Создание мышиной модели тяжелого острого панкреатита с использованием ретроградной инъекции таурохолата натрия в билиопанкреатический проток

Резюме

В настоящем описана мышиная модель тяжелого острого панкреатита. Процедура, представленная здесь, очень быстрая, простая и доступная, что потенциально позволяет изучать молекулярные механизмы и различные терапевтические вмешательства при остром панкреатите удобным способом.

Аннотация

Распространенность острого панкреатита (АП), особенно тяжелого острого панкреатита (САП), ежегодно увеличивается в младших возрастных группах. Однако в современной клинической практике не хватает эффективных методов лечения. Благодаря легкой доступности трансгенных и нокаутных штаммов и их небольшому размеру, что позволяет использовать минимальные дозы препаратов, необходимых для оценки in vivo , для исследования АП предпочтительна хорошо зарекомендовавшая себя экспериментальная модель на мышах. Кроме того, SAP, индуцированный с помощью таурохолата натрия (TC), в настоящее время является одной из наиболее широко используемых и наиболее характеризуемых моделей. Эта модель была исследована для новых методов лечения и возможных молекулярных событий во время процесса AP. Здесь мы представляем поколение модели мыши AP с использованием таурохолата натрия и простого самодельного микрошприца. Кроме того, мы также предоставляем методологию для последующего гистологического и серологического тестирования.

Введение

Острый панкреатит (АП) – острое воспаление поджелудочной железы, характеризующееся обструкцией главного протока поджелудочной железы с последующим растяжением протоков и аутоперевариванием поджелудочной железы ее аномально активированными ферментами. Его клинические проявления включают местное или системное воспаление, боль в животе и повышение уровня амилазы в сыворотке ^{крови1,2}. Согласно классификации ^{тяжести3}, АП может присутствовать в легких, умеренных и тяжелых формах, и среди них тяжелый острый панкреатит (САП) является наиболее тревожным состоянием из-за его высокой смертности более 30%⁴. В Соединенных Штатах AP является одной из наиболее распространенных причин госпитализации, затрагивающей более 200 000 ^{пациентов5}. Кроме того, АП, особенно САП, ежегодно увеличивается и затрагивает младшие возрастные ^{группы6}. Однако в современной клинической практике отсутствуют эффективные варианты ^{лечения6,7}. Поэтому необходимо исследовать молекулярные механизмы, участвующие в АП, тем самым способствуя улучшению лечения.

Хорошо зарекомендовавшие себя экспериментальные модели на животных необходимы для изучения механизмов, участвующих в АП, и оценки эффективности различных методов лечения. Благодаря легкой доступности трансгенных и нокаутных штаммов и их небольшому размеру, что сводит к минимуму дозы препаратов, необходимых для оценки in vivo, мыши предпочтительны для исследования AP. Поэтому на мышах было разработано несколько моделей ^АП8,9.

Работая с моделью крыс с легким панкреатитом, индуцированной путем внутривенного введения caerulein10, Niederau et al. разработали модель мыши SAP, представленную с некрозом ацинарных клеток, индуцированным с использованием того же препарата и инъекционного ^{маршрута11}. Хотя эта модель обладает рядом преимуществ, включая неинвазивность, быструю индукцию, широкую воспроизводимость и применимость, основным недостатком является то, что в большинстве случаев развивается только легкая форма АП, тем самым ограничивая ее клиническую значимость. Алкоголь считается одним из основных этиологических факторов АП; Однако Foitzik et al. сообщили, что он вызывает повреждение поджелудочной железы только в сочетании с другими факторами, такими как экзокринная гиперстимуляция12. Более того, хотя модели АП, индуцированные алкоголем, разработанные с помощью различных путей введения, и дозы лекарств были зарегистрированы13,14,15, их основным недостатком является трудность их воспроизведения. Внутрибрюшинное введение L-аргинина также может индуцировать AP у ^мышей16; однако его низкая клиническая значимость препятствует его применению. Таурохолат, желчная соль, был впервые предложен Creutzfeld et al. в 1965 году для индуцирования состояния, напоминающего человеческий AP, посредством инфузии протоков поджелудочной ^{железы17}. Хотя существуют споры относительно его клинической значимости в патофизиологии18,19, панкреатит, вызванный таурохолатом, остается незаменимой моделью для SAP.

Поскольку эта модель проста в реализации, а также эффективна на мышах, в настоящее время она является одной из наиболее часто используемых моделей AP для исследований на мелких животных in vivo. Perides et al. использовали таурохолат натрия (TC) для индуцирования SAP у ^мышей20, предоставляя понимание для понимания его патологии. В сочетании с методами генетической модификации эта модель позволила нам подтвердить несколько конкретных генов, участвующих в AP. Например, Bicozo et al. показали, что нокаут гена CD38 защищает от модели панкреатита TC-инфузии и приписывает механизмы изменениям во внутриклеточной передаче сигналов ^Ca2+21. Fanczal et al. исследовали физиологическое значение экспрессии TRPM2 в плазматической мембране ацинарных и протоковых клеток поджелудочной железы мыши и продемонстрировали снижение тяжести TC-индуцированного SAP у нокаутирующих мышей ^TRPM22. Кроме того, эта модель также обеспечивает простой и эффективный способ тестирования многих новых лекарств in vivo. Например, этот метод позволил валидировать терапевтические эффекты ^{кофеина23}, дегидрохолевой ^{кислоты24} и различных антиоксидантов и антикоагулянтов25,26. Эти данные демонстрируют универсальность модели SAP, индуцированной TC. Хотя Wittel et al. описали аналогичную модель ^мыши27, отсутствие подробностей о процедурах реализации может привести к невозможности воспроизвести результаты. В этой статье мы сосредоточимся на методах с использованием простого самодельного микрошприца и исследуем TC-индуцированный SAP, тем самым предоставляя возможное руководство не только для дальнейшего изучения патогенеза и лечения АП, но и для идеально адаптируемого экспериментального метода для многих других веществ.

протокол

Все эксперименты с участием животных были одобрены Комитетом по этике животных Университета Сучжоу. Все хирургические процедуры проводились под полным наркозом. Анальгетики не применялись, чтобы избежать вмешательства в естественное течение болезни согласно предыдущим ^{литературам28,29}. Одобрение отсутствия анальгезии было также предоставлено Комитетом по этике животных Университета Сучжоу.

1. Подготовка

1. Голодайте мышь дикого типа C57BL/6 за 8-12 ч до операции.
2. Готовят 5% (мас./об.) раствор ТС (93 мМ), разбавленный в 0,9% натрия хлорида. Процедите раствор через фильтр 0,22 мкм.
3. Автоклав хирургических инструментов и материалов, включая щипцы, ножницы, держатель лезвия, держатель иглы, гемостатический зажим, сосудистые зажимы и стерильные шторы, используя стерилизатор давления при температуре 121 °C в течение 30 мин.
4. Приготовьте самодельный микрошприц. Для этого вручную установите одноразовый инсулиновый наконечник и удлиненный пластиковый наконечник пипетки на шприц Microliter с плоским наконечником объемом 25 мкл. Стерилизуют путем облучения.

2. Анестезия и предоперационная подготовка

1. Весите от 6 до 8 недель самцов C57BL/6 мышей дикого типа (примерно 21-23 г). Индуцируют общую анестезию внутрибрюшинной инъекцией 1% пентобарбитала раствором натрия в дозе 50 мг/кг.
2. Зафиксируйте мышь в положении лежа на спине на плоской пластине из анирадиированной пены с помощью ленты.
3. Подготовьте область операции каждого животного, удалив его шерсть с кремом для депиляции от уровня мечевидного отростка вниз до соединительной линии двустороннего переднего верхнего подвздошного отдела позвоночника, с левой и правой сторонами, параллельными передней подмышечной линии.
4. Подготовьте стерильное хирургическое поле с особым акцентом на хирургическую область, состоящую из области, подготовленной на животном и передней части хирурга.
   1. Продезинфицируйте столешницу.
   2. Очистите место разреза с помощью многократных применений раствора хирургического скраба. Протрите кожу два-три раза 0,5% йодофором и каждый раз давайте ей высохнуть в течение 1-2 мин.
   3. Накройте мышь стерильными шторами.

3. Хирургическая процедура

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 изображена анатомия и морфология поджелудочной железы мыши до и после ретроградной инъекции ТК в билиопанкреатический проток путем микроинъекции.

1. Сделайте средний разрез брюшной полости длиной от 2 до 3 см.
2. Расположите двенадцатиперстную кишку слева направо вдоль желудка. Осторожно вытяните двенадцатиперстную кишку наружу и в левую сторону, используя хирургические щипцы и пропитанный дезинфицирующим средством ватный тампон, чтобы обнажить поджелудочную железу, билиопанкреатический проток и дуоденальный сосочек. Позаботьтесь о том, чтобы не повредить стенку кишечника или связанные с ней сосуды.
3. Использование 8-0 Швы проходят через соединение между двенадцатиперстной кишкой и поджелудочной железой вокруг сосочка, и натягивают их на левую сторону тела мыши, чтобы зафиксировать двенадцатиперстную кишку.
4. Аккуратно оттяните кожу и нижний край печени в сторону. Зажмите общий печеночный проток, следя за тем, чтобы не зажимать воротную вену или поджелудочную железу. Зажмите проксимальный билиопанкреатический проток.
5. Ретроградно проткните микроинъектор в дистальный билиопанкреатический проток. Зафиксируйте кончик иглы возле двенадцатиперстной кишки с помощью зажима. Вводят 10 мкл 5% ТК в проток поджелудочной железы со скоростью 5 мкл/мин.
6. Держите билиопанкреатический проток закрытым в течение 5 минут для достижения стабильного давления. Затем вытащите микроинжектор и снимите зажимы.
7. Восстановить двенадцатиперстную кишку до исходного анатомического положения и проверить кровотечение.
8. Закройте рану 6-0 швами и продезинфицируйте 0,5% йодофором.

4. Восстановление и послеоперационное ведение

1. Извлеките животных из анестезии на термопрокладке с температурой 37 °C. Не отправляйте прооперированных животных во временное послеоперационное помещение, пока все животные не проснутся.
2. Вводят 0,8 мл 0,9% физиологического раствора подкожно и медленно для приема жидких добавок.
3. Следите за животными после операции на предмет их общего состояния и признаков инфекций или болезни.

5. Серологическое тестирование и оценка гистологии

1. Через 24 ч после операции обезболивают мышей пентобарбиталом натрия, используя ту же дозу и инъекционный путь.
2. Соберите всю кровь из брюшной аорты (около 0,8 мл на мышь) и вращайтесь при 1 500 х г в течение 15 мин, чтобы изолировать сыворотку для дальнейшего тестирования.
3. Соберите ткани поджелудочной железы.
4. Откройте грудную полость для сбора легочных тканей.
5. Измерьте показатели биохимической функции сыворотки, включая амилазу, липазу, функцию печени (аланинтрансаминазу (АЛТ) и аспартаттрансаминазу (АСТ)) и функцию почек (мочевина и креатин), используя коммерческие наборы в соответствии с инструкциями производителей.
6. Гомогенизировать ткани легких и поджелудочной железы и измерить уровень миелопероксидазы (МПО) с помощью коммерческого комплекта в соответствии с инструкциями производителя.
7. Вскройте грудную полость и дважды продуйте 20 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), затем соберите поджелудочную железу. Погрузить в 4% раствор параформальдегида на 24 ч. Обезвоживают в серии концентраций алкоголя и встраивают в парафин.
8. Используйте микротом для подготовки участков ткани поджелудочной железы толщиной 5 мкм.
9. Выполните окрашивание H&E для гистологической оценки поджелудочной железы.
10. Оцените патологические оценки в соответствии с критериями, предложенными Schmidt et ^al.30.

Результаты

Тщательно следуя приведенным выше инструкциям, мы получили среднюю продолжительность операции около 40 минут. Мыши были слегка неактивны и потеряли примерно 0,5-1,75 г, 0,85-1,85 г и 0,5-4,73 г веса через 24 ч, 48 ч и 72 ч после операции соответственно (рисунок 2).

С момента ...

Обсуждение

Модель SAP, индуцированная TC, является отличным инструментом исследования. Как показано в этом исследовании, эта модель очень легко реализуется в общих лабораториях без использования конкретных устройств. При использовании в сочетании с гистологическим и биохимическим анализом он обе?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% iodophor	Shanghai Likang Disinfectant	310102	4 mL/mouse
0.9% sodium chloride	Sinopharm Group Co., Ltd.	10019318	0.8 mL/mouse
1% Pentobarbital sodium	Sigma	P3761	0.2 -0.25 mL/mouse
25 μL flat tip Microliter syringe	Gaoge, Shanghai	A124019
4% Paraformaldehyde	Beyotime, Nantong, China	P0099-500ml
5% sodium taurocholate (TC)	Aladdin	S100834-5g	10 μL/SAP mouse
6-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (1/2 circle)	Cheng-He	20093
75% alcohol	Sinopharm Group Co., Ltd.	10009218	4 mL/mouse
8-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (3/8 circle)	Cheng-He	19064
ALT Activity Assay Kit	EPNK, Anhui, China	ALT0012
Amylase Assay Kit	EPNK, Anhui, China	AMY0012
Angled small bulldog clamp with 12 mm jaw (3 cm)	Cheng-He	HC-X022
aspen shavings or shreds for mouse bedding	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology	VR03015
AST Activity Assay Kit	EPNK, Anhui, China	AST0012
Blood Urea Nitrogen (BUN) Assay Kit	EPNK, Anhui, China	BUN0011
C57BL/6 mouse	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology	213
Creatine Assay Kit	EPNK, Anhui, China	CRE0012
Feature microtome blade	Beyotime, Nantong, China	E0994
Hemostatic Forceps (9.5 cm, Curved)	JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd.	JC3901
Lipase Assay Kit	Jiancheng, Nanjing, China	A054-2-1
Microtome	Leica biosystem, Germany	RM2245
Mindray biochemistry analyzer	Mindray, Shenzhen, China	BS-420
MPO Assay Kit	Jiancheng, Nanjing, China	A044-1-1
Normal mouse chow	Trophic, Nantong, China	LAD 1000
Phosphate buffered saline	Beyotime, Nantong, China	C0221A
Straight micro-bulldog clamp with 5 mm jaw (1.5 cm)	JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd.	W40130
Straight or curved forceps (11.0 cm)	Cheng-He	HC-X091A or HC-X090A
Straight Scissors (10.0 cm)	Cheng-He, Ningbo, China	HC-J039102
Thermo Scientific Centrifuge	Thermo Scientific, USA	Multifuge X1R