비리오크크레아티드 덕트에 타우로콜레이트 나트륨의 역행 주입을 사용하여 마우스 심각한 급성 췌장염 모델의 설립

요약

중증 급성 췌장염의 마우스 모델은 본원에 기재된다. 여기에 제시된 절차는 매우 빠르고 간단하며 접근 가능하므로 잠재적으로 분자 메커니즘및 급성 췌장염의 다른 치료 내정간섭에 대한 연구가 편리한 방법으로 허용됩니다.

초록

급성 췌장염의 보급 (AP), 특히 심한 급성 췌장염 (SAP), 매년 젊은 연령 그룹에서 증가. 그러나, 현재 임상 실습에 효과적인 치료의 부족이 있다. 형질 전환 및 녹아웃 균주의 쉬운 접근성과 생체 내 평가에 필요한 약물의 최소 용량을 허용하는 작은 크기로, 마우스에서 잘 확립 된 실험 모델은 AP 연구에 선호됩니다. 더욱이, 타우로콜레이트 나트륨(TC)을 통해 유도된 SAP는 현재 가장 널리 사용되고 가장 잘 특징적인 모델 중 하나입니다. 이 모형은 AP의 프로세스 도중 새로운 치료 및 가능한 분자 사건을 위해 조사되었습니다. 여기서는 타우로콜레이트 나트륨과 간단한 수제 현미경을 이용한 AP 마우스 모델의 생성을 소개합니다. 또한, 우리는 또한 후속 조직학 및 세로가지 시험을 위한 방법론을 제공합니다.

서문

급성 췌장염 (AP)은 비정상적으로 활성화 된 효소에 의해 후속 덕트 팽창 및 췌장 자가 소화를 가진 주요 췌장 덕트의 방해를 특징으로하는 췌장의 급성 염증입니다. 그것의 임상 표현은 현지 또는 전신 염증, 복통 및 혈청 아밀라세^1,2의 고도를 포함합니다. 심각도 분류³에 따르면 AP는 경미하고, 온건하고, 심한 형태로 존재할 수 있으며, 그 중 심각한 급성 췌장염(SAP)은 30%⁴ 이상의 높은 사망률로 인해 가장 심각한 급성 췌장염(SAP)이 가장 우려되는 상태입니다. 미국에서 AP는 200,000명 이상의 환자에 영향을 미치는 입원의 가장 흔한 이유 중 하나입니다⁵. 더욱이 AP, 특히 SAP는 매년 증가하고 젊은 연령집단에 영향을 미치고 있다⁶. 그러나, 현재 임상 실습에 효과적인 치료 옵션의 부족^이있다6,7. 따라서 AP에 관련된 분자 메커니즘을 탐구하여 치료 개선을 촉진할 필요가 있습니다.

잘 확립 된 실험 동물 모델은 AP에 관련된 메커니즘을 연구하고 다른 치료 양식의 효과를 평가하기 위해 필요합니다. 형질 전환 및 녹아웃 균주의 쉬운 접근성과 생체 내 평가에 필요한 약물의 용량을 최소화하는 작은 크기로, 마우스는 AP 연구에 선호됩니다. 따라서, AP의 몇몇 모형은 마우스^8,9에서 개발되었습니다.

^{caeruleinin10}의 정맥 투여를 통해 유도된 온화한 췌장염 쥐 모델에서 작업한 Niederau et al.은 동일한 약물 및 ^{주사 경로를 사용하여} 유도된 아시나르 세포 괴사로 제시된 SAP 마우스 모델을 개발했다. 이 모델은 비침습성, 신속한 유도, 넓은 재현성 및 적용가능성을 포함한 몇 가지 장점을 가지고 있지만, 가장 큰 단점은 대부분의 경우 온화한 형태의 AP만이 개발되어 임상 관련성을 제한한다는 것입니다. 알코올은 AP의 주요 과인자 중 하나로 간주됩니다. 그러나, Foitzik 외. 외는 외크림 과자극¹²와 같은 그밖 요인과 결합될 때만 췌장 상해를 일으키는 원인이 된다는 것을 보고했습니다. 더욱이, 알콜 유도 AP 모형은 다른 행정 경로를 통해 개발되고, 약 복용량^{이 보고되고} 있더라^{도, 그들의} 주요 단점은 그(것)들을 재생하는 어려움입니다. L-아르기닌의 복막 투여는 마우스¹⁶에서 AP를 유도할 수 있다; 그러나, 그것의 낮은 임상 관련성은 그것의 응용프로그램을 방해합니다. 황소 자리, 담즙 소금, 먼저 췌장 덕트 주입을 통해 인간의 AP를 닮은 조건을 유도하기 위한 1965 년에 Creutzfeld 외. 에 의해 제안 되었다¹⁷. 병리학학^18,19의 임상 관련성에 관한 논쟁이 존재하지만, 타우로콜린성 유도 췌장염은 SAP에 필수적인 모델로 남아 있습니다.

이 모델은 실현하기 쉽고 마우스에도 효과적이기 때문에, 이제 생체 내 연구에서 작은 동물을 위한 가장 많이 사용되는 AP 모델 중 하나입니다. Perides 외. 마우스²⁰에서 SAP를 유도하기 위해 타우로콜레이트 나트륨(TC)을 고용하여 병리학을 이해하는 통찰력을 제공했습니다. 유전자 변형 기술과 결합된 이 모델은 AP에 관련된 몇 가지 특정 유전자를 확인할 수 있게 되었습니다. 예를 들어, Bicozo 외. CD38 유전자의 녹아웃은 TC-주입 췌장염의 모델에 대하여 보호되고 세포내 ^{Ca2+ signaling21}에 있는 변경에 기계장치를 기인한다는 것을 보여주었습니다. Fanczal 외. 마우스 췌장 아시나르 및 덕트 세포의 혈장 막에서 TRPM2 발현의 생리적 의미를 조사하고 TRPM2 녹아웃 ^mice22에서 TC 유도 SAP의 감소된 심각도를 입증하였다. 또한,이 모델은 또한 생체 내에서 많은 새로운 약물을 테스트하는 간단하고 효과적인 방법을 제공합니다. 예를 들어, 이 방법은 카페인²³, 탈수성산²⁴ 및 다양한 항산화제 및 항응고제^25,26의 치료 효과를 검증가능하게 하였다. 이 증거는 TC 유도 SAP 모델의 다재다능함을 보여줍니다. Wittel 외는 유사한 마우스 모델을 설명했지만²⁷, 구현 절차에 대한 세부 사항의 부족은 결과를 재현 할 수없는 발생할 수 있습니다. 이 기사에서는 간단한 수제 현미경을 이용한 방법에 초점을 맞추고 TC 유도 SAP를 연구하여 AP의 발병 및 치료에 대한 추가 연구뿐만 아니라 다른 많은 물질에 완벽하게 적응할 수 있는 실험 방법을 위한 가능한 지침을 제공합니다.

프로토콜

동물과 관련된 모든 실험은 소오하우 대학의 동물 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 모든 수술 절차는 완전한 마취하에 수행되었습니다. 진통제는 이전 문학에 따라 질병의 자연적인 과정에 간섭을 피하기 위하여 이용되지 않았습니다^28,29. 진통제의 부족에 대한 승인은 또한 소오하우 대학의 동물 윤리위원회에 의해 부여되었다.

1. 준비

1. 수술 전 C57BL/6 야생형 마우스 8-12h를 빠르게 합니다.
2. 5% (w/v) TC 용액(93mMM)을 0.9%의 염화나트륨으로 희석한다. 0.22 μm 필터를 통해 용액을 필터링합니다.
3. 30분 동안 121°C의 온도에서 압력 멸균기를 사용하여 집게, 가위, 블레이드 홀더, 바늘 홀더, 혈전 성 클립, 혈관 클램프 및 멸균 드레이프를 포함한 수술 기구 및 재료를 자동 클랩합니다.
4. 수제 마이크로시링을 준비합니다. 이렇게 하려면 일회용 인슐린 팁과 25 μL 플랫 팁 마이크로리터 주사기에 장기간 플라스틱 파이펫 팁을 수동으로 설치합니다. 조사를 통해 살균.

2. 마취 및 수술 전 준비

1. 6-8주 된 남성 C57BL/6 야생형 마우스(약 21-23g)의 무게. 50 mg/kg의 용량으로 1% 펜토바르비탈 나트륨 용액의 관면 주사로 전신 마취를 유도하십시오.
2. 테이프와 함께 마취폼 플랫 플레이트의 수핀 위치에 마우스를 고정합니다.
3. 각 동물의 작동 영역을 시포이트 공정 수준에서 하향 조정하여 양측 전방 우수 일강 척추의 연결 선까지, 좌우면은 전방 축균선과 평행하게 결합하여 준비한다.
4. 외과 적 부위와 외과 의사의 전면에 준비된 영역으로 구성된 외과 적 부위에 중점을 둔 멸균 수술장을 준비하십시오.
   1. 벤치탑을 소독합니다.
   2. 수술 스크럽 솔루션의 여러 응용 프로그램으로 절개 부위를 청소하십시오. 0.5%의 요오도프기로 2~3회 피부를 닦아 매번 1-2분 동안 건조시키십시오.
   3. 멸균 커튼으로 마우스를 덮습니다.

3. 외과 적 절차

참고: 도 1 은 마이크로 주입에 의한 이중 성 원각 덕트에 TC의 역행 주입 전후에 마우스 췌장의 해부학 및 형태학을 묘사합니다.

1. 약 2 ~ 3cm 길이의 중앙위부 절개를 합니다.
2. 위장을 따라 십이지장(duodenum)을 왼쪽에서 오른쪽으로 찾습니다. 십이지장과 왼쪽을 외과 용 집게와 소독제에 젖은 면봉을 사용하여 췌장, 이중 성 덕트 및 십이지장 유두를 부드럽게 당깁니다. 장 벽이나 관련 선박을 손상시키지 않도록주의하십시오.
3. 8-0 사용 유두 주위의 십이지장과 췌장 사이의 연결을 통과하고 마우스 몸의 왼쪽으로 당겨 십이지장을 고치도록 봉합사.
4. 피부와 간 의 아래 쪽 가장자리를 부드럽게 당깁니다. 일반적인 간 덕트를 고정하여 포털 정맥이나 췌장을 고정하지 않도록 하십시오. 근위 이중성 덕트를 고정합니다.
5. 소인주사를 분해 성 빌리오판크레아틱 덕트로 역행하여 관통합니다. 십이지성 유두 근처의 바늘 끝을 클램프로 고정합니다. 5 μL/min의 속도로 췌장 덕트에 5% TC의 10 μL을 주입합니다.
6. 안정적인 압력을 달성하기 위해 5 분 동안 비오 판크레틱 덕트를 닫습니다. 그런 다음 마이크로 인젝터를 꺼내 클램프를 제거합니다.
7. 십이지드넘을 원래 해부학적 위치로 복원하고 출혈을 확인합니다.
8. 6-0 봉합사로 상처를 닫고 0.5 %의 요오도프로 소독하십시오.

4. 복구 및 수술 후 관리

1. 37°C 열패드에서 마취에서 동물을 회수합니다. 모든 동물이 깨어날 때까지 수술 후 수술 후 방에 수술 된 동물을 보내지 마십시오.
2. 0.8 mL의 식염수 피하 및 천천히 유체 보충제를 투여하십시오.
3. 그들의 일반적인 상태 및 감염 또는 질병의 표시에 대 한 수술 후 동물을 모니터링.

5. 세로지학적 시험 및 적법평가

1. 에서 24 수술 후, 동일한 복용량 및 주입 경로를 사용 하 여 pentobarbital 나트륨으로 쥐를 마취.
2. 복부 대어타 (마우스 당 약 0.8 mL)에서 모든 혈액을 수집하고 추가 테스트를 위해 혈청을 분리하기 위해 1,500 x g 에서 15 분 동안 회전합니다.
3. 췌장 조직을 수집합니다.
4. 흉부 구멍을 열어 폐 조직을 수집합니다.
5. 아밀라제, 리파제, 간 기능(알라닌 트랜스아미나아제(ALT) 및 아스파르타트 트랜스아미나아제(AST) 및 신장 기능(urea 및 creatine)을 포함한 혈청의 생화학 기능 지수를 제조업체의 지침에 따라 상용 키트를 사용하여 측정합니다.
6. 폐와 췌장 조직을 균질화하고 제조업체의 지침에 따라 상용 키트를 사용하여 골수페록시다아제 (MPO) 수준을 측정합니다.
7. 흉부 캐비티를 열고 20 mL의 인산염 완충식식염수(PBS)를 두 번 인산염 식염수(PBS)로 인퓨즈한 다음 췌장을 수집합니다. 24시간 동안 4% 파라포름알데히드 용액에 담가 보시면 됩니다. 일련의 알코올 농도에서 탈수하고 파라핀에 포함됩니다.
8. 마이크로토메를 사용하여 5 μm 두께의 췌장 조직 섹션을 준비하십시오.
9. 췌장의 조직학적 평가를 위해 H&E 염색을 수행합니다.
10. 슈미트 외 ³⁰에서 제안된 기준에 따라 병리학 점수를 평가한다.

결과

위의 지시에 따라 약 40분의 평균 수술 기간을 얻었습니다. 마우스는 약간 비활성 상태였으며 각각 24시간, 48h 및 72h에서 약 0.5-1.75g, 0.85-1.85g 및 0.5-4.73g의 무게를 잃었습니다(그림 2).

수술 이완 시점부터 수술 후 24시간까지, 질병이 발달함에 따라 마우스는 비활성 상태가 되어 반응이 느리고 행동하였다.

대조군과 SAP 마우스의 생존율?...

토론

TC 유도 SAP 모델은 우수한 연구 도구입니다. 이 연구에서 와 같이,이 모델은 특정 장치를 사용하지 않고 일반 실험실에서 매우 쉽게 실현됩니다. 조직학 및 생화학적 분석과 함께 사용될 경우 AP를 유도하고 평가하기 위한 비용-(저렴한 시약) 및 시간 절약(24h 시간 창) 접근법을 제공합니다. TC의 농도조정은 또한 SAP를 유도하기 위해 TC를 고용하여 마우스²⁰에 SAP를 유도할 수 있는 가...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% iodophor	Shanghai Likang Disinfectant	310102	4 mL/mouse
0.9% sodium chloride	Sinopharm Group Co., Ltd.	10019318	0.8 mL/mouse
1% Pentobarbital sodium	Sigma	P3761	0.2 -0.25 mL/mouse
25 μL flat tip Microliter syringe	Gaoge, Shanghai	A124019
4% Paraformaldehyde	Beyotime, Nantong, China	P0099-500ml
5% sodium taurocholate (TC)	Aladdin	S100834-5g	10 μL/SAP mouse
6-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (1/2 circle)	Cheng-He	20093
75% alcohol	Sinopharm Group Co., Ltd.	10009218	4 mL/mouse
8-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (3/8 circle)	Cheng-He	19064
ALT Activity Assay Kit	EPNK, Anhui, China	ALT0012
Amylase Assay Kit	EPNK, Anhui, China	AMY0012
Angled small bulldog clamp with 12 mm jaw (3 cm)	Cheng-He	HC-X022
aspen shavings or shreds for mouse bedding	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology	VR03015
AST Activity Assay Kit	EPNK, Anhui, China	AST0012
Blood Urea Nitrogen (BUN) Assay Kit	EPNK, Anhui, China	BUN0011
C57BL/6 mouse	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology	213
Creatine Assay Kit	EPNK, Anhui, China	CRE0012
Feature microtome blade	Beyotime, Nantong, China	E0994
Hemostatic Forceps (9.5 cm, Curved)	JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd.	JC3901
Lipase Assay Kit	Jiancheng, Nanjing, China	A054-2-1
Microtome	Leica biosystem, Germany	RM2245
Mindray biochemistry analyzer	Mindray, Shenzhen, China	BS-420
MPO Assay Kit	Jiancheng, Nanjing, China	A044-1-1
Normal mouse chow	Trophic, Nantong, China	LAD 1000
Phosphate buffered saline	Beyotime, Nantong, China	C0221A
Straight micro-bulldog clamp with 5 mm jaw (1.5 cm)	JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd.	W40130
Straight or curved forceps (11.0 cm)	Cheng-He	HC-X091A or HC-X090A
Straight Scissors (10.0 cm)	Cheng-He, Ningbo, China	HC-J039102
Thermo Scientific Centrifuge	Thermo Scientific, USA	Multifuge X1R