Alkolsüz Steatohepatitin Bir Fare Modelinde Karaciğer Hücre Dışı Matriksin 3D Görüntülenmesi

Özet

Mevcut protokol, alkolsüz steatohepatit (NASH) sırasında hücre dışı matriks (ECM) yeniden şekillenmesinin dinamiklerini görselleştirmek için güvenilir bir platform oluşturmak üzere karaciğer in situ perfüzyon / desellülarizasyon ve iki foton mikroskopi yöntemlerini optimize etmektedir.

Özet

Alkolsüz steatohepatit (NASH), Amerika Birleşik Devletleri'nde 70 milyondan fazla Amerikalıyı etkileyen en yaygın kronik karaciğer hastalığıdır. NASH, fibrozise ve nihayetinde hepatosellüler karsinom için önemli bir risk faktörü olan siroza ilerleyebilir. Hücre dışı matriks (ECM) yapısal destek sağlar ve matrisellüler sinyaller yoluyla karaciğer homeostazını korur. Karaciğer fibrozisi, dinamik ECM yeniden şekillenme sürecindeki bir dengesizlikten kaynaklanır ve yapısal elementlerin aşırı birikimi ve glikozaminoglikanlarda ilişkili değişiklikler ile karakterizedir. NASH'ın tipik fibroz paterni, Masson'un trikrom boyası ve Picrosirius Kırmızı lekeleri tarafından gözlemlenen özelliklere dayanarak, genellikle bölge 3 perisinüzoidal / perisellüler fibrozdan oluşan "tavuk teli" olarak adlandırılır. Bununla birlikte, bu geleneksel ince iki boyutlu (2D) doku slaytına dayalı görüntüleme teknikleri, ayrıntılı üç boyutlu (3D) ECM yapısal değişikliklerini gösteremez ve karaciğer fibrozunda dinamik ECM yeniden şekillenmesinin anlaşılmasını sınırlar.

Mevcut çalışma, yukarıdaki zorlukları ele almak için desellülarizasyon yoluyla karaciğerdeki doğal ECM yapısını görüntülemek için hızlı ve verimli bir protokolü optimize etti. Fareler 14 hafta boyunca chow veya fast-food diyeti ile beslendi. Desellülarizasyon in situ portal ven perfüzyonundan sonra yapıldı ve iki fotonlu mikroskopi teknikleri doğal ECM'deki değişiklikleri görüntülemek ve analiz etmek için uygulandı. Normal ve NASH karaciğerlerinin 3D görüntüleri yeniden oluşturuldu ve analiz edildi. İn situ perfüzyon desellülarizasyonunun yapılması ve iskelenin iki foton mikroskobu ile analiz edilmesi, karaciğerdeki dinamik ECM yeniden şekillenmesini görselleştirmek için pratik ve güvenilir bir platform sağlamıştır.

Giriş

Non-alkolik yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD), yetişkin popülasyonun% 20-25'ini etkileyen en yaygın karaciğer hastalığıdır. NAFLD hastalarının% 25'i siroz, karaciğer yetmezliği ve hepatosellüler karsinom riskinin arttığı alkolsüz steatohepatite (NASH) ilerler¹. Önümüzdeki 20 yıl içinde, NASH'ın ABD 2'de² milyon karaciğere bağlı ölümden sorumlu olacağı tahmin edilmektedir. Onaylanmış tedavileri olmadığından, NASH hastalarında karaciğer fibrozuna neden olan mekanizmaların deşifre edilmesine ve hedefe yönelik tedavinin geliştirilmesine acil ihtiyaç vardır³.

Hücre dışı matriks (ECM), doku homeostazını düzenlemek için hücrelerle çift yönlü iletişim kuran dinamik, karmaşık bir mikro ortamdır⁴. Karaciğer ECM, fiziksel ve yapısal destek sağlamak için proteoglikanlar, kollajenler, fibronektin, elastin ve diğer yapısal olmayan proteinler (örneğin, olfaktomedin ve trombozpondin) gibi yapısal elemanlardan oluşur⁴.

Karaciğer fibrozisi, NASH³ dahil olmak üzere çeşitli etiyolojilerin karaciğer hasarına karşı kronik yara iyileşmesi yanıtıdır. Dinamik ECM matriks yeniden şekillendirme sürecindeki bir dengesizlikten kaynaklanır ve yaralı karaciğerde aşırı yapısal proteinler ile karakterizedir⁴. Fibrogenez, farklı hepatik hücre tipleri arasındaki dinamik hücre-hücre iletişimine bağlıdır. Hepatik yıldız hücreleri (HSC'ler), aktive edildiğinde, Düz Kas Alfa 2 Aktin eksprese eden, göç eden ve çoğalan miyofibroblast benzeri hücrelere farklılaşır ve ECM proteinlerini yara kapatma eylemi olarak sentezler. Aktive HSC'ler karaciğerdeki merkezi kollajen üreten hücrelerdir¹.

ECM yeniden şekillenmesinin moleküler mekanizması, fibrozis paternleri ve hücresel olaylarla ilişkisi açık değildir. Kütle spektrometresi teknikleri ECM protein bileşimi^4'ün analiz edilmesine yardımcı olsa da, üç boyutlu (3D) ECM yapısının daha iyi anlaşılması hala gereklidir. Geleneksel olarak, Masson'un trikrom boyası, Picro Sirius Kırmızı lekeleri ve ikinci harmonik nesil (SHG) görüntüleme iki boyutlu (2D) ince karaciğer kesitlerinde gerçekleştirilmiştir. NASH'ın tipik fibroz paterni, bölge 3'e uzanan ve perisinüzoidal / perisellüler fibroz ^5,6 olan "tavuk teli" olarak adlandırılır. Bununla birlikte, doğal karaciğerin 3D yapısına, özellikle de doku bölümlemesini içermeyenlere odaklanan çalışmaların eksikliği olmuştur. Karaciğer fibrozisinde dinamik ECM yeniden şekillenmesi sırasında fibrozisin paternlerini ve özelliklerini tanımlamak için sağlam görüntüleme yaklaşımları, NASH mekanizmalarının anlaşılmasını ve yeni terapötik hedeflerin belirlenmesini önemli ölçüde güçlendirecektir.

Bu zorlukların üstesinden gelmek için, doğal karaciğer ECM'sini hücre desellülarizasyonu yoluyla görüntülemek için hızlı ve verimli bir protokol optimize edilmiştir⁷. Tüm karaciğer desellülarizasyonu, deterjan perfüzyonu yoluyla doğal 3D ECM ağını korurken hepatik hücresel içeriği uzaklaştırmak için bir yaklaşımdır. Fareler 14 hafta boyunca chow veya fast-food diyeti (FFD) ile beslendi. Üçlü helisel ve doğal fibriller kollajen yapılarını korumak için hafif deterjan ve düşük akış hızı ile in situ portal ven perfüzyonu sonrası desellülarizasyon yapıldı. ECM'de kollajen yapılarındaki değişiklikleri analiz etmek için iki foton mikroskobu uygulandı. Normal ve NASH karaciğerlerindeki doğal ECM yapısının 3D görüntüleri yeniden oluşturuldu ve analiz edildi. İn situ perfüzyon desellülarizasyonunun yapılması ve iskelenin iki foton mikroskobu ile analiz edilmesi, karaciğerdeki dinamik ECM yeniden şekillenmesini görselleştirmek için pratik ve uygun fiyatlı bir platform sağlar.

Protokol

Hayvan deneyleri, Stanford Üniversitesi'nin kurumsal hayvan bakım ve kullanım komiteleri (IACUC'ler) ve Palo Alto'daki Gazi İşleri Hastanesi tarafından onaylanan deneysel prosedürlere göre gerçekleştirilir. 6-8 haftalık erkek C57BL / 6J fareleri, 14 hafta boyunca içme suyunda% 4.2 yüksek fruktozlu mısır şurubu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile desteklenmiş bir chow veya fast-food diyeti ile beslendi⁵. Fareler 12 saatlik bir karanlık / aydınlık döngüsünde standart kafeslerde tutuldu.

1. Karaciğer perfüzyonunun cerrahi hazırlığı ve prosedürleri

1. İşlemden önce fareyi tartın.
2. İntraperitoneal enjeksiyon yoluyla Ketamin (90 mg / kg) ve Xylazine (10 mg / kg) (bkz. Bir sonraki adıma geçmeden önce farenin ayak parmağıyla kıstırma ile tamamen uyuşturulduğundan emin olun.
   NOT: Burada izofluran'a gerek yoktur, çünkü bu hayatta kalmayan bir ameliyattır.
3. Ventral bölgeyi bir saç kesme makinesi kullanarak tıraş edin ve cildi% 70 etanol ile dezenfekte edin. Fareyi sırtına yerleştirin ve ameliyat tahtasındaki bacakları bantla hareketsiz hale getirin.
4. Anestezinin derinliğini bir ayak parmağı sıkışmasıyla tekrar doğruladıktan sonra, alt karın bölgesinde lateral olarak 3 cm'lik bir kesi yapmak için Mayo makası ve Adson forseps kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve daha sonra alt karın bölgesinden ksifoid sürece dikey olarak 5 cm'lik bir kesi yapın. Göğüs boşluğunu açmamaya dikkat edin.
5. Peritonu açtıktan sonra, bağırsakları yavaşça hayvanın soluna yerleştirin ve portal damarı ortaya çıkarmak için karaciğerin sağ lobunu Rayon uçlu bir aplikatör ile yükseltin (bkz.
6. Portal veni 24 G IV kateter kullanarak kateterize edin. Kateteri portal venin distal ucuna sokun. Kateter ucunu portal ven dalları hepatik loblara dallanmadan önce yerleştirin.
7. Kateter damara girdiğinde iğneyi hemen çekin. Kateter yoluyla 1mL'lik bir şırınga kullanarak karaciğeri PBS ile perfüze ederek kateterin damar içine doğru şekilde yerleştirildiğini kontrol edin.
   NOT: PBS perfüzyonu üzerine, tüm loblar hemen ağartmalıdır. Kateter doğru yerleştirilirse, venöz kan kateterden hızla akacaktır.
8. Portal venin dallanmasının altına bir dikiş ve kateteri sabitlemek için 1 cm aşağıya ikinci bir dikiş yerleştirmek için Dumont mikro forseps, Castroviejo mikroiğne tutucu ve 4-0 sütür (bkz.

2. Doku desellülarizasyonu

1. Kateteri bir Luer konektörü ile bir silikon boruya (~ 1 m uzunluk, 3 mm iç çap ve 4,1 mm dış çap) bağlayın. Silikon boruyu peristaltik bir pompaya ve deiyonize su içeren bir rezervuara bağlayın (bkz.
2. Tüpün içindeki hava kabarcıklarını dikkatlice çıkarın ve perfüzyon sırasında yeni kabarcıklar oluşturmaktan kaçının. Peristaltik pompayı 0,2 mL/dak (yani 288 mL/24 saat) akış çıkışına ayarlayın.
3. İlk önce 2 saat boyunca deiyonize su (~ 50 mL / fare) ile perfüze edin. Perfüzyon sırasında karaciğerin rengi kırmızıdan sarıya değişecektir.
   NOT: Hayvanın süresi 10 dakikalık perfüzyondan sonra sona erecektir.
4. Perfüzyon çözeltisini %0,5 (ağırlık/hacim) sodyum deoksikolata (DOC, bakınız Malzeme Tablosu) değiştirin ve gece boyunca devam edin (18 saat, ~250mL/fare). Perfüzyon sonunda karaciğer beyazlaşır (Şekil 1).
5. Perfüzyon çözeltisini deiyonize suya (~ 50 mL / fare) değiştirin ve 2 saat boyunca perfüze edin.
6. Dumont mikro forseps ve mikro yaylı makas kullanın (bkz. Malzeme Tablosu) ve hücreden arındırılmış karaciğeri toplamak ve PBS ile Petri kabında dikkatlice yıkayın.
7. Hücreden arındırılmış dokuyu anında görüntüleme için küçük parçalara ayırın veya tandem kütle spektrometrisi, ELISA veya batı lekesi gibi daha ileri biyokimyasal analizler için -80 ° C'de dondurun.

3. Görüntüleme için slayt hazırlama (multifoton/konfokal floresan mikroskobu ile)

1. Küçük bir desellülarize karaciğer parçasını (<3 x 3 x 3 mm) mikroskop slaytına aktarın ve dokuyu ortasına yerleştirin.
2. Dokunun kurumasını önlemek için bir pipetle dokuya 10 μL antifade montaj ortamı (bkz. Malzeme Tablosu) ekleyin.
3. Dokuyu bir kapak camıyla örtün ve numuneyi düzleştirmek için küçük bir kuvvet uygulayın. Kapak camının kenarlarını renksiz ve şeffaf oje ile kapatın (Şekil 2).
   NOT: Dik iki fotonun mikroskoptan ayarlanması nedeniyle, numune üzerinde bir kapak camı kullanılmıştır. Bununla birlikte, ters çevrilmiş bir mikroskop kullanıldığında örnekler farklı şekilde yerleştirilebilir.

4. Görüntü alma

1. Kapak camının üstüne bir damla daldırma yağı yerleştirin ve slaytı mikroskop slayt tutucusuna yerleştirin. 20x yağ objektif lensini, daldırma yağına temas edene kadar indirin.
2. Mor (405 nm) kanala geçin, deklanşörü açın ve örneğe odaklanın. Görüntüleme için ilgi alanında gezinin ve konumlandırın. Lazer ışığını kullanarak görüntü yakalamaya geçmeden önce deklanşörü kapatın.
3. Bilgisayar kontrolüne geçin ve iki fotonlu lazeri başlatın. Önce iki fotonlu lazeri açın (Şekil 3A), ardından iki fotonlu lazer kontrol cihazını (bkz. Malzeme Tablosu) ve deklanşörü (Şekil 3B, C) açın. Çıkış gücünün 2,5 W'tan yüksek olduğundan emin olun.
   Floresan söndürmeyi önlemek için lazer gücünü azaltın. Seçilen floroforları barındırmak için dedektörleri (hem fotoçarpanlar hem de hibrit) seçin ve ayarlayın.
   NOT: İki fotonlu görüntüleme, 860 nm'lik bir uyarma dalga boyunda gerçekleştirildi. Kollajen SHG ve iki foton uyarılmış floresan (TPEF) görüntüleri için sırasıyla iki kanal seçildi. 415-445 nm dalga boyu aralığına karşılık gelen bir kanal, SHG sinyallerinden kollajenin ayrıntılı yapısını tespit etti. Başka bir kanal, TPEF sinyallerini toplamak için 465-669 nm aralığını kapsıyordu.
4. Eşzamanlı veya sıralı görüntü alımlarını seçin. İğne deliğini en yüksek değere ayarlayın. Lazer dalga boylarını, kazancı, gücü ve ofseti ayarlayın. Piksel bekleme süresini, piksel boyutunu, ortalamasını ve yakınlaştırmayı ayarlayın (Şekil 4A).
5. Bilgisayar z-denetleyicisini kaydırın ve z-boyutlarını ayarlayın, başlangıç ve bitiş noktalarını tanımlayın ve bir birim (z-yığını) içinde verilen görüntü sayısını seçin. Görüntüleri alın.
   NOT: Burada 20 μm Z hacim ve 1 μm Z-adım boyutu seçilmiştir (Şekil 4B).

Sonuçlar

Kollajen lifleri ikinci harmonik jenerasyon ve iki foton mikroskobu ile tespit edildi. Sinyal, kırılabilir üçlü sarmal ve doğal fibriller kollajen yapılarından gelir. Kollajen alt tiplerini analiz etmek için spesifik antikorlar kullanılmadı; Bununla birlikte, bu görüntüleme tekniğine eklenebilir.

Karaciğer dokusu desellülarizasyon olmadan incelendiğinde, kollajen ağının yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etmek zordur (Şekil 5A

Tartışmalar

Mevcut protokol, düşük akış hızına sahip DOC in situ perfüzyon yoluyla desellülarizasyonun, NASH karaciğer fibrozisinde dinamik ECM yeniden şekillenmesini yakalamak için güvenilir ve uygun maliyetli bir platform sağlayarak, kırılabilir üçlü sarmal ve doğal fibriller kollajen yapılarını koruduğunu göstermektedir. ECM bileşenlerini tanımlamadan veya hücre kültürü için biyolojik iskeleler oluşturmadan önce normal ve fibrotik karaciğerlerde desellülarizasyon yapılmasına rağmen,...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3	MONOCRYL	Y494G
4-0 suture	fisher scientific	10-000-649	https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true
AnaSed Injection (xylazine)	AnaSed	NDC 59399-110-20	this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian.
BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY	BD	382612
Chow diet	Envigo	# 2918	Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents.
Fast-food diet (AIN76A Western Diet)	Test Diet	1810060	https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf
Hematoxylin and Eosin Stain Kit	vectorlabs	H-3502	https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html
Kent Scientific Rat Surgical Kit	fisher scientific	13-005-205	https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit
KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION	Vedco	NDC 50989-996-06 - 10 mL - vial.	KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage.
Leica SP5 upright Confocal, multi-photon	Leica	SP5
Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®)	bbraun	D300	https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html
Picrosirius Red Stain Kit	Polysciences, Inc.	24901	https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771
Rayon tipped applicator	puritan	25-806 1PR
Sodium deoxycholate	sigmaaldrich	D6750-100G
Syrup	www.target.com	24 fl oz	https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801
Variable Speed Peristaltic Pump	INTLLAB	BT100	https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	vectorlabs	H-1000-10	https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html