Etablierung eines Mausmodells für schwere akute Pankreatitis mittels retrograder Injektion von Natriumtaurocholat in den Gallengang

Zusammenfassung

Ein Mausmodell der schweren akuten Pankreatitis wird hierin beschrieben. Das hier vorgestellte Verfahren ist sehr schnell, einfach und zugänglich und ermöglicht so möglicherweise die Untersuchung der molekularen Mechanismen und verschiedener therapeutischer Interventionen bei akuter Pankreatitis auf bequeme Weise.

Zusammenfassung

Die Prävalenz der akuten Pankreatitis (AP), insbesondere der schweren akuten Pankreatitis (SAP), nimmt in jüngeren Altersgruppen jährlich zu. In der aktuellen klinischen Praxis mangelt es jedoch an wirksamen Behandlungen. Mit der leichten Zugänglichkeit von transgenen und Knockout-Stämmen und ihrer geringen Größe, die minimale Dosen von Medikamenten ermöglicht, die für die In-vivo-Bewertung erforderlich sind, wird ein gut etabliertes experimentelles Modell an Mäusen für die AP-Forschung bevorzugt. Darüber hinaus ist SAP induziert durch Natriumtaurocholat (TC) derzeit eines der am weitesten verbreiteten und am besten charakterisierten Modelle. Dieses Modell wurde auf neuartige Therapien und mögliche molekulare Ereignisse während des AP-Prozesses untersucht. Hier stellen wir die Generierung eines AP-Mausmodells unter Verwendung von Natriumtarocholat und einer einfachen hausgemachten Mikrospritze vor. Darüber hinaus stellen wir auch die Methodik für die anschließende Histologie und serologische Untersuchung zur Verfügung.

Einleitung

Akute Pankreatitis (AP) ist eine akute Entzündung der Bauchspeicheldrüse, die durch eine Obstruktion des Hauptgangs der Bauchspeicheldrüse mit anschließender duktaler Dehnung und Pankreas-Autodigestion durch ihre abnormal aktivierten Enzyme gekennzeichnet ist. Zu seinen klinischen Manifestationen gehören lokale oder systemische Entzündungen, Bauchschmerzen und eine Erhöhung der Serumamylase1,2. Gemäß der Schweregradklassifikation3 kann AP in leichten, mittelschweren und schweren Formen auftreten, und unter ihnen ist die schwere akute Pankreatitis (SAP) aufgrund ihrer hohen Sterblichkeitsrate von mehr als 30%⁴ die besorgniserregendste Erkrankung. In den Vereinigten Staaten ist AP einer der häufigsten Gründe für einen Krankenhausaufenthalt und betrifft über 200.000 ^Patienten5. Darüber hinaus nimmt apen, insbesondere SAP, jährlich zu und betrifft jüngere ^{Altersgruppen6}. Allerdings mangelt es in der aktuellen klinischen Praxis an wirksamen ^{Behandlungsmöglichkeiten6,7}. Daher ist es notwendig, die molekularen Mechanismen zu erforschen, die an AP beteiligt sind, um so die Verbesserung der Behandlung zu erleichtern.

Gut etablierte experimentelle Tiermodelle sind erforderlich, um die an AP beteiligten Mechanismen zu untersuchen und die Wirksamkeit verschiedener Behandlungsmodalitäten zu bewerten. Mit der leichten Zugänglichkeit von transgenen und Knockout-Stämmen und ihrer geringen Größe, die die für die In-vivo-Bewertung erforderlichen Dosen von Medikamenten minimiert, werden Mäuse für die AP-Forschung bevorzugt. Daher wurden mehrere Modelle von AP an Mäusen ^{entwickelt8,9}.

Niederau et al. arbeiteten aus einem Rattenmodell mit leichter Pankreatitis, das durch die intravenöse Verabreichung von ^Caerulein10 induziert wurde, ein SAP-Mausmodell mit aznarer Zellnekrose, die mit demselben Medikament und injektionsweg induziert ^wurde11. Obwohl dieses Modell mehrere Vorteile besitzt, darunter Nichtinvasivität, schnelle Induktion, breite Reproduzierbarkeit und Anwendbarkeit, besteht der Hauptnachteil darin, dass in den meisten Fällen nur eine milde Form von AP entwickelt wird, wodurch seine klinische Relevanz eingeschränkt wird. Alkohol gilt als einer der wichtigsten ätiologischen Faktoren von AP; Foitzik et al. berichteten jedoch, dass es nur in Kombination mit anderen Faktoren wie exokriner Hyperstimulation eine Pankreasverletzung ^verursacht12. Obwohl alkoholinduzierte AP-Modelle, die über verschiedene Verabreichungswege entwickelt wurden, und Arzneimitteldosen berichtet wurden13,14,15, ist ihr Hauptnachteil die Schwierigkeit, sie zu reproduzieren. Die intraperitoneale Verabreichung von L-Arginin kann bei Mäusen auch AP induzieren16; Seine geringe klinische Relevanz behindert jedoch seine Anwendung. Taurocholat, ein Gallensalz, wurde erstmals 1965 von Creutzfeld et al. vorgeschlagen, um einen Zustand zu induzieren, der der menschlichen AP über pankreatische Ganginfusion ^ähnelt17. Obwohl kontroversen über ihre klinische Relevanz in der Pathophysiologie ^{bestehen18,19}, bleibt die Taurocholat-induzierte Pankreatitis ein unverzichtbares Modell für SAP.

Da dieses Modell einfach zu realisieren ist und auch bei Mäusen wirksam ist, ist es heute eines der am häufigsten verwendeten AP-Modelle für Kleintier-In-vivo-Studien. Perides et al. verwendeten Natriumtaurocholat (TC), um SAP bei Mäusen zu ^induzieren20 und lieferten Einblicke in das Verständnis seiner Pathologie. In Kombination mit genetischen Modifikationstechniken hat uns dieses Modell ermöglicht, mehrere spezifische Gene zu bestätigen, die an AP beteiligt sind. Zum Beispiel zeigten Bicozo et al., dass ein Knockout des CD38-Gens vor einem Modell der TC-Infusions-Pankreatitis schützte und die Mechanismen auf Veränderungen in der intrazellulären ^Ca2+-Signalgebung ^{zurückführte21}. Fanczal et al. untersuchten die physiologischen Implikationen der TRPM2-Expression in der Plasmamembran von Pankreas-Acinar- und duktalen Zellen der Maus und zeigten einen reduzierten Schweregrad von TC-induziertem SAP bei TRPM2-Knockout-Mäusen22. Darüber hinaus bietet dieses Modell auch eine einfache und effektive Möglichkeit, viele neuartige Medikamente in vivo zu testen. Diese Methode ermöglichte beispielsweise die Validierung der therapeutischen Wirkungen von ^Koffein23, Dehydrocholsäure24 und verschiedenen Antioxidantien und Antikoagulanzien25,26. Diese Evidenz zeigt die Vielseitigkeit des TC-induzierten SAP-Modells. Obwohl Wittel et al. ein ähnliches ^Mausmodell27 beschrieben, könnte ein Mangel an Details zu den Implementierungsverfahren dazu führen, dass die Ergebnisse nicht reproduziert werden können. In diesem Artikel konzentrieren wir uns auf Methoden mit einer einfachen hausgemachten Mikrospritze und untersuchen TC-induziertes SAP und bieten damit eine mögliche Anleitung nicht nur für die weitere Untersuchung der Pathogenese und Behandlung von AP, sondern auch für eine perfekt anpassungsfähige experimentelle Methode für viele andere Substanzen.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden von der Tierethikkommission der Universität Soochow genehmigt. Alle chirurgischen Eingriffe wurden unter Vollnarkose durchgeführt. Analgetika wurden nicht verwendet, um Störungen des natürlichen Krankheitsverlaufs nach früheren Literaturen zu ^{vermeiden28,29}. Die Genehmigung für die fehlende Analgesie wurde auch von der Tierethikkommission der Soochow-Universität erteilt.

1. Vorbereitung

1. Schnell eine C57BL/6 Wildtyp Maus 8-12 h vor der Operation.
2. 5%ige (w/v) TC-Lösung (93 mM) in 0,9%ige Natriumchlorid verdünnt zubereiten. Filtern Sie die Lösung durch einen 0,22 μm-Filter.
3. Autoklavieren Sie die chirurgischen Instrumente und Materialien, einschließlich Pinzette, Schere, Klingenhalter, Nadelhalter, hämostatischen Clip, Gefäßklemmen und sterile Vorhänge, mit einem Drucksterilisator bei einer Temperatur von 121 ° C für 30 minuten.
4. Bereiten Sie eine hausgemachte Mikrospritze zu. Installieren Sie dazu manuell eine Einweg-Insulinspitze und eine verlängerte Kunststoffpipettenspitze auf einer 25-μL-Microliter-Spritze mit flacher Spitze. Sterilisieren durch Bestrahlung.

2. Anästhesie und präoperative Vorbereitung

1. Wiegen Sie 6 bis 8 Wochen alte männliche C57BL/6 Wildtypmäuse (ca. 21-23 g). Induzieren Sie eine Vollnarkose mit einer intraperitonealen Injektion von 1% Pentobarbital-Natriumlösung in einer Dosis von 50 mg/kg.
2. Befestigen Sie die Maus in Rückenlage mit dem Klebeband auf einer flachen Platte mit bestrahltem Schaumstoff.
3. Bereiten Sie die Operationsregion jedes Tieres vor, indem Sie sein Fell mit einer Enthaarungscreme von der Xiphoid-Prozessebene bis zur Verbindungslinie der bilateralen vorderen oberen Beckenwirbelsäule entfernen, wobei die linke und rechte Seite parallel zur vorderen Achsellinie verlaufen.
4. Bereiten Sie ein steriles Operationsfeld mit besonderem Fokus auf den Operationsbereich vor, bestehend aus dem auf dem Tier vorbereiteten Bereich und der Vorderseite des Chirurgen.
   1. Desinfizieren Sie die Tischplatte.
   2. Reinigen Sie die Inzisionsstelle mit mehreren Anwendungen der chirurgischen Peelinglösung. Wischen Sie die Haut zwei- bis dreimal mit 0,5% Iodophor ab und lassen Sie sie jeweils 1-2 min trocknen.
   3. Bedecken Sie die Maus mit sterilen Vorhängen.

3. Chirurgischer Eingriff

HINWEIS: Abbildung 1 zeigt die Anatomie und Morphologie der Bauchspeicheldrüse der Maus vor und nach der retrograden Injektion von TC in den Gallengang durch Mikroinjektion.

1. Machen Sie einen ca. 2 bis 3 cm langen medianen Bauchschnitt.
2. Lokalisieren Sie den Zwölffingerdarm von links nach rechts entlang des Magens. Ziehen Sie den Zwölffingerdarm vorsichtig mit einer chirurgischen Pinzette und einem mit Desinfektionsmittel getränkten Wattestäbchen nach außen und auf die linke Seite, um die Bauchspeicheldrüse, den Gallengang und die Zwölffingerdarmpapille freizulegen. Achten Sie darauf, die Darmwand oder verwandte Gefäße nicht zu verletzen.
3. Verwenden Sie 8-0 Nähte, um die Verbindung zwischen dem Zwölffingerdarm und der Bauchspeicheldrüse um die Papille zu passieren, und ziehen sie auf die linke Seite des Mauskörpers, um den Zwölffingerdarm zu fixieren.
4. Ziehen Sie die Haut und den unteren Rand der Leber vorsichtig zur Seite. Klemmen Sie den gemeinsamen Lebergang und achten Sie darauf, die Pfortader oder die Bauchspeicheldrüse nicht zu klemmen. Klemmen Sie den proximalen Gallengang.
5. Piercen Sie den Mikroinjektor retrograd in den distalen Gallengang. Befestigen Sie die Nadelspitze in der Nähe der Zwölffingerdarmpappe mit einer Klemme. 10 μL 5% TC mit einer Geschwindigkeit von 5 μL/min in den Pankreasgang geben.
6. Halten Sie den Gallengang 5 Minuten lang geschlossen, um einen stabilen Druck zu erreichen. Ziehen Sie dann den Mikroinjektor heraus und entfernen Sie die Klammern.
7. Stellen Sie den Zwölffingerdarm in die ursprüngliche anatomische Position zurück und überprüfen Sie die Blutung.
8. Schließen Sie die Wunde mit 6-0 Nähten und desinfizieren Sie sie mit 0,5% Iodophor.

4. Recovery und postoperatives Management

1. Erholen Sie die Tiere aus der Narkose auf einem 37 °C Wärmeleitpad. Schicken Sie die operierten Tiere erst dann in den zeitlichen postoperativen Raum, wenn alle Tiere aufgewacht sind.
2. Verabreichen Sie 0,8 ml 0,9% Kochsalzlösung subkutan und langsam zur Flüssigkeitsergänzung.
3. Überwachen Sie die Tiere postoperativ auf ihren Allgemeinzustand und Anzeichen von Infektionen oder Krankheiten.

5. Serologische Tests und histologische Bewertung

1. Nach 24 h nach der Operation betäuben Sie die Mäuse mit Pentobarbital-Natrium unter Verwendung der gleichen Dosis und injektionsweise.
2. Sammeln Sie das gesamte Blut aus der Bauchaorta (ca. 0,8 ml pro Maus) und drehen Sie es bei 1.500 x g für 15 minuten, um das Serum für weitere Tests zu isolieren.
3. Sammeln Sie das Bauchspeicheldrüsengewebe.
4. Öffnen Sie die Brusthöhle, um das Lungengewebe zu sammeln.
5. Messen Sie die biochemischen Funktionsindizes aus dem Serum, einschließlich Amylase, Lipase, Leberfunktion (Alanintransaminase (ALT) und Aspartattransaminase (AST)) und Nierenfunktion (Harnstoff und Kreatin), mit kommerziellen Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers.
6. Homogenisieren Sie das Lungen- und Bauchspeicheldrüsengewebe und messen Sie den Myeloperoxidasespiegel (MPO) mit einem kommerziellen Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
7. Öffnen Sie die Brusthöhle und perfundieren Sie zweimal mit 20 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und sammeln Sie dann die Bauchspeicheldrüse. 24 h in 4% ige Paraformaldehydlösung eintauchen. Dehydrieren Sie in einer Reihe von Alkoholkonzentrationen und betten Sie sie in Paraffin ein.
8. Verwenden Sie ein Mikrotom, um 5 μm dicke Pankreasgewebeschnitte vorzubereiten.
9. Führen Sie eine H & E-Färbung zur histologischen Beurteilung der Bauchspeicheldrüse durch.
10. Bewerten Sie die pathologischen Scores nach den von Schmidt et ^al.30 vorgeschlagenen Kriterien.

Ergebnisse

Durch sorgfältiges Befolgen der obigen Anweisungen erhielten wir eine mittlere Operationsdauer von ca. 40 min. Die Mäuse waren leicht inaktiv und hatten nach der Operation etwa 0,5-1,75 g, 0,85-1,85 g und 0,5-4,73 g Angewicht verloren (Abbildung 2).

Vom Zeitpunkt des Abschlusses der Operation bis 24 Stunden nach der Operation, als sich die Krankheit entwickelte, wurden die Mäuse inaktiv und zeigten langsame Reaktionen und Aktionen.

D...

Diskussion

Das TC-induzierte SAP-Modell ist ein hervorragendes Forschungsinstrument. Wie in dieser Studie gezeigt, ist dieses Modell in allgemeinen Labors sehr einfach zu realisieren, ohne spezielle Geräte zu verwenden. In Kombination mit Histologie und biochemischer Analyse bietet es einen kosten- (kostengünstige Reagenzien) und zeitsparenden (24 h Zeitfenster) Ansatz zur Induktion und Bewertung von AP. Die Anpassung der TC-Konzentration bietet auch die Möglichkeit, milde und moderate AP zu erzeugen. Perides et al. verwendeten ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% iodophor	Shanghai Likang Disinfectant	310102	4 mL/mouse
0.9% sodium chloride	Sinopharm Group Co., Ltd.	10019318	0.8 mL/mouse
1% Pentobarbital sodium	Sigma	P3761	0.2 -0.25 mL/mouse
25 μL flat tip Microliter syringe	Gaoge, Shanghai	A124019
4% Paraformaldehyde	Beyotime, Nantong, China	P0099-500ml
5% sodium taurocholate (TC)	Aladdin	S100834-5g	10 μL/SAP mouse
6-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (1/2 circle)	Cheng-He	20093
75% alcohol	Sinopharm Group Co., Ltd.	10009218	4 mL/mouse
8-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (3/8 circle)	Cheng-He	19064
ALT Activity Assay Kit	EPNK, Anhui, China	ALT0012
Amylase Assay Kit	EPNK, Anhui, China	AMY0012
Angled small bulldog clamp with 12 mm jaw (3 cm)	Cheng-He	HC-X022
aspen shavings or shreds for mouse bedding	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology	VR03015
AST Activity Assay Kit	EPNK, Anhui, China	AST0012
Blood Urea Nitrogen (BUN) Assay Kit	EPNK, Anhui, China	BUN0011
C57BL/6 mouse	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology	213
Creatine Assay Kit	EPNK, Anhui, China	CRE0012
Feature microtome blade	Beyotime, Nantong, China	E0994
Hemostatic Forceps (9.5 cm, Curved)	JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd.	JC3901
Lipase Assay Kit	Jiancheng, Nanjing, China	A054-2-1
Microtome	Leica biosystem, Germany	RM2245
Mindray biochemistry analyzer	Mindray, Shenzhen, China	BS-420
MPO Assay Kit	Jiancheng, Nanjing, China	A044-1-1
Normal mouse chow	Trophic, Nantong, China	LAD 1000
Phosphate buffered saline	Beyotime, Nantong, China	C0221A
Straight micro-bulldog clamp with 5 mm jaw (1.5 cm)	JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd.	W40130
Straight or curved forceps (11.0 cm)	Cheng-He	HC-X091A or HC-X090A
Straight Scissors (10.0 cm)	Cheng-He, Ningbo, China	HC-J039102
Thermo Scientific Centrifuge	Thermo Scientific, USA	Multifuge X1R