הקמת מודל דלקת לבלב חריפה חמורה עכבר באמצעות הזרקה מדרדרת של נתרן Taurocholate לתוך צינור ביליופנקראטי

Summary

מודל עכבר של דלקת לבלב חריפה חמורה מתואר כאן. ההליך המוצג כאן הוא מהיר מאוד, פשוט ונגיש, ובכך עשוי לאפשר את חקר המנגנונים המולקולריים והתערבויות טיפוליות שונות בדלקת הלבלב החריפה בצורה נוחה.

Abstract

השכיחות של דלקת לבלב חריפה (AP), במיוחד דלקת לבלב חריפה חמורה (SAP), גדלה בקבוצות גיל צעירות מדי שנה. עם זאת, קיים מחסור בטיפולים יעילים בפרקטיקה הקלינית הנוכחית. עם הנגישות הקלה של זנים מהונדסים ונוקאאוט וגודלם הקטן, המאפשר מינונים מינימליים של תרופות הנדרשות להערכת vivo , מודל ניסיוני מבוסס היטב בעכברים עדיף למחקר AP. יתר על כן, SAP המושרה באמצעות נתרן taurocholate (TC) הוא כיום אחד הדגמים הנפוצים ביותר המאופיינים ביותר. מודל זה נחקר על טיפולים חדשניים ואירועים מולקולריים אפשריים במהלך התהליך של AP. כאן, אנו מציגים את הדור של מודל עכבר AP באמצעות נתרן taurocholate ו microsyringe תוצרת בית פשוטה. יתר על כן, אנו מספקים גם את המתודולוגיה לבדיקות ההיסטולוגיה והסראולוגיות הבאות.

Introduction

דלקת לבלב חריפה (AP) היא דלקת חריפה של הלבלב המאופיינת על ידי חסימה של צינור הלבלב הראשי עם התנפחות דביקה דביקה לאחר מכן ו autodigestion הלבלב על ידי אנזימים המופעלים באופן חריג שלה. הביטויים הקליניים שלה כוללים דלקת מקומית או מערכתית, כאבי בטן, והעלאה של עמילאז ^{בסרום1,2}. על פי סיווג ^{החומרה3}, AP יכול להציג בצורות קלות, מתונות וחמורות, וביניהם, דלקת לבלב חריפה חמורה (SAP) היא המצב המדאיג ביותר בשל שיעור התמותה הגבוה שלה של יותר מ -30%⁴. בארצות הברית, AP היא אחת הסיבות הנפוצות ביותר לאשפוז, המשפיעים על מעל 200,000 ^חולים5. יתר על כן, AP, במיוחד SAP, גדל מדי שנה ומשפיע על קבוצות גיל ^{צעירות6}. עם זאת, קיים מחסור באפשרויות טיפול יעילות בפרקטיקה הקלינית ^{הנוכחית6,7}. לכן, יש צורך לחקור את המנגנונים המולקולריים המעורבים AP, ובכך להקל על שיפור הטיפול.

מודלים מבוססים של בעלי חיים ניסיוניים נדרשים לחקר המנגנונים המעורבים ב- AP ולהערכת האפקטיביות של שיטות טיפול שונות. עם הנגישות הקלה של זנים מהונדסים ונוקאאוט וגודלם הקטן, אשר ממזער את המינונים של תרופות הנדרשות להערכת vivo, עכברים עדיפים למחקר AP. לכן, מספר מודלים של AP פותחו ^{בעכברים8,9}.

עובד ממודל עכבר לבלב מתון המושרה באמצעות הממשל תוך ורידי של caerulein10, Niederau ואח 'פיתח מודל עכבר SAP שהוצג עם נמק תא acinar המושרה באמצעות אותה תרופה מסלול הזרקה11. למרות שלמודל זה יש מספר יתרונות, כולל אי-פולשניות, אינדוקציה מהירה, רבייה רחבה ותחולת, החיסרון העיקרי הוא שרק צורה קלה של AP מפותחת ברוב המקרים, ובכך מגבילה את הרלוונטיות הקלינית שלה. אלכוהול נחשב לאחד הגורמים האטיולוגיים העיקריים של AP; עם זאת, Foitzik ואח ' דיווח כי זה גורם לפגיעה בלבלב רק בשילוב עם גורמים אחרים, כגון גירוי יתר ^{אקסוקריני12}. יתר על כן, למרות מודלים AP המושרה אלכוהול שפותחו באמצעות נתיבי ממשל שונים, ומנות סמים דווחו13,14,15, החיסרון העיקרי שלהם הוא הקושי לשחזר אותם. ניהול intraperitoneal של L-ארגנין יכול גם לגרום AP ^{בעכברים16}; עם זאת, הרלוונטיות הקלינית הנמוכה שלה מעכבת את היישום שלה. Taurocholate, מלח מרה, הוצע לראשונה על ידי Creutzfeld ואח 'בשנת 1965 לגרימת מצב הדומה AP אנושי באמצעות עירוי צינור ^הלבלב17. למרות שקיימות מחלוקות לגבי הרלוונטיות הקלינית שלה בפתופיזיולוגיה18,19, דלקת הלבלב הנגרמת על ידי טאורוכולאט נותרה מודל חיוני עבור SAP.

כמו מודל זה הוא פשוט למימוש והוא גם יעיל בעכברים, זה עכשיו אחד המודלים הנפוצים ביותר AP עבור בעלי חיים קטנים במחקרים vivo. Perides ואח ' העסיקה נתרן טאורוכולאט (TC) כדי לגרום SAP ^{בעכברים20}, מתן תובנות כדי להבין את הפתולוגיה שלה. בשילוב עם טכניקות שינוי גנטי, מודל זה אפשר לנו לאשר מספר גנים ספציפיים המעורבים AP. לדוגמה, Bicozo ואח ' הראה כי נוקאאוט של הגן CD38 מוגן מפני מודל של דלקת לבלב עירוי TC וייחס את המנגנונים לשינויים ^{Ca2 +} איתות ^תאיים21. Fanczal ואח ' חקר את ההשלכות הפיזיולוגיות של ביטוי TRPM2 בקרום הפלזמה של אצינר לבלב עכבר ותאים דביקים, והפגין חומרה מופחתת של SAP המושרה TC בעכברים נוקאאוט TRPM222. יתר על כן, מודל זה מספק גם דרך פשוטה ויעילה לבדוק תרופות חדשניות רבות ב vivo. לדוגמה, שיטה זו אפשרה אימות של ההשפעות הטיפוליות של ^קפאין23, חומצה דהידרוקולית24, ונוגדי חמצון שונים ונוגדי ^{קרישה25,26}. ראיה זו מדגימה את הרב-תכליתיות של מודל SAP המושרה על-ידי TC. למרות ש-Wittel et al. תיארו מודל עכבר ^דומה27, היעדר פרטים על הליכי היישום עלול לגרום לחוסר יכולת לשחזר את הממצאים. במאמר זה, אנו מתמקדים בשיטות המשתמשות במיקרו-מזרק ביתי פשוט ולומדים SAP המושרה על ידי TC, ובכך מספקים הדרכה אפשרית לא רק למחקר נוסף של הפתוגנזה והטיפול ב- AP, אלא גם לשיטה ניסיונית הניתנת להתאמה מושלמת עבור חומרים רבים אחרים.

Protocol

כל הניסויים הקשורים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים של אוניברסיטת סוכו. כל הניתוחים הכירורגיים בוצעו בהרדמה מלאה. משככי כאבים לא שימשו כדי למנוע הפרעה עם המהלך הטבעי של המחלה על פי ספרות ^{קודמת28,29}. אישור להיעדר משככי כאבים ניתן גם על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים של אוניברסיטת סוכו.

1. הכנה

1. מהיר C57BL / 6 עכבר מסוג פראי 8-12 שעות לפני הניתוח.
2. הכינו פתרון TC של 5% (w/v) (93 מ"ר) המדולל ל-0.9% נתרן כלורי. סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
3. Autoclave את המכשירים והחומרים כירורגיים, כולל מלקחיים, מספריים, מחזיק להב, מחזיק מחט, קליפ המוסטטי, מלחציים וסקולריים, ווילונות סטריליים, באמצעות מחטא לחץ בטמפרטורה של 121 °C (50 °F) במשך 30 דקות.
4. הכינו מיקרו-מזרק תוצרת בית. לשם כך, התקן באופן ידני קצה אינסולין חד פעמי וטיפ פיפטה מפלסטיק ממושך על מזרק Microliter קצה שטוח 25 μL. לחטא באמצעות הקרנה.

2. הרדמה והכנה לפני הניתוח

1. שוקלים 6-8 שבועות זכר C57BL / 6 עכברים מסוג בר (כ 21-23 גרם). לגרום להרדמה כללית עם הזרקה תוך-פטריטונית של תמיסת נתרן פנטוברביטל 1% במינון של 50 מ"ג/ק"ג.
2. תקן את העכבר בתנוחה העליונה על צלחת שטוחה anirradiatedfoam עם הקלטת.
3. הכן את אזור הפעולה של כל בעל חיים על ידי הסרת פרוותו עם קרם depilation מרמת תהליך xiphoid עד לקו המחבר של עמוד השדרה הכפיים העליון הדו-צדדי הקדמי, עם הצדדים השמאליים והימניים במקביל לקו הציר הקדמי.
4. הכן שדה כירורגי סטרילי עם דגש מיוחד על האזור הניתוחי, המורכב מהאזור שהוכן על החיה ואת החלק הקדמי של המנתח.
   1. לחטא את הספסל.
   2. נקו את אתר החתך עם יישומים מרובים של פתרון קרצוף כירורגי. לנגב את העור פעמיים עד שלוש פעמים עם 0.5% יוד ולאפשר לו להתייבש במשך 1-2 דקות בכל פעם.
   3. לכסות את העכבר עם וילונות סטריליים.

3. הליך כירורגי

הערה: איור 1 מתאר את האנטומיה והמורפולוגיה של לבלב העכבר לפני ואחרי הזרקה מדרדרת של TC לצינור הביליופנקרטי באמצעות מיקרו-הזרקה.

1. בצע חתך בטן חציוני באורך 2 עד 3 ס"מ.
2. אתר את התריסריון משמאל לימין לאורך הבטן. שלפו בעדינות את התריסריון החוצה ולצד שמאל באמצעות מלקחיים כירורגיים וספוגית כותנה ספוגת חיטוי כדי לחשוף את הלבלב, את הצינור הביליופנקרטי ואת הפפילה התריסריון. הקפד לא לפגוע בדופן המעי או בכלי הדם הקשורים.
3. השתמש 8-0 תפרים לעבור דרך החיבור בין התריסריון והלבלב סביב הפפילה, ולמשוך אותם לצד שמאל של גוף העכבר כדי לתקן את התריסריון.
4. יש למשוך בעדינות את העור ואת הקצה התחתון של הכבד הצידה. מהדק את צינור הכבד המשותף, הקפדה לא להדק את וריד הפורטל או הלבלב. מהדקים את הצינור הביליופנקרטי הפרוקסימלי.
5. נקב את המיקרו-גנרטור לתוך צינור הביליופנקרטי הדיסטלי בנסיגה. תקן את קצה המחט ליד פפילה התריסריון עם מלחציים. להחדיר 10 μL של 5% TC לתוך צינור הלבלב בקצב של 5 μL / min.
6. שמור את צינור biliopancreatic סגור במשך 5 דקות כדי להשיג לחץ יציב. לאחר מכן, לשלוף את microinjector ולהסיר את מלחציים.
7. לשחזר את התריסריון למצב האנטומי המקורי ולבדוק את הדימום.
8. סגור את הפצע עם 6-0 תפרים ולחטא עם 0.5% יודופור.

4. התאוששות וניהול לאחר הניתוח

1. לשחזר את בעלי החיים מהרדמה על כרית תרמית 37 °C (50 °F). אל תשלחו את החיות המופעלות לחדר הזמן לאחר הניתוח עד שכל החיות יתעוררו.
2. לנהל 0.8 מ"ל של 0.9% מלוחים תת עורית ולאט עבור תוספי נוזלים.
3. עקוב אחר בעלי החיים לאחר הניתוח על מצבם הכללי וסימני זיהום או מחלה.

5. בדיקות סרולוגיות והערכה היסטולוגית

1. ב 24 שעות לאחר הניתוח, להרדים את העכברים עם נתרן pentobarbital באמצעות אותו מינון ומסלול הזרקה.
2. לאסוף את כל הדם מאבי העורקים בבטן (כ 0.8 מ"ל לכל עכבר) ולסובב ב 1,500 x g במשך 15 דקות כדי לבודד את הסרום לבדיקות נוספות.
3. לאסוף את רקמות הלבלב.
4. פתח את חלל בית החזה כדי לאסוף את רקמות הריאה.
5. למדוד את מדדי תפקוד הביוכימיה מהנסיוב, כולל עמילאז, ליפאז, תפקוד כבד (אלנין transaminase (ALT) ו transaminase אספרטט (AST)), ותפקוד הכליות (אוריאה וקריאטין), באמצעות ערכות מסחריות על פי הוראות היצרנים.
6. הומוגניזציה של רקמות הריאה והלבלב ולמדוד את רמת myeloperoxidase (MPO) באמצעות ערכה מסחרית על פי הוראות היצרן.
7. פתחו את חלל בית החזה והגדילו עם 20 מ"ל של תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) פעמיים, ואז אספו את הלבלב. יש לטבול בתמיסת 4% פרפורמלדהיד למשך 24 שעות. להתייבש בסדרה של ריכוזי אלכוהול ולהטמיע בפרפין.
8. השתמש microtome כדי להכין 5 מיקרומטר עבה רקמת הלבלב חלקים.
9. בצע הכתמת H&E להערכה היסטולוגית של הלבלב.
10. להעריך את הציונים הפתולוגיים על פי הקריטריונים המוצעים על ידי שמידט ואח '³⁰.

תוצאות

על ידי ביצוע קפדני של ההוראות לעיל, השגנו משך ניתוח ממוצע של כ 40 דקות. העכברים היו מעט לא פעילים ואיבדו כ-0.5-1.75 גרם, 0.85-1.85 גרם ו-0.5-4.73 גרם משקל ב-24 שעות, 48 שעות ו-72 שעות לאחר הניתוח, בהתאמה (איור 2).

מרגע השלמת הניתוח ועד 24 שעות לאחר הניתוח, עם התפתחות המחלה, העכברים ה?...

Discussion

מודל SAP המושרה על ידי TC הוא כלי מחקר מצוין. כפי שמוצג במחקר זה, מודל זה מתממש בקלות רבה במעבדות כלליות מבלי להשתמש במכשירים ספציפיים. כאשר נעשה בו שימוש בשילוב עם היסטולוגיה וניתוח ביוכימי, הוא מספק עלות - (ריאגנטים זולים) וחיסכון בזמן (חלון זמן של 24 שעות) לגרימת והערכה של AP. התאמת הריכוז של TC מ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% iodophor	Shanghai Likang Disinfectant	310102	4 mL/mouse
0.9% sodium chloride	Sinopharm Group Co., Ltd.	10019318	0.8 mL/mouse
1% Pentobarbital sodium	Sigma	P3761	0.2 -0.25 mL/mouse
25 μL flat tip Microliter syringe	Gaoge, Shanghai	A124019
4% Paraformaldehyde	Beyotime, Nantong, China	P0099-500ml
5% sodium taurocholate (TC)	Aladdin	S100834-5g	10 μL/SAP mouse
6-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (1/2 circle)	Cheng-He	20093
75% alcohol	Sinopharm Group Co., Ltd.	10009218	4 mL/mouse
8-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (3/8 circle)	Cheng-He	19064
ALT Activity Assay Kit	EPNK, Anhui, China	ALT0012
Amylase Assay Kit	EPNK, Anhui, China	AMY0012
Angled small bulldog clamp with 12 mm jaw (3 cm)	Cheng-He	HC-X022
aspen shavings or shreds for mouse bedding	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology	VR03015
AST Activity Assay Kit	EPNK, Anhui, China	AST0012
Blood Urea Nitrogen (BUN) Assay Kit	EPNK, Anhui, China	BUN0011
C57BL/6 mouse	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology	213
Creatine Assay Kit	EPNK, Anhui, China	CRE0012
Feature microtome blade	Beyotime, Nantong, China	E0994
Hemostatic Forceps (9.5 cm, Curved)	JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd.	JC3901
Lipase Assay Kit	Jiancheng, Nanjing, China	A054-2-1
Microtome	Leica biosystem, Germany	RM2245
Mindray biochemistry analyzer	Mindray, Shenzhen, China	BS-420
MPO Assay Kit	Jiancheng, Nanjing, China	A044-1-1
Normal mouse chow	Trophic, Nantong, China	LAD 1000
Phosphate buffered saline	Beyotime, Nantong, China	C0221A
Straight micro-bulldog clamp with 5 mm jaw (1.5 cm)	JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd.	W40130
Straight or curved forceps (11.0 cm)	Cheng-He	HC-X091A or HC-X090A
Straight Scissors (10.0 cm)	Cheng-He, Ningbo, China	HC-J039102
Thermo Scientific Centrifuge	Thermo Scientific, USA	Multifuge X1R