非アルコール性脂肪性肝炎モデルマウスにおける肝臓細胞外マトリックスの3Dイメージング

要約

本プロトコルは、肝臓 のin situ 灌流/脱細胞化および2光子顕微鏡法を最適化して、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)中の細胞外マトリックス(ECM)リモデリングのダイナミクスを視覚化するための信頼性の高いプラットフォームを確立します。

要約

非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)は、米国で最も一般的な慢性肝疾患であり、7,000万人以上のアメリカ人が罹患しています。NASHは線維症に進行し、最終的には肝細胞癌の重要な危険因子である肝硬変に進行する可能性があります。細胞外マトリックス(ECM)は、構造的サポートを提供し、母細胞シグナル を介して 肝臓の恒常性を維持します。肝線維症は、動的ECMリモデリングプロセスの不均衡に起因し、構造要素の過剰な蓄積とそれに伴うグリコサミノグリカンの変化を特徴としています。NASHの典型的な線維症パターンは「チキンワイヤー」と呼ばれ、マッソンのトリクローム染色とピクロシリウスレッド染色によって観察された特徴に基づいて、通常、ゾーン3の類洞周囲/細胞周囲線維症で構成されます。しかし、これらの従来の薄い2次元(2D)組織スライドベースのイメージング技術は、詳細な3次元(3D)ECM構造変化を実証することができず、肝線維症における動的ECMリモデリングの理解を制限します。

現在の研究では、上記の課題に対処するために、脱細胞化 を介して 肝臓のネイティブECM構造を画像化するための高速で効率的なプロトコルを最適化しました。マウスに固形飼料またはファーストフード食のいずれかを14週間与えた。その 場 門脈灌流後に脱細胞化を行い、2光子顕微鏡技術を適用してネイティブECMの変化を画像化および分析しました。正常肝臓とNASH肝臓の3D画像を再構成して分析しました。 in situ 灌流脱細胞化を行い、2光子顕微鏡で足場を分析することで、肝臓の動的ECMリモデリングを視覚化するための実用的で信頼性の高いプラットフォームが提供されました。

概要

非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)は最も一般的な肝疾患であり、成人人口の20%〜25%に影響を及ぼします。NAFLD患者の25%が非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)に進行し、肝硬変、肝不全、肝細胞癌のリスクが高まります¹。今後20年間で、NASHは米国²で200万人の肝臓関連の死亡を占めると推定されています。承認された治療法がないため、NASH患者の肝線維化を引き起こすメカニズムを解読し、標的治療を開発することが急務です³。

細胞外マトリックス(ECM)は、細胞との双方向通信を発揮して組織の恒常性を調節する動的で複雑な微小環境です⁴。肝臓ECMは、プロテオグリカン、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、および他の非構造タンパク質(例えば、オルファクトメジンおよびトロンボスポンジン)などの構造要素で構成され、物理的および構造的支持体を提供する⁴。

肝線維症は、NASH³を含むさまざまな病因の肝障害に対する慢性創傷治癒反応です。これは、動的ECMマトリックスリモデリングプロセスの不均衡に起因し、損傷した肝臓

プロトコル

動物実験は、スタンフォード大学の施設動物管理および使用委員会(IACUC)およびパロアルトの退役軍人病院によって承認された実験手順に従って行われます。6〜8週齢の雄C57BL / 6Jマウスに、飲料水中の4.2%高果糖コーンシロップ( 材料の表を参照)を添加した固形飼料またはファーストフード食のいずれかを14週間与えました⁵。マウスは、12時間の暗/明サイクルで標準的なケージに保管されました。

1.肝灌流の外科的準備と手順

1. 手順の前にマウスの重量を量ります。
2. ケタミン(90 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)( 材料の表を参照)を腹腔内注射で投与することにより、マウスを麻酔します。.次のステップに進む前に、つま先をつまんでマウスが完全に麻酔されていることを確認してください。
   注:イソフルランは非生存手術であるため、ここでは必要ありません。
3. バリカンを使用して腹側を剃り、70%エタノールで皮膚を消毒します。マウスを背中に置き、脚をテープで手術用ボードに固定します。
4. つま先ピンチで麻酔の深さを再確認した後、メイヨーハサミとアドソン鉗子( 資料表を参照)を使用して、下腹部を横方向に3 cm切開し、次....

結果

コラーゲン線維は、第2高調波発生および2光子顕微鏡で検出されました。シグナルは、壊れやすいトリプルヘリカルおよび天然の原線維コラーゲン構造からのものです。特異的抗体はコラーゲンサブタイプの分析には使用しなかった。ただし、これはイメージング技術に追加できます。

肝臓組織を脱細胞化せずに研究する場合、コラーゲンネットワークの高解像度画像を.......

ディスカッション

本プロトコルは、低流速DOC in situ灌流による脱細胞化が、壊れやすいトリプルヘリカルおよび天然の原線維コラーゲン構造を保存し、NASH肝線維症における動的ECMリモデリングを捕捉するための信頼性が高く費用効果の高いプラットフォームを提供することを示しています。ECM成分を同定したり、細胞培養用の生物学的足場を生成したりする前に、正常および線維性の肝臓で脱細胞化が?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3	MONOCRYL	Y494G
4-0 suture	fisher scientific	10-000-649	https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true
AnaSed Injection (xylazine)	AnaSed	NDC 59399-110-20	this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian.
BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY	BD	382612
Chow diet	Envigo	# 2918	Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents.
Fast-food diet (AIN76A Western Diet)	Test Diet	1810060	https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf
Hematoxylin and Eosin Stain Kit	vectorlabs	H-3502	https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html
Kent Scientific Rat Surgical Kit	fisher scientific	13-005-205	https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit
KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION	Vedco	NDC 50989-996-06 - 10 mL - vial.	KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage.
Leica SP5 upright Confocal, multi-photon	Leica	SP5
Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®)	bbraun	D300	https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html
Picrosirius Red Stain Kit	Polysciences, Inc.	24901	https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771
Rayon tipped applicator	puritan	25-806 1PR
Sodium deoxycholate	sigmaaldrich	D6750-100G
Syrup	www.target.com	24 fl oz	https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801
Variable Speed Peristaltic Pump	INTLLAB	BT100	https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	vectorlabs	H-1000-10	https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html