非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中肝细胞外基质的 3D 成像

摘要

本协议优化了肝脏 原位 灌注/脱细胞和双光子显微镜方法，以建立一个可靠的平台来可视化非酒精性脂肪性肝炎（NASH）期间细胞外基质（ECM）重塑的动力学。

摘要

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是美国最常见的慢性肝病，影响超过7000万美国人。NASH可进展为纤维化，最终发展为肝硬化，肝硬化是肝细胞癌的重要危险因素。细胞外基质（ECM）提供结构支持，并通过母细胞信号 维持 肝脏稳态。肝纤维化是由动态ECM重塑过程中的不平衡引起的，其特征是结构元素的过度积累和糖胺聚糖的相关变化。NASH的典型纤维化模式称为"鸡丝"，通常由3区窦周/细胞周围纤维化组成，基于Masson的三色染色和Picrosirius Red染色观察到的特征。然而，这些传统的基于薄二维（2D）组织切片的成像技术无法证明详细的三维（3D）ECM结构变化，限制了对肝纤维化动态ECM重塑的理解。

目前的工作优化了一种快速有效的方案，通过去细胞化 对 肝脏中的天然ECM结构进行成像，以应对上述挑战。用食物或快餐喂养小鼠14周。原 位 门静脉灌注后进行脱细胞，并应用双光子显微镜技术对天然ECM的变化进行成像和分析。对正常肝和NASH肝的3D图像进行重构和分析。通过双光子显微镜进行 原位 灌注脱细胞和分析支架，为可视化肝脏动态ECM重塑提供了一个实用可靠的平台。

引言

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是最常见的肝脏疾病，影响20%-25%的成年人口。25% 的 NAFLD 患者进展为非酒精性脂肪性肝炎 （NASH），此时肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌的风险增加¹.在接下来的20年里，据估计，NASH将占美国200万与肝脏相关的^死亡。由于没有批准的治疗方法，迫切需要破译导致NASH患者肝纤维化的机制并开发靶向治疗³。

细胞外基质（ECM）是一个动态、复杂的微环境，它与细胞进行双向通信以调节组织稳态⁴。肝脏ECM由蛋白聚糖、胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白等结构元素和其他非结构蛋白（例如嗅觉素和血小板反应素）组成，以提供物理和结构支持⁴。

肝纤维化是对各种病因的肝损伤（包括NASH³）的慢性伤口愈合反应。它是由动态ECM基质重塑过程中的不平衡引起的，其特征在于^{受伤肝脏中}结构蛋白过多4。纤维化取决于不同肝细胞类型之间的动态细胞间通讯。肝星状细胞（HSC）在激活时分化为平滑肌Alpha 2肌动蛋白表达，迁移和增殖肌成纤维细胞样细胞，并合成ECM蛋白作为伤口闭合作用。活化的造血干细胞是肝脏中产生胶原蛋白的中枢细胞¹。

ECM重塑的分子机制，纤维化模式及其与细胞事件的关系尚不清楚。尽管质谱技术有助于分析ECM^{蛋白组成4}，但仍需要更好地了解三维（3D）ECM结构。传统上，马森氏三色染色、Picro 天狼星红染色和二次谐波产生 （SHG） 成像已在二维 （2D） 薄肝切片上进行。NASH的典型纤维化模式称为"鸡丝"，它延伸到3区，是窦周/细胞周围纤维化^5，6。然而，缺乏针对天然肝脏3D结构的研究，特别是那些不涉及组织切片的研究。通过肝纤维化动态ECM重塑来识别纤维化的模式和特征的稳健成像方法将显着加强对NASH机制的理解并确定新的治疗靶点。

为了应对这些挑战，优化了一种快速有效的方案，通过脱细胞7对天然肝脏ECM进行成像。全肝脱细胞是一种去除肝细胞内容物的方法，同时通过洗涤剂灌注维持天然 3D ECM 网络。小鼠喂食食物或快餐饮食（FFD）14周。在用温和的洗涤剂和低流速原位门静脉灌注后进行脱细胞，以保留三螺旋和天然原纤维胶原蛋白结构。应用双光子显微镜分析ECM中胶原蛋白结构的变化。对正常肝和NASH肝中天然ECM结构的3D图像进行了重构和分析。通过双光子显微镜进行原位灌注脱细胞和分析支架提供了一个实用且经济实惠的平台来可视化肝脏中的动态ECM重塑。

研究方案

动物实验是根据斯坦福大学机构动物护理和使用委员会（IACUCs）和帕洛阿尔托退伍军人事务医院批准的实验程序进行的。将6-8周龄雄性C57BL / 6J小鼠喂食食物或快餐饮食，并在饮用水中补充4.2%高果糖玉米糖浆（见 材料表）14^周5。将小鼠以12小时的暗/光循环保持在标准笼中。

1.肝脏灌注的手术准备和程序

1. 在手术前称量鼠标。
2. 通过腹膜内注射给予氯胺酮（90mg / kg）和甲苯噻嗪（10mg / kg）（参见 材料表）麻醉小鼠。在继续下一步之前，请确保通过捏脚趾完全麻醉鼠标。
   注意:这里不需要异氟醚，因为这是一种非生存性手术。
3. 使用理发器剃除腹侧区域，并用70%乙醇消毒皮肤。将鼠标放在其背上，并用胶带将腿固定在手术板上。
4. 通过捏住脚趾重新确认麻醉深度后，使用妙佑医疗国际剪刀和 Adson 镊子（见 材料表）在下腹部横向切开 3 厘米的切口，然后从低腹部垂直切开 5 厘米的切口到剑突。注意不要打开胸腔。
5. 打开腹膜后，轻轻地将肠道放在动物的左侧，并用人造丝尖端涂抹器（见 材料表）抬高肝脏的右叶以暴露门静脉。
6. 使用 24 G IV 导管导管门静脉。将导管引入门静脉的远端。在门静脉分支到肝叶之前放置导管尖端。
7. 当导管进入静脉时立即拔出针头。通过使用 1mL 注射器通过导管 向 肝脏注入 PBS 来检查导管是否正确放置在静脉内。
   注意:PBS灌注后，所有叶应立即变白。如果导管放置正确，静脉血液将迅速流过导管。
8. 使用Dumont微型镊子，Castroviejo微针支架和4-0缝合线（见 材料表）在门静脉分支下方放置一针，并在下方1厘米处放置第二针以固定导管。

2. 组织脱细胞

1. 使用鲁尔连接器将导管连接到硅胶管（~1 m 长、3 mm 内径和 4.1 mm 外径）。将硅胶管连接到蠕动泵和含有去离子水的储液罐（参见 材料表）。
2. 小心去除管内的气泡，避免在灌注过程中产生新的气泡。将蠕动泵设置为0.2 mL / min（即288 mL / 24小时）的流量输出。
3. 首先用去离子水（~50mL /小鼠）灌注2小时。灌注过程中肝脏的颜色会从红色变为黄色。
   注意:动物将在灌注 10 分钟后过期。
4. 将灌注溶液切换到0.5%（wt /vol）脱氧胆酸钠（DOC，参见 材料表）并继续过夜（18小时，~250mL /小鼠）。灌注结束时肝脏会变白（图1）。
5. 将灌注溶液切换到去离子水（~50mL /小鼠）并灌注2小时。
6. 使用Dumont微型镊子和微型弹簧剪刀（见 材料表）收集脱细胞肝脏，并在带有PBS的培养皿中仔细洗涤。
7. 将脱细胞组织切成小块以便立即成像或在-80°C冷冻以进行进一步的生化分析，例如串联质谱，ELISA或蛋白质印迹。

3. 用于成像的载玻片制备（使用多光子/共聚焦荧光显微镜）

1. 将一小块脱细胞肝脏（<3 x 3 x 3 mm）转移到显微镜载玻片上，并将组织放在中间。
2. 用移液管向组织中加入 10 μL 抗淬灭封片剂（参见 材料表），以避免纸巾干燥。
3. 用盖玻片覆盖组织，并施加小力使样品变平。用无色透明指甲油密封盖玻片的边缘（图2）。
   注意:由于通过显微镜设置了直立的双光子，因此在样品上使用盖玻片。但是，如果使用倒置显微镜，样品的放置方式可能会有所不同。

4. 图像采集

1. 将一滴浸油放在盖玻片的顶部，然后将载玻片放在显微镜载玻片支架上。降低20倍油物镜，直到其接触浸油。
2. 切换到紫色（405 nm）通道，打开快门，然后聚焦在样品上。导航并定位感兴趣的区域以进行成像。在使用激光进行图像采集之前关闭快门。
3. 切换到计算机控制并启动双光子激光器。首先打开双光子激光器（图3A），然后打开双光子激光控制器（见材料表）和快门（图3B，C）。确保输出功率高于 2.5 W。
   降低激光功率以防止荧光淬灭。选择并调整检测器（光电倍增管和混合检测器）以适应所选的荧光团。
   注意:双光子成像是在860nm的激发波长下进行的。胶原SHG和双光子激发荧光（TPEF）图像分别选择两个通道。对应于415-445nm波长范围的一个通道从SHG信号中检测胶原蛋白的详细结构。另一个通道覆盖465-669 nm的范围以收集TPEF信号。
4. 选择同步或顺序图像采集。将针孔调整到最大值。调整激光波长、增益、功率和偏移。调整像素停留时间、像素大小、平均值和变焦（图 4A）。
5. 滚动计算机 z 控制器并设置 z 尺寸，定义起点和终点，然后选择卷内给定的图像数量（z 堆栈）。获取图像。
   注意:这里选择了20μm Z体积和1μm Z步长（图4B）。

结果

用二次谐波产生和双光子显微镜检测胶原纤维。信号来自易碎的三螺旋和天然原纤维胶原蛋白结构。特异性抗体未用于分析胶原蛋白亚型;但是，这可以添加到成像技术中。

当在没有去细胞化的情况下研究肝组织时，获得胶原蛋白网络的高分辨率图像具有挑战性 （图5A）。 在脱细胞ECM中，胶原纤维（绿色）呈现平行或交织 （

讨论

本协议表明，通过低流速DOC原位灌注进行脱细胞可保留易碎的三螺旋和天然原纤维胶原结构，为捕获NASH肝纤维化的动态ECM重塑提供了可靠且具有成本效益的平台。尽管在鉴定ECM成分或生成用于细胞培养的生物支架之前，已在正常和纤维化肝脏中进行去细胞化，但ECM重塑在肝纤维化中的动力学尚未得到充分研究⁸，^9，10。?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3	MONOCRYL	Y494G
4-0 suture	fisher scientific	10-000-649	https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true
AnaSed Injection (xylazine)	AnaSed	NDC 59399-110-20	this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian.
BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY	BD	382612
Chow diet	Envigo	# 2918	Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents.
Fast-food diet (AIN76A Western Diet)	Test Diet	1810060	https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf
Hematoxylin and Eosin Stain Kit	vectorlabs	H-3502	https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html
Kent Scientific Rat Surgical Kit	fisher scientific	13-005-205	https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit
KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION	Vedco	NDC 50989-996-06 - 10 mL - vial.	KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage.
Leica SP5 upright Confocal, multi-photon	Leica	SP5
Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®)	bbraun	D300	https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html
Picrosirius Red Stain Kit	Polysciences, Inc.	24901	https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771
Rayon tipped applicator	puritan	25-806 1PR
Sodium deoxycholate	sigmaaldrich	D6750-100G
Syrup	www.target.com	24 fl oz	https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801
Variable Speed Peristaltic Pump	INTLLAB	BT100	https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	vectorlabs	H-1000-10	https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html