למרות שדה-צלולריזציה בוצעה בכבדים רגילים ופיברוטיים לפני זיהוי רכיבי ECM או יצ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3	MONOCRYL	Y494G
4-0 suture	fisher scientific	10-000-649	https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true
AnaSed Injection (xylazine)	AnaSed	NDC 59399-110-20	this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian.
BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY	BD	382612
Chow diet	Envigo	# 2918	Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents.
Fast-food diet (AIN76A Western Diet)	Test Diet	1810060	https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf
Hematoxylin and Eosin Stain Kit	vectorlabs	H-3502	https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html
Kent Scientific Rat Surgical Kit	fisher scientific	13-005-205	https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit
KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION	Vedco	NDC 50989-996-06 - 10 mL - vial.	KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage.
Leica SP5 upright Confocal, multi-photon	Leica	SP5
Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®)	bbraun	D300	https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html
Picrosirius Red Stain Kit	Polysciences, Inc.	24901	https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771
Rayon tipped applicator	puritan	25-806 1PR
Sodium deoxycholate	sigmaaldrich	D6750-100G
Syrup	www.target.com	24 fl oz	https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801
Variable Speed Peristaltic Pump	INTLLAB	BT100	https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	vectorlabs	H-1000-10	https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html