Imaging 3D della matrice extracellulare del fegato in un modello murino di steatoepatite non alcolica

Riepilogo

Il presente protocollo ottimizza i metodi di perfusione/decellularizzazione del fegato in situ e microscopia a due fotoni per stabilire una piattaforma affidabile per visualizzare la dinamica del rimodellamento della matrice extracellulare (ECM) durante la steatoepatite non alcolica (NASH).

Abstract

La steatoepatite non alcolica (NASH) è la malattia epatica cronica più comune negli Stati Uniti, che colpisce oltre 70 milioni di americani. La NASH può progredire verso la fibrosi e, infine, verso la cirrosi, un fattore di rischio significativo per il carcinoma epatocellulare. La matrice extracellulare (ECM) fornisce supporto strutturale e mantiene l'omeostasi epatica tramite segnali matricellulari. La fibrosi epatica deriva da uno squilibrio nel processo dinamico di rimodellamento della MEC ed è caratterizzata da un eccessivo accumulo di elementi strutturali e cambiamenti associati nei glicosaminoglicani. Il tipico modello di fibrosi della NASH è chiamato "filo di pollo", che di solito consiste nella fibrosi perisinusoidale / pericellulare della zona 3, basata sulle caratteristiche osservate dalla colorazione tricromica di Masson e dalle macchie rosse di Picrosirius. Tuttavia, queste tradizionali tecniche di imaging basate su vetrini tissutali sottili (2D) non possono dimostrare i cambiamenti strutturali dettagliati tridimensionali (3D) della ECM, limitando la comprensione del rimodellamento dinamico dell'ECM nella fibrosi epatica.

Il lavoro attuale ha ottimizzato un protocollo rapido ed efficiente per visualizzare la struttura ECM nativa nel fegato tramite demilitarizzazione per affrontare le sfide di cui sopra. I topi sono stati nutriti con chow o dieta fast-food per 14 settimane. La decellularizzazione è stata eseguita dopo la perfusione della vena porta in situ e le tecniche di microscopia a due fotoni sono state applicate per visualizzare e analizzare i cambiamenti nella ECM nativa. Le immagini 3D dei fegati normali e NASH sono state ricostituite e analizzate. L'esecuzione della decellularizzazione della perfusione in situ e l'analisi dello scaffold mediante microscopia a due fotoni hanno fornito una piattaforma pratica e affidabile per visualizzare il rimodellamento dinamico dell'ECM nel fegato.

Introduzione

La steatosi epatica non alcolica (NAFLD) è la malattia epatica più comune, che colpisce il 20% -25% della popolazione adulta. Il 25% dei pazienti con NAFLD progredisce verso la steatoepatite non alcolica (NASH), dove aumenta il rischio di cirrosi, insufficienza epatica e carcinoma epatocellulare¹. Nei prossimi 20 anni, si stima che la NASH rappresenterà 2 milioni di decessi correlati al fegato negli Stati Uniti². Poiché non esistono trattamenti approvati, vi è un urgente bisogno di decifrare i meccanismi che causano la fibrosi epatica nei pazienti con NASH e sviluppare un trattamento mirato³.

La matrice extracellulare (ECM) è un microambiente dinamico e complesso che esercita una comunicazione bidirezionale con le cellule per regolare l'omeostasi tissutale⁴. La ECM epatica è composta da elementi strutturali come proteoglicani, collagene, fibronectina, elastina e altre proteine non strutturali (ad esempio, olfattomadina e trombospondina) per fornire supporto fisico e strutturale⁴.

La fibrosi epatica è una risposta cronica di guarigione delle ferite al danno epatico di varie eziologie, tra cui la NASH³. Deriva da uno squilibrio nel processo dinamico di rimodellamento della matrice ECM ed è caratterizzato da eccessive proteine strutturali nel fegato danneggiato⁴. La fibrogenesi dipende dalla comunicazione dinamica cellula-cellula tra diversi tipi di cellule epatiche. Le cellule stellate epatiche (HSC), quando attivate, si differenziano in cellule simili ai miofibroblasti alfa 2 che esprimono l'actina, migrano e proliferano e sintetizzano le proteine ECM come azione di chiusura della ferita. Le HSC attivate sono le cellule centrali produttrici di collagene nel fegato¹.

Il meccanismo molecolare del rimodellamento della ECM, i modelli di fibrosi e la loro relazione con gli eventi cellulari non sono chiari. È ancora necessaria una migliore comprensione della struttura tridimensionale (3D) della ECM, anche se le tecniche di spettrometria di massa hanno contribuito ad analizzare la composizione della proteina ECM⁴. Tradizionalmente, la colorazione tricromatica di Masson, le macchie Picro Sirius Red e l'imaging di seconda generazione armonica (SHG) sono stati eseguiti su sezioni di fegato sottili bidimensionali (2D). Il tipico modello di fibrosi della NASH è chiamato "filo di pollo", che si estende alla zona 3 ed è la fibrosi perisinusoidale / pericellulare ^5,6. Tuttavia, c'è stata una mancanza di studi incentrati sulla struttura 3D del fegato nativo, in particolare quelli che non coinvolgono il sezionamento dei tessuti. Robusti approcci di imaging per identificare modelli e caratteristiche della fibrosi attraverso il rimodellamento dinamico della ECM nella fibrosi epatica rafforzerebbero significativamente la comprensione dei meccanismi della NASH e identificherebbero nuovi bersagli terapeutici.

Per affrontare queste sfide, è stato ottimizzato un protocollo rapido ed efficiente per visualizzare l'ECM epatica nativa tramite decellularizzazione⁷. La decellularizzazione dell'intero fegato è un approccio per rimuovere il contenuto cellulare epatico mantenendo la rete ECM 3D nativa attraverso la perfusione di detergenti. I topi sono stati nutriti con chow o dieta fast-food (FFD) per 14 settimane. La decellularizzazione è stata eseguita dopo perfusione venosa porta in situ con detergente delicato e basse portate per preservare le strutture di collagene fibrillare a tripla elica e nativa. La microscopia a due fotoni è stata applicata per analizzare i cambiamenti nelle strutture del collagene nell'ECM. Le immagini 3D della struttura ECM nativa nei fegati normali e NASH sono state ricostituite e analizzate. L'esecuzione della decellularizzazione della perfusione in situ e l'analisi dello scaffold mediante microscopia a due fotoni fornisce una piattaforma pratica e conveniente per visualizzare il rimodellamento dinamico dell'ECM nel fegato.

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali vengono eseguiti secondo le procedure sperimentali approvate dai comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali (IACUC) della Stanford University e del Veterans Affairs Hospital di Palo Alto. Topi maschi C57BL / 6J di 6-8 settimane sono stati alimentati con chow o una dieta fast-food integrata con sciroppo di mais ad alto contenuto di fruttosio al 4,2% (vedi Tabella dei materiali) in acqua potabile per 14 settimane⁵. I topi sono stati tenuti in gabbie standard a un ciclo buio/luce di 12 ore.

1. Preparazione chirurgica e procedure di perfusione epatica

1. Pesare il mouse prima della procedura.
2. Anestetizzare il topo somministrando ketamina (90 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) (vedere Tabella dei materiali) tramite iniezione intraperitoneale. Assicurarsi che il mouse sia completamente anestetizzato dal pizzicamento delle dita prima di procedere al passaggio successivo.
   NOTA: L'isoflurano non è necessario qui poiché si tratta di un intervento chirurgico di non sopravvivenza.
3. Rasare l'area ventrale con un tagliacapelli e disinfettare la pelle con etanolo al 70%. Posizionare il mouse sul dorso e immobilizzare le gambe sulla scheda chirurgica con del nastro adesivo.
4. Dopo aver riconfermato la profondità dell'anestesia con un pizzico di punta, utilizzare le forbici Mayo e la pinza Adson (vedi Tabella dei materiali) per fare un'incisione di 3 cm lateralmente nell'addome inferiore e quindi un'incisione di 5 cm verticalmente dall'addome basso al processo xifoideo. Fare attenzione a non aprire la cavità toracica.
5. Dopo aver aperto il peritoneo, posizionare delicatamente l'intestino alla sinistra dell'animale e sollevare il lobo destro del fegato con un applicatore con punta di rayon (vedi Tabella dei materiali) per esporre la vena porta.
6. Cateterizzare la vena porta utilizzando un catetere IV da 24 G. Introdurre il catetere nell'estremità distale della vena porta. Posizionare la punta del catetere prima che la vena porta si dirama nei lobi epatici.
7. Prelevare immediatamente l'ago quando il catetere entra nella vena. Controllare che il catetere sia posizionato correttamente all'interno della vena perfondendo il fegato con PBS utilizzando una siringa da 1 ml attraverso il catetere.
   NOTA: Dopo la perfusione PBS, tutti i lobi dovrebbero immediatamente sbiancarsi. Se il catetere è posizionato correttamente, il sangue venoso fluirà rapidamente attraverso il catetere.
8. Utilizzare una pinza Dumont, un supporto per microaghi Castroviejo e una sutura 4-0 (vedi Tabella dei materiali) per posizionare un punto sotto la ramificazione della vena porta e un secondo punto 1 cm sotto per fissare il catetere.

2. Decellularizzazione dei tessuti

1. Collegare il catetere a un tubo di silicone (~ 1 m di lunghezza, 3 mm di diametro interno e 4,1 mm di diametro esterno) con un connettore Luer. Collegare il tubo in silicone a una pompa peristaltica e un serbatoio contenente acqua deionizzata (vedi Tabella dei materiali).
2. Rimuovere con attenzione le bolle d'aria all'interno del tubo ed evitare di generare nuove bolle durante la perfusione. Impostare la pompa peristaltica su una portata di 0,2 mL/min (cioè 288 mL/24 h).
3. Perfondere prima con acqua deionizzata (~50 mL/mouse) per 2 ore. Il colore del fegato cambierà da rosso a giallo durante la perfusione.
   NOTA: L'animale scadrà dopo 10 minuti di perfusione.
4. Passare la soluzione di perfusione allo 0,5% (wt/vol) di sodio desossicolato (DOC; vedere Tabella dei materiali) e continuare per tutta la notte (18 ore, ~250mL/mouse). Il fegato diventerà bianco alla fine della perfusione (Figura 1).
5. Commutare la soluzione di perfusione in acqua deionizzata (~50 mL/mouse) e perfondere per 2 ore.
6. Utilizzare micro pinze Dumont e micro-forbici a molla (vedi Tabella dei materiali) per raccogliere il fegato decellularizzato e lavarlo accuratamente in una capsula di Petri con PBS.
7. Tagliare il tessuto decellularizzato in piccoli pezzi per l'imaging immediato o congelare a -80 ° C per ulteriori analisi biochimiche come spettrometria di massa tandem, ELISA o western blot.

3. Preparazione del vetrino per l'imaging (con un microscopio a fluorescenza multifotone/confocale)

1. Trasferire un piccolo pezzo di fegato decellularizzato (<3 x 3 x 3 mm) su un vetrino da microscopio e posizionare il tessuto nel mezzo.
2. Aggiungere 10 μL di mezzo di montaggio antisbiadimento (vedere Tabella dei materiali) al tessuto con una pipetta per evitare l'essiccazione del tessuto.
3. Coprire il tessuto con un vetro di copertura e applicare una piccola forza per appiattire il campione. Sigillare i bordi del vetro di copertura con smalto per unghie incolore e trasparente (Figura 2).
   NOTA: A causa dell'impostazione del bifotone verticale attraverso il microscopio, è stato utilizzato un vetro di copertura sul campione. Tuttavia, i campioni potrebbero essere posizionati in modo diverso se viene utilizzato un microscopio invertito.

4. Acquisizione di immagini

1. Posizionare una goccia di olio per immersione sulla parte superiore del vetro di copertura e posizionare il vetrino sul supporto del vetrino del microscopio. Abbassare l'obiettivo dell'olio 20x fino a quando non entra in contatto con l'olio ad immersione.
2. Passare al canale viola (405 nm), accendere l'otturatore e concentrarsi sul campione. Naviga e posiziona l'area di interesse per l'imaging. Spegnere l'otturatore prima di passare all'acquisizione delle immagini utilizzando la luce laser.
3. Passare al controllo del computer e avviare il laser a due fotoni. Accendere prima il laser a due fotoni (Figura 3A), quindi accendere il controller laser a due fotoni (vedere Tabella dei materiali) e l'otturatore (Figura 3B,C). Assicurarsi che la potenza di uscita sia superiore a 2,5 W.
   Ridurre la potenza del laser per prevenire la tempra a fluorescenza. Selezionare e regolare i rivelatori (sia fotomoltiplicatori che ibridi) per adattarsi ai fluorofori scelti.
   NOTA: L'imaging a due fotoni è stato eseguito a una lunghezza d'onda di eccitazione di 860 nm. Sono stati selezionati due canali rispettivamente per le immagini di collagene SHG e fluorescenza eccitata a due fotoni (TPEF). Un canale corrispondente all'intervallo di lunghezze d'onda di 415-445 nm ha rilevato la struttura dettagliata del collagene dai segnali SHG. Un altro canale copriva l'intervallo di 465-669 nm per raccogliere i segnali TPEF.
4. Scegli acquisizioni di immagini simultanee o sequenziali. Regolate il foro stenopeico sul valore più alto. Regola le lunghezze d'onda del laser, il guadagno, la potenza e l'offset. Regolare il tempo di permanenza dei pixel, la dimensione dei pixel, la media e lo zoom (Figura 4A).
5. Scorrere lo z-controller del computer e impostare le dimensioni z, definire l'inizio e gli endpoint e scegliere il numero di immagini fornite all'interno di un volume (z-stack). Acquisire immagini.
   NOTA: Qui, è stata scelta una dimensione del volume Z di 20 μm e una dimensione del passo Z di 1 μm (Figura 4B).

Risultati

Le fibre di collagene sono state rilevate con la seconda generazione armonica e la microscopia a due fotoni. Il segnale proviene dalle strutture frangibili di collagene fibrillare a tripla elica e nativa. Non sono stati utilizzati anticorpi specifici per analizzare i sottotipi di collagene; Tuttavia, questo potrebbe essere aggiunto alla tecnica di imaging.

Quando il tessuto epatico viene studiato senza decellularizzazione, è difficile ottenere immagini ad alta risoluzione della rete di collag...

Discussione

Il presente protocollo mostra che la decellularizzazione attraverso una perfusione DOC in situ a bassa portata preserva le strutture frangibili di collagene fibrillare a tripla elica e nativa, fornendo una piattaforma affidabile ed economica per catturare il rimodellamento dinamico dell'ECM nella fibrosi epatica NASH. Sebbene la decellularizzazione sia stata eseguita in fegati normali e fibrotici prima di identificare i componenti della ECM o generare scaffold biologici per la coltura cellulare, la dinamica del ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3	MONOCRYL	Y494G
4-0 suture	fisher scientific	10-000-649	https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true
AnaSed Injection (xylazine)	AnaSed	NDC 59399-110-20	this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian.
BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY	BD	382612
Chow diet	Envigo	# 2918	Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents.
Fast-food diet (AIN76A Western Diet)	Test Diet	1810060	https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf
Hematoxylin and Eosin Stain Kit	vectorlabs	H-3502	https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html
Kent Scientific Rat Surgical Kit	fisher scientific	13-005-205	https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit
KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION	Vedco	NDC 50989-996-06 - 10 mL - vial.	KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage.
Leica SP5 upright Confocal, multi-photon	Leica	SP5
Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®)	bbraun	D300	https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html
Picrosirius Red Stain Kit	Polysciences, Inc.	24901	https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771
Rayon tipped applicator	puritan	25-806 1PR
Sodium deoxycholate	sigmaaldrich	D6750-100G
Syrup	www.target.com	24 fl oz	https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801
Variable Speed Peristaltic Pump	INTLLAB	BT100	https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	vectorlabs	H-1000-10	https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html