3D-Bildgebung der extrazellulären Matrix der Leber in einem Mausmodell der nicht-alkoholischen Steatohepatitis

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll optimiert die Methoden der Leber-in-situ-Perfusion/Dezellularisierung und der Zwei-Photonen-Mikroskopie, um eine zuverlässige Plattform zur Visualisierung der Dynamik des Remodells der extrazellulären Matrix (EZM) während der nicht-alkoholischen Steatohepatitis (NASH) zu schaffen.

Zusammenfassung

Die nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH) ist die häufigste chronische Lebererkrankung in den Vereinigten Staaten und betrifft mehr als 70 Millionen Amerikaner. NASH kann zu einer Fibrose und schließlich zu einer Zirrhose fortschreiten, einem signifikanten Risikofaktor für ein hepatozelluläres Karzinom. Die extrazelluläre Matrix (EZM) bietet strukturelle Unterstützung und hält die Leberhomöostase über matrizelluläre Signale aufrecht. Die Leberfibrose resultiert aus einem Ungleichgewicht im dynamischen EZM-Umbauprozess und ist gekennzeichnet durch eine übermäßige Akkumulation von Strukturelementen und damit verbundene Veränderungen der Glykosaminoglykane. Das typische Fibrosemuster von NASH wird als "Maschendraht" bezeichnet, der in der Regel aus perisinusoidaler/perizellulärer Fibrose der Zone 3 besteht, basierend auf Merkmalen, die durch die Trichromfärbung von Masson und die Färbung von Picrosirius Red beobachtet wurden. Diese traditionellen dünnen zweidimensionalen (2D) Gewebeobjektträger-basierten Bildgebungsverfahren können jedoch die detaillierten dreidimensionalen (3D) EZM-Strukturveränderungen nicht darstellen, was das Verständnis des dynamischen EZM-Umbaus bei Leberfibrose einschränkt.

In der aktuellen Arbeit wurde ein schnelles und effizientes Protokoll zur Abbildung der nativen EZM-Struktur in der Leber mittels Dezellularisierung optimiert, um die oben genannten Herausforderungen zu bewältigen. Die Mäuse wurden 14 Wochen lang entweder mit Chow- oder Fast-Food-Diät gefüttert. Die Dezellularisierung wurde nach in situ Pfortaderperfusion durchgeführt, und die Zwei-Photonen-Mikroskopietechniken wurden angewendet, um Veränderungen in der nativen EZM abzubilden und zu analysieren. Die 3D-Bilder der Normal- und NASH-Leber wurden rekonstituiert und analysiert. Die Durchführung einer in situ Perfusionsdezellularisierung und die Analyse des Gerüsts mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie boten eine praktische und zuverlässige Plattform zur Visualisierung des dynamischen EZM-Umbaus in der Leber.

Einleitung

Die nichtalkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) ist die häufigste Lebererkrankung und betrifft 20%-25% der erwachsenen Bevölkerung. 25 % der NAFLD-Patienten entwickeln eine nicht-alkoholische Steatohepatitis (NASH), bei der das Risiko für Zirrhose, Leberversagen und hepatozelluläres Karzinom steigt¹. Es wird geschätzt, dass NASH in den nächsten 20 Jahren für 2 Millionen leberbedingte Todesfälle in den USA^{verantwortlich} sein wird. Da es keine zugelassenen Behandlungen gibt, ist es dringend notwendig, die Mechanismen zu entschlüsseln, die eine Leberfibrose bei NASH-Patienten verursachen, und eine gezielte Behandlung zu entwickeln³.

Die extrazelluläre Matrix (EZM) ist eine dynamische, komplexe Mikroumgebung, die eine bidirektionale Kommunikation mit Zellen ausübt, um die Gewebehomöostase^{zu regulieren 4}. Die Leber-EZM besteht aus Strukturelementen wie Proteoglykanen, Kollagenen, Fibronektin, Elastin und anderen Nichtstrukturproteinen (z. B. Olfactomedin und Thrombospondin), um die physikalische und strukturelle Unterstützung zu gewährleisten⁴.

Leberfibrose ist eine chronische wundheilende Reaktion auf Leberschäden verschiedener Ätiologien, einschließlich NASH³. Sie resultiert aus einem Ungleichgewicht im dynamischen Remodellierungsprozess der EZM-Matrix und ist durch einen Überschuss an Strukturproteinen in der geschädigten Leber gekennzeichnet⁴. Die Fibrogenese hängt von der dynamischen Zell-Zell-Kommunikation zwischen verschiedenen hepatischen Zelltypen ab. Hepatische Sternzellen (HSCs) differenzieren sich, wenn sie aktiviert werden, in Smooth Muscle Alpha 2 Actin-exprimierende, migrierende und proliferierende Myofibroblasten-ähnliche Zellen und synthetisieren EZM-Proteine als wundschließende Wirkung. Aktivierte HSZ sind die zentralen kollagenproduzierenden Zellen in der Leber¹.

Der molekulare Mechanismus des EZM-Umbaus, die Muster der Fibrose und ihre Beziehung zu zellulären Ereignissen sind nicht klar. Ein besseres Verständnis der dreidimensionalen (3D) EZM-Struktur ist noch erforderlich, auch wenn Massenspektrometrietechniken zur Analyse der Zusammensetzung der ECM-Proteine beigetragen haben⁴. Traditionell wurden die Trichromfärbung nach Masson, die Picro Sirius Red-Färbung und die Bildgebung der zweiten harmonischen Generation (SHG) an zweidimensionalen (2D) dünnen Leberschnitten durchgeführt. Das typische Fibrosemuster von NASH wird als "Maschendraht" bezeichnet, der sich bis Zone 3 erstreckt und eine perisinusoidale/perizelluläre Fibrose ^5,6 ist. Es fehlt jedoch an Studien, die sich auf die 3D-Struktur der nativen Leber konzentrieren, insbesondere an solchen, die keine Gewebeschnitte beinhalten. Robuste bildgebende Verfahren zur Identifizierung von Mustern und Merkmalen der Fibrose während des dynamischen EZM-Remodellings bei Leberfibrose würden das Verständnis der NASH-Mechanismen erheblich verbessern und neue therapeutische Ziele identifizieren.

Um diesen Herausforderungen zu begegnen, wurde ein schnelles und effizientes Protokoll optimiert, um die native Leber-EZM mittels Dezellularisierung abzubilden⁷. Die Dezellularisierung der gesamten Leber ist ein Ansatz, um den zellulären Inhalt der Leber zu entfernen und gleichzeitig das native 3D-EZM-Netzwerk durch Detergenzienperfusion aufrechtzuerhalten. Die Mäuse wurden 14 Wochen lang entweder mit Chow oder Fast-Food-Diät (FFD) gefüttert. Die Dezellularisierung wurde nach in situ Pfortaderperfusion mit milder Detergenzienz und niedrigen Flussraten durchgeführt, um triple-helikale und native fibrilläre Kollagenstrukturen zu erhalten. Die Zwei-Photonen-Mikroskopie wurde eingesetzt, um Veränderungen der Kollagenstrukturen in der EZM zu analysieren. Die 3D-Bilder der nativen EZM-Struktur in normaler und NASH-Leber wurden rekonstituiert und analysiert. Die Durchführung einer in situ Perfusionsdezellularisierung und die Analyse des Gerüsts mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie bietet eine praktische und kostengünstige Plattform zur Visualisierung des dynamischen EZM-Umbaus in der Leber.

Protokoll

Tierversuche werden nach den experimentellen Verfahren durchgeführt, die von den Institutional Animal Care and Use Committees (IACUCs) der Stanford University und dem Veterans Affairs Hospital in Palo Alto genehmigt wurden. 6-8 Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse wurden 14 Wochen lang entweder mit Chow oder einer Fast-Food-Diät gefüttert, die mit 4,2 % Maissirup mit hohem Fruktosegehalt (siehe Materialtabelle) ergänzt wurde⁵. Die Mäuse wurden in Standardkäfigen mit einem 12-stündigen Dunkel-Hell-Zyklus gehalten.

1. Chirurgische Vorbereitung und Verfahren der Leberperfusion

1. Wiegen Sie die Maus vor dem Eingriff.
2. Betäuben Sie die Maus durch Verabreichung von Ketamin (90 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) (siehe Materialtabelle) über eine intraperitoneale Injektion. Stellen Sie sicher, dass die Maus durch Zehenkneifen vollständig betäubt ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
   HINWEIS: Isofluran wird hier nicht benötigt, da es sich um eine Operation handelt, bei der es sich nicht um eine Überlebensoperation handelt.
3. Rasieren Sie den Bauchbereich mit einer Haarschneidemaschine und desinfizieren Sie die Haut mit 70% Ethanol. Legen Sie die Maus auf den Rücken und fixieren Sie die Beine mit Klebeband auf dem chirurgischen Brett.
4. Nachdem Sie die Tiefe der Anästhesie durch eine Zehenzwicke erneut bestätigt haben, verwenden Sie eine Mayo-Schere und eine Adson-Pinzette (siehe Materialtabelle), um einen 3 cm langen Schnitt seitlich im Unterbauch und dann einen 5 cm langen Schnitt vertikal vom Unterbauch bis zum Processus xiphoideus zu machen. Achten Sie darauf, die Brusthöhle nicht zu öffnen.
5. Nachdem Sie das Bauchfell geöffnet haben, platzieren Sie den Darm vorsichtig links vom Tier und heben Sie den rechten Leberlappen mit einem Viskose-Applikator (siehe Materialtabelle) an, um die Pfortader freizulegen.
6. Katheterisieren Sie die Pfortader mit einem 24 G i.v. Katheter. Führen Sie den Katheter in das distale Ende der Pfortader ein. Setzen Sie die Katheterspitze an, bevor sich die Pfortader in die Leberlappen verzweigt.
7. Ziehen Sie die Nadel sofort zurück, wenn der Katheter in die Vene eintritt. Überprüfen Sie, ob der Katheter richtig in der Vene positioniert ist, indem Sie die Leber mit einer 1-ml-Spritze über den Katheter mit PBS perfundieren.
   HINWEIS: Nach der PBS-Perfusion sollten alle Lappen sofort blanchieren. Wenn der Katheter richtig platziert ist, fließt venöses Blut schnell durch den Katheter.
8. Verwenden Sie eine Dumont-Mikropinzette, einen Castroviejo-Mikronadelhalter und eine 4-0-Naht (siehe Materialtabelle), um einen Stich unter die Verzweigung der Pfortader und einen zweiten Stich 1 cm darunter zu setzen, um den Katheter zu sichern.

2. Dezellularisierung des Gewebes

1. Schließen Sie den Katheter an einen Silikonschlauch (~1 m Länge, 3 mm Innendurchmesser und 4,1 mm Außendurchmesser) mit einem Luer-Anschluss an. Schließen Sie den Silikonschlauch an eine Schlauchpumpe und ein Reservoir mit deionisiertem Wasser an (siehe Materialtabelle).
2. Entfernen Sie vorsichtig die Luftblasen im Inneren des Röhrchens und vermeiden Sie die Bildung neuer Blasen während der Perfusion. Stellen Sie die Peristaltikpumpe auf eine Durchflussleistung von 0,2 ml/min (d. h. 288 ml/24 h) ein.
3. Perfundieren Sie zuerst mit deionisiertem Wasser (~50 ml/Maus) für 2 h. Die Farbe der Leber ändert sich während der Perfusion von rot zu gelb.
   HINWEIS: Das Tier läuft nach 10 Minuten Perfusion ab.
4. Wechseln Sie die Perfusionslösung zu 0,5 % (wt/vol) Natriumdesoxycholat (DOC, siehe Materialtabelle) und fahren Sie über Nacht fort (18 h, ~250 ml/Maus). Die Leber wird am Ende der Perfusion weiß (Abbildung 1).
5. Schalten Sie die Perfusionslösung auf deionisiertes Wasser (~50 ml/Maus) um und perfundieren Sie sie 2 h lang.
6. Verwenden Sie eine Dumont-Mikrozange und eine Mikrofederschere (siehe Materialtabelle), um die dezellularisierte Leber zu entnehmen und sorgfältig in einer Petrischale mit PBS zu waschen.
7. Schneiden Sie das dezellularisierte Gewebe für die sofortige Bildgebung in kleine Stücke oder frieren Sie es bei -80 °C für weitere biochemische Analysen wie Tandem-Massenspektrometrie, ELISA oder Western Blot ein.

3. Objektträgervorbereitung für die Bildgebung (mit einem Multiphotonen-/konfokalen Fluoreszenzmikroskop)

1. Übertragen Sie ein kleines Stück dezellularisierter Leber (<3 x 3 x 3 mm) auf einen Objektträger und legen Sie das Gewebe in die Mitte.
2. Geben Sie 10 μl Eindeckmittel (siehe Materialtabelle) mit einer Pipette in das Gewebe, um ein Austrocknen des Gewebes zu vermeiden.
3. Decken Sie das Gewebe mit einem Deckglas ab und üben Sie eine kleine Kraft aus, um die Probe zu glätten. Versiegeln Sie die Ränder des Deckglases mit farblosem und transparentem Nagellack (Abbildung 2).
   HINWEIS: Aufgrund der Einstellung des aufrechten Zwei-Photons durch das Mikroskop wurde ein Deckglas auf der Probe verwendet. Die Proben könnten jedoch anders platziert werden, wenn ein inverses Mikroskop verwendet wird.

4. Bildaufnahme

1. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf die Oberseite des Deckglases und legen Sie den Objektträger auf den Objektträgerhalter. Senken Sie die 20-fach-Ölobjektivlinse ab, bis sie das Immersionsöl berührt.
2. Wechseln Sie in den violetten Kanal (405 nm), schalten Sie den Verschluss ein und fokussieren Sie auf die Probe. Navigieren und positionieren Sie den Interessenbereich für die Bildgebung. Schalten Sie den Verschluss aus, bevor Sie mit der Bildaufnahme mit Laserlicht fortfahren.
3. Wechseln Sie zur Computersteuerung und starten Sie den Zwei-Photonen-Laser. Schalten Sie zuerst den Zwei-Photonen-Laser ein (Abbildung 3A), dann den Zwei-Photonen-Lasercontroller (siehe Materialtabelle) und den Verschluss (Abbildung 3B, C). Stellen Sie sicher, dass die Ausgangsleistung höher als 2,5 W ist.
   Reduzieren Sie die Laserleistung, um eine Fluoreszenzlöschung zu verhindern. Wählen Sie die Detektoren (sowohl Photomultiplier als auch den Hybriddetektor) aus und passen Sie sie an die ausgewählten Fluorophore an.
   HINWEIS: Die Zwei-Photonen-Bildgebung wurde bei einer Anregungswellenlänge von 860 nm durchgeführt. Es wurden zwei Kanäle für Kollagen-SHG- bzw. Zwei-Photonen-angeregte Fluoreszenzbilder (TPEF) ausgewählt. Ein Kanal, der dem Wellenlängenbereich von 415-445 nm entspricht, detektierte die detaillierte Struktur von Kollagen aus SHG-Signalen. Ein weiterer Kanal deckte den Bereich von 465-669 nm ab, um TPEF-Signale zu sammeln.
4. Wählen Sie zwischen simultanen oder sequenziellen Bildaufnahmen. Stellen Sie die Lochblende auf den höchsten Wert ein. Passen Sie Laserwellenlängen, Verstärkung, Leistung und Offset an. Passen Sie die Pixelverweildauer, die Pixelgröße, die Mittelwertbildung und den Zoom an (Abbildung 4A).
5. Scrollen Sie durch den Z-Controller des Computers und legen Sie die Z-Dimensionen fest, definieren Sie den Start- und Endpunkt und wählen Sie die Anzahl der Bilder aus, die innerhalb eines Volumes (Z-Stack) angegeben werden. Erfassen Sie Bilder.
   HINWEIS: Hier wurde ein Z-Volumen von 20 μm und eine Z-Schrittweite von 1 μm gewählt (Abbildung 4B).

Ergebnisse

Die Kollagenfasern wurden mit Hilfe der Erzeugung der zweiten Harmonischen und der Zwei-Photonen-Mikroskopie detektiert. Das Signal stammt von den zerbrechlichen dreifachhelikalen und nativen fibrillären Kollagenstrukturen. Spezifische Antikörper wurden nicht verwendet, um Kollagen-Subtypen zu analysieren; Dies könnte jedoch der Bildgebungstechnik hinzugefügt werden.

Wenn das Lebergewebe ohne Dezellularisierung untersucht wird, ist es schwierig, hochauflösende Bilder des Kollagennetzwerks...

Diskussion

Das vorliegende Protokoll zeigt, dass die Dezellularisierung durch eine niedrige Flussrate der DOC-in-situ-Perfusion die zerbrechlichen dreifachhelikalen und nativen fibrillären Kollagenstrukturen bewahrt und eine zuverlässige und kostengünstige Plattform zur Erfassung des dynamischen ECM-Umbaus bei NASH-Leberfibrose bietet. Obwohl die Dezellularisierung in normalen und fibrotischen Lebern durchgeführt wurde, bevor EZM-Komponenten identifiziert oder biologische Gerüste für die Zellkultur erzeugt wurden, is...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3	MONOCRYL	Y494G
4-0 suture	fisher scientific	10-000-649	https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true
AnaSed Injection (xylazine)	AnaSed	NDC 59399-110-20	this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian.
BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY	BD	382612
Chow diet	Envigo	# 2918	Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents.
Fast-food diet (AIN76A Western Diet)	Test Diet	1810060	https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf
Hematoxylin and Eosin Stain Kit	vectorlabs	H-3502	https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html
Kent Scientific Rat Surgical Kit	fisher scientific	13-005-205	https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit
KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION	Vedco	NDC 50989-996-06 - 10 mL - vial.	KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage.
Leica SP5 upright Confocal, multi-photon	Leica	SP5
Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®)	bbraun	D300	https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html
Picrosirius Red Stain Kit	Polysciences, Inc.	24901	https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771
Rayon tipped applicator	puritan	25-806 1PR
Sodium deoxycholate	sigmaaldrich	D6750-100G
Syrup	www.target.com	24 fl oz	https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801
Variable Speed Peristaltic Pump	INTLLAB	BT100	https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	vectorlabs	H-1000-10	https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html