Creazione di un modello di pancreatite acuta grave del topo mediante iniezione retrograda di taurocolato di sodio nel dotto biliopancreatico

Riepilogo

Un modello murino di pancreatite acuta grave è descritto qui. La procedura qui presentata è molto rapida, semplice e accessibile, consentendo così potenzialmente lo studio dei meccanismi molecolari e dei diversi interventi terapeutici nella pancreatite acuta in modo conveniente.

Abstract

La prevalenza della pancreatite acuta (AP), in particolare della pancreatite acuta grave (SAP), è in aumento nei gruppi di età più giovani ogni anno. Tuttavia, vi è una mancanza di trattamenti efficaci nell'attuale pratica clinica. Con la facile accessibilità dei ceppi transgenici e knockout e le loro piccole dimensioni, che consentono dosi minime di farmaci necessari per la valutazione in vivo , un modello sperimentale ben consolidato nei topi è preferito per la ricerca AP. Inoltre, il SAP indotto attraverso il taurocolato di sodio (TC) è attualmente uno dei modelli più utilizzati e meglio caratterizzati. Questo modello è stato studiato per nuove terapie e possibili eventi molecolari durante il processo di AP. Qui, presentiamo la generazione di un modello di topo AP utilizzando taurocolato di sodio e una semplice microsiringa fatta in casa. Inoltre, forniamo anche la metodologia per i successivi test istologici e sierologici.

Introduzione

La pancreatite acuta (AP) è un'infiammazione acuta del pancreas caratterizzata da ostruzione del dotto pancreatico principale con successiva distensione duttale e autodigestione del pancreas da parte dei suoi enzimi anormalmente attivati. Le sue manifestazioni cliniche includono infiammazione locale o sistemica, dolore addominale e aumento dell'amilasi ^sierica1,2. Secondo la classificazione di ^gravità3, l'AP può presentarsi in forme lievi, moderate e gravi e, tra queste, la pancreatite acuta grave (SAP) è la condizione più preoccupante a causa del suo alto tasso di mortalità superiore al 30%⁴. Negli Stati Uniti, l'AP è uno dei motivi più comuni per il ricovero in ospedale, che colpisce oltre 200.000 ^pazienti5. Inoltre, AP, in particolare SAP, aumenta ogni anno e colpisce le fasce di età più ^giovani6. Tuttavia, vi è una mancanza di opzioni di trattamento efficaci nella pratica clinica ^attuale6,7. Pertanto, è necessario esplorare i meccanismi molecolari coinvolti nell'AP, facilitando così il miglioramento del trattamento.

Modelli animali sperimentali consolidati sono necessari per studiare i meccanismi coinvolti nell'AP e valutare l'efficacia delle diverse modalità di trattamento. Con la facile accessibilità dei ceppi transgenici e knockout e le loro piccole dimensioni, che riducono al minimo le dosi di farmaci necessarie per la valutazione in vivo, i topi sono preferiti per la ricerca AP. Pertanto, diversi modelli di AP sono stati sviluppati nei ^topi8,9.

Lavorando da un modello di ratto di pancreatite lieve indotto attraverso la somministrazione endovenosa di ^caeruleina10, Niederau et al. hanno sviluppato un modello murino SAP presentato con necrosi a cellule acinari indotta utilizzando lo stesso farmaco e via di ^iniezione11. Sebbene questo modello possieda diversi vantaggi, tra cui non invasività, induzione rapida, ampia riproducibilità e applicabilità, il principale svantaggio è che nella maggior parte dei casi viene sviluppata solo una forma lieve di AP, limitando così la sua rilevanza clinica. L'alcol è considerato uno dei principali fattori eziologici di AP; tuttavia, Foitzik et al. hanno riferito che provoca lesioni pancreatiche solo se combinato con altri fattori, come l'iperstimolazione esocrina12. Inoltre, sebbene siano stati riportati modelli ap indotti da alcol sviluppati attraverso diverse vie di somministrazione e dosi di farmaci13,14,15, il loro principale svantaggio è la difficoltà a riprodurli. La somministrazione intraperitoneale di L-arginina può anche indurre AP nei ^topi16; tuttavia, la sua bassa rilevanza clinica ne ostacola l'applicazione. Il taurocolato, un sale biliare, è stato proposto per la prima volta da Creutzfeld et al. nel 1965 per indurre una condizione simile all'AP umano tramite infusione del dotto ^{pancreatico17}. Sebbene esistano controversie sulla sua rilevanza clinica in fisiopatologia18,19, la pancreatite indotta da taurocolato rimane un modello indispensabile per SAP.

Poiché questo modello è semplice da realizzare ed è efficace anche nei topi, è ora uno dei modelli AP più utilizzati per gli studi in vivo sui piccoli animali. Perides et al. hanno impiegato taurocolato di sodio (TC) per indurre SAP nei ^topi20, fornendo approfondimenti per comprendere la sua patologia. Combinato con tecniche di modificazione genetica, questo modello ci ha permesso di confermare diversi geni specifici coinvolti nell'AP. Ad esempio, Bicozo et al. hanno dimostrato che un knockout del gene CD38 proteggeva contro un modello di pancreatite da infusione TC e attribuiva i meccanismi alle alterazioni nella segnalazione intracellulare di ^Ca2+21. Fanczal et al. hanno studiato l'implicazione fisiologica dell'espressione di TRPM2 nella membrana plasmatica delle cellule acinari e duttali pancreatiche di topo e hanno dimostrato una ridotta gravità del SAP indotto da TC nei topi knockout ^TRPM222. Inoltre, questo modello fornisce anche un modo semplice ed efficace per testare molti nuovi farmaci in vivo. Ad esempio, questo metodo ha permesso la convalida degli effetti terapeutici della ^caffeina23, dell'acido deidrocolico24 e di vari antiossidanti e anticoagulanti25,26. Questa evidenza dimostra la versatilità del modello SAP indotto da TC. Sebbene Wittel et al. abbiano descritto un modello murino ^simile27, la mancanza di dettagli sulle procedure di implementazione potrebbe comportare l'incapacità di riprodurre i risultati. In questo articolo, ci concentriamo sui metodi che utilizzano una semplice microsiringa fatta in casa e studiamo il SAP indotto da TC, fornendo così una possibile guida non solo per ulteriori studi sulla patogenesi e il trattamento dell'AP, ma anche per un metodo sperimentale perfettamente adattabile per molte altre sostanze.

Protocollo

Tutti gli esperimenti che coinvolgono animali sono stati approvati dal Comitato etico animale della Soochow University. Tutte le procedure chirurgiche sono state eseguite in anestesia completa. Gli analgesici non sono stati usati per evitare interferenze con il decorso naturale della malattia secondo le letterature ^{precedenti28,29}. L'approvazione per la mancanza di analgesia è stata concessa anche dal Comitato etico animale dell'Università di Soochow.

1. Preparazione

1. Veloce un topo wild-type C57BL/6 8-12 ore prima dell'intervento.
2. Preparare una soluzione di TC al 5% (p/v) (93 mM) diluita in cloruro di sodio allo 0,9%. Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 μm.
3. Autoclave degli strumenti e dei materiali chirurgici, tra cui pinze, forbici, supporto per lame, portaago, clip emostatica, morsetti vascolari e teli sterili, utilizzando uno sterilizzatore a pressione ad una temperatura di 121 °C per 30 min.
4. Preparare una microsiringa fatta in casa. Per fare ciò, installare manualmente una punta per insulina monouso e una punta per pipetta di plastica prolungata su una siringa Microliter a punta piatta da 25 μL. Sterilizzare attraverso l'irradiazione.

2. Anestesia e preparazione preoperatoria

1. Pesare topi maschi C57BL/6 wild-type di età compresa tra 6 e 8 settimane (circa 21-23 g). Indurre l'anestesia generale con un'iniezione intraperitoneale di soluzione di pentobarbital sodico all'1% alla dose di 50 mg/kg.
2. Fissare il mouse in posizione supina su una piastra piana di schiuma irradiata con il nastro.
3. Preparare la regione operativa di ciascun animale rimuovendo la sua pelliccia con una crema di depilazione dal livello del processo xifoide fino alla linea di collegamento della colonna iliaca superiore anteriore bilaterale, con i lati sinistro e destro paralleli alla linea ascellare anteriore.
4. Preparare un campo chirurgico sterile con particolare attenzione all'area chirurgica, costituita dall'area preparata sull'animale e dalla parte anteriore del chirurgo.
   1. Disinfettare il piano di lavoro.
   2. Pulire il sito di incisione con più applicazioni di soluzione di scrub chirurgico. Pulire la pelle due o tre volte con lo 0,5% di iodoforo e lasciarla asciugare per 1-2 minuti ogni volta.
   3. Coprire il mouse con tende sterili.

3. Procedura chirurgica

NOTA: La Figura 1 illustra l'anatomia e la morfologia del pancreas del topo prima e dopo l'iniezione retrograda di TC nel dotto biliopancreatico mediante microiniezione.

1. Fai un'incisione addominale mediana lunga circa 2-3 cm.
2. Individuare il duodeno da sinistra a destra lungo lo stomaco. Estrarre delicatamente il duodeno e sul lato sinistro usando una pinza chirurgica e un batuffolo di cotone imbevuto di disinfettante per esporre il pancreas, il dotto biliopancreatico e la papilla duodenale. Fare attenzione a non ferire la parete intestinale o i vasi correlati.
3. Utilizzare 8-0 suture per passare attraverso la connessione tra il duodeno e il pancreas intorno alla papilla e tirarli sul lato sinistro del corpo del topo per fissare il duodeno.
4. Tirare delicatamente la pelle e il bordo inferiore del fegato da parte. Bloccare il dotto epatico comune, assicurandosi di non bloccare la vena porta o il pancreas. Bloccare il dotto biliopancreatico prossimale.
5. Perforare retrogradamente il microiniettore nel dotto biliopancreatico distale. Fissare la punta dell'ago vicino alla papilla duodenale con un morsetto. Infondere 10 μL del 5% di TC nel dotto pancreatico ad una velocità di 5 μL/min.
6. Tenere chiuso il dotto biliopancreatico per 5 minuti per ottenere una pressione stabile. Quindi, estrarre il microiniettore e rimuovere i morsetti.
7. Ripristinare il duodeno nella posizione anatomica originale e controllare il sanguinamento.
8. Chiudere la ferita con 6-0 punti di sutura e disinfettare con lo 0,5% di iodoforo.

4. Recupero e gestione postoperatoria

1. Recuperare gli animali dall'anestesia su un cuscinetto termico a 37 °C. Non inviare gli animali operati nella stanza temporale postoperatoria fino a quando tutti gli animali non si sono svegliati.
2. Somministrare 0,8 ml di soluzione salina allo 0,9% per via sottocutanea e lentamente per l'integrazione di liquidi.
3. Monitorare gli animali postoperatoriamente per le loro condizioni generali e segni di infezioni o malattie.

5. Test sierologici e valutazione istologica

1. A 24 ore dopo l'operazione, anestetizzare i topi con pentobarbital sodico usando la stessa dose e via di iniezione.
2. Raccogliere tutto il sangue dall'aorta addominale (circa 0,8 ml per topo) e ruotare a 1.500 x g per 15 minuti per isolare il siero per ulteriori test.
3. Raccogliere i tessuti del pancreas.
4. Aprire la cavità toracica per raccogliere i tessuti polmonari.
5. Misurare gli indici di funzione biochimica del siero, tra cui amilasi, lipasi, funzionalità epatica (alanina transaminasi (ALT) e aspartato transaminasi (AST)) e funzionalità renale (urea e creatina), utilizzando kit commerciali secondo le istruzioni dei produttori.
6. Omogeneizzare i tessuti polmonari e pancreatici e misurare il livello di mieloperossidasi (MPO) utilizzando un kit commerciale secondo le istruzioni del produttore.
7. Aprire la cavità toracica e perfondere con 20 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) due volte, quindi raccogliere il pancreas. Immergere in soluzione di paraformaldeide al 4% per 24 ore. Disidratare in una serie di concentrazioni di alcol e incorporare nella paraffina.
8. Utilizzare un microtomo per preparare sezioni di tessuto pancreatico spesse 5 μm.
9. Eseguire la colorazione H & E per la valutazione istologica del pancreas.
10. Valutare i punteggi patologici secondo i criteri proposti da Schmidt et ^al.30.

Risultati

Seguendo attentamente le istruzioni di cui sopra, abbiamo ottenuto una durata media dell'intervento di circa 40 minuti. I topi erano leggermente inattivi e avevano perso circa 0,5-1,75 g, 0,85-1,85 g e 0,5-4,73 g di peso rispettivamente a 24 ore, 48 ore e 72 ore dopo l'operazione (Figura 2).

Dal momento del completamento dell'intervento chirurgico a 24 ore dopo l'operazione, quando la malattia si è sviluppata, i topi sono diventati inattivi e hanno mostrato rispo...

Discussione

Il modello SAP indotto da TC è un eccellente strumento di ricerca. Come mostrato in questo studio, questo modello è molto facilmente realizzabile nei laboratori generali senza utilizzare dispositivi specifici. Se utilizzato in combinazione con l'istologia e l'analisi biochimica, fornisce un approccio basato sui costi (reagenti economici) e sul risparmio di tempo (finestra temporale di 24 ore) per indurre e valutare AP. La regolazione della concentrazione di TC offre anche la possibilità di produrre AP lieve e moderato...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% iodophor	Shanghai Likang Disinfectant	310102	4 mL/mouse
0.9% sodium chloride	Sinopharm Group Co., Ltd.	10019318	0.8 mL/mouse
1% Pentobarbital sodium	Sigma	P3761	0.2 -0.25 mL/mouse
25 μL flat tip Microliter syringe	Gaoge, Shanghai	A124019
4% Paraformaldehyde	Beyotime, Nantong, China	P0099-500ml
5% sodium taurocholate (TC)	Aladdin	S100834-5g	10 μL/SAP mouse
6-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (1/2 circle)	Cheng-He	20093
75% alcohol	Sinopharm Group Co., Ltd.	10009218	4 mL/mouse
8-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (3/8 circle)	Cheng-He	19064
ALT Activity Assay Kit	EPNK, Anhui, China	ALT0012
Amylase Assay Kit	EPNK, Anhui, China	AMY0012
Angled small bulldog clamp with 12 mm jaw (3 cm)	Cheng-He	HC-X022
aspen shavings or shreds for mouse bedding	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology	VR03015
AST Activity Assay Kit	EPNK, Anhui, China	AST0012
Blood Urea Nitrogen (BUN) Assay Kit	EPNK, Anhui, China	BUN0011
C57BL/6 mouse	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology	213
Creatine Assay Kit	EPNK, Anhui, China	CRE0012
Feature microtome blade	Beyotime, Nantong, China	E0994
Hemostatic Forceps (9.5 cm, Curved)	JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd.	JC3901
Lipase Assay Kit	Jiancheng, Nanjing, China	A054-2-1
Microtome	Leica biosystem, Germany	RM2245
Mindray biochemistry analyzer	Mindray, Shenzhen, China	BS-420
MPO Assay Kit	Jiancheng, Nanjing, China	A044-1-1
Normal mouse chow	Trophic, Nantong, China	LAD 1000
Phosphate buffered saline	Beyotime, Nantong, China	C0221A
Straight micro-bulldog clamp with 5 mm jaw (1.5 cm)	JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd.	W40130
Straight or curved forceps (11.0 cm)	Cheng-He	HC-X091A or HC-X090A
Straight Scissors (10.0 cm)	Cheng-He, Ningbo, China	HC-J039102
Thermo Scientific Centrifuge	Thermo Scientific, USA	Multifuge X1R