בידוד תאי שריר חלק לבביים וכלי דם מדגי זברה בוגרים, צעירים, זחליים ועובריים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר בידוד חריף של תאי שריר לב וכלי דם חלקים בני קיימא מדגי זברה בוגרים, צעירים, זחליים ועובריים (Danio rerio), המתאימים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים.

Abstract

דגי זברה משמשים זה זמן רב כאורגניזם מודל של בעלי חוליות בחקר הלב וכלי הדם. הקשיים הטכניים של בידוד תאים בודדים מרקמות הלב וכלי הדם של דגי הזברה מגבילים בחקר התכונות האלקטרופיזיולוגיות שלהם. שיטות קודמות תוארו עבור דיסקציה של לבבות דגי זברה ובידוד של מיוציטים לבביים חדריים. עם זאת, הבידוד של דגי זברה פרוזדורים ומיוציטים וסקולריים לאפיון אלקטרופיזיולוגי לא היה מפורט. עבודה זו מתארת פרוטוקולים אנזימטיים חדשים ומותאמים המספקים באופן שגרתי קרדיומיוציטים חדריים ופרוזדורים מבודדים של דגי זברה צעירים ובוגרים, כמו גם תאי שריר חלק וסקולרי (VSM) מהעורק הבולבוסי, המתאימים לניסויים של מהדק טלאי. לא נמצאו עדויות ספרותיות למחקרים אלקטרופיזיולוגיים על רקמות לב וכלי דם של דגי זברה שבודדו בשלבי התפתחות עובריים וזחליים. הודגמו טכניקות דיסוציאציה חלקיות המאפשרות ניסויים של מהדקי טלאים על תאים בודדים מלב זחלים ועובריים.

Introduction

דגי זברה הם דגי טלוסט קטנים המשמשים זה מכבר כאורגניזם מודל של בעלי חוליות¹ ולאחרונה עלו לגדולה כמערכת בעלי חוליות בת קיימא לסינון תפוקה גבוהה של גנים ותרופות ^2,3. עם זאת, ניתוח פיזיולוגי של רקמות דג זברה אינו מפותח היטב. במערכת הלב וכלי הדם תוארו שיטות לכריתה של לבבות דגי זברה⁴ ובידוד של מיוציטים לבביים חדריים ^5,6,7. ישנם מעט תיאורים מפורטים של בידוד יעיל של מיוציטים פרוזדורים ואין דיווחים על תכשירים של שריר חלק וסקולרי (VSM) למחקרי מהדק טלאי.

העבודה הנוכחית מתארת מתודולוגיה לבידוד של מיוציטים לבביים וכלי דם של דגי זברה, בת קיימא למחקרים אלקטרופיזיולוגיים ותפקודיים. גישה זו כוללת שינויים בפרוטוקולים שדווחו בעבר לבידוד מיוציטים חדריים של דגי זברה ^5,6 ומתאימה שיטות מבידודים של תאי VSM של יונקים⁸, מה שמאפשר בידוד של תאי שריר חלק של כלי דם של דגי זברה מה-bulbous arteriosus (BA). הפרוטוקולים מביאים לתפוקות יעילות של תאי פרוזדורים, חדרים ו-VSM מבודדים מדגי זברה, שניתן להשתמש בהם באופן אמין במחקרי מהדק טלאים עד 8 שעות⁹.

למרות הזחלים הכמעט שקופים שלהם המתפתחים לחלוטין מחוץ לאורגניזם ההורי, חקר הפוטנציאל האונטוגנטי המובטח שלהם בחקר התפתחות הלב וכלי הדם הוגבל על ידי אתגרים בחילוץ וניתוח רקמות בגיל צעיר. המאמר הנוכחי נותן מענה למגבלה זו על ידי הדגמת ניסויי הידוק טלאים על לבבות דגי זברה שבודדו כבר 3 ימים לאחר ההפריה (dpf), באמצעות שיטת מיצוי^{מותאמת שפורסמה 10}.

Protocol

כל דגי הזברה (זן בר מסוג AB, זכר ונקבה כאחד) גודלו, תוחזקו וטופלו לניסויים בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת וושינגטון (IACUC).

1. בידוד של אטריום, חדר, ו bulbous arteriosus מן דגי זברה בוגרים, צעירים, זחל

1. להרדים דגים באמצעות הלם קר, כלומר, על ידי טבילה במים 4 מעלות צלזיוס, במשך ~ 10 שניות.
2. באמצעות מלקחיים מעוקלים, מעבירים את הדגים לתוך צלחת פטרי גדולה מלאה חלקית ב-Perfusion Buffer (PB) (טבלה 1) ומניחים מתחת למיקרוסקופ מנתח.
   1. לערוף את הדג רק אחורית לעיניים, באמצעות זוג מספריים.
3. באמצעות מלקחיים מעוקלים (מלקחיים עדינים לדגי זחל), החזיקו את הדג ביד הלא דומיננטית כאשר הצד הגחוני פונה להיקף הנתיחה. עם זוג המלקחיים העדינים השני (או Superfine עבור דגי זחל) ביד הדומיננטית, קרעו בעדינות את שרירי החזה והסנפירים כדי לחשוף את רקמות הלב וכלי הדם (CV) (אטריום, חדר, ובולבוס עורקי, BA) (איור 1).
4. מניחים את המלקחיים העדינים ביד הדומיננטית, מושכים בעדינות את ה-BA בקצה המצטלב של ה-BA ואבי העורקים הגחוני.
   הערה: ה- BA והלב ייצאו מחלל הגוף.
   1. מפרידים בזהירות את ה-BA מאבי העורקים על ידי צביטה של המלקחיים ואיתור קצה האטריום שאליו מתכנסים ענפים ורידיים מרובים (sinus venosus). בעזרת המלקחיים העדינים, 'מורטים' את קצה האטריום מהסינוס ונוס. זה מבודד את רקמות קורות החיים משאר הגוף (איור 1).

2. דיסוציאציה של קרדיומיוציטים מדגי זברה בוגרים, צעירים וזחליים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים

1. באמצעות המלקחיים העדינים, 'למרוט' את האטריום והחדר מתוך רקמת CV שבודדה בשלב הקודם.
   הערה: התהליך מאפשר ניתוח נקי של כל רקמה עם זיהום צולב מינימלי ומרגיש דומה למריטת פרי מעץ.
   1. בצע קרע עדין לתוך החדר באמצעות מלקחיים עדינים כדי לנקז דם עודף, אשר ניתן להבטיח כאשר רקמת הלב הופך צבע סלמון חיוור מאדום בוהק.
2. לאגד את האטריום והחדר המבודדים לצינורות צנטריפוגה נפרדים של 1.5 מ"ל המכילים חיץ פרפוזיה (PB; 1.5 מ"ל).
   הערה: כדי להבטיח דיסוציאציה מוצלחת של קרדיומיוציטים פרוזדורים של דגי זברה בוגרים (ACMs) וקרדיומיוציטים חדריים (VCMs), בדרך כלל יש צורך בארבעה אטריה ושלושה חדרים. במקרה של דגי זברה צעירים (28-90 יום), מספר זה מוכפל.
   1. במקרה של דגי זברה זחליים (14-28 ימים), לאסוף רקמה רבה ככל האפשר מ ~ 30 זחלים.
3. החלף את ה- PB בצינורות ב- 750 μL של חיץ עיכול (DB) (טבלה 1) כל אחד והנח את הצינורות על תרמושייקר ב- 37 °C ו- 800 סל"ד. אפשר עיכול של הרקמות עד שהם הופכים שקופים (~ 30 דקות עבור אטריה ו ~ 40 דקות עבור החדרים).
4. סיים את העיכול על ידי סיבוב עדין של הרקמות בצנטריפוגה קטנה (2,000 x גרם בטמפרטורת הסביבה) במשך 3-5 שניות והחלף את ה-DB הסופר-נאטנטי ב-750 μL של מאגר עצירה (SB) כל אחד (טבלה 1).
   הערה: שלב צנטריפוגה זה הוא אופציונלי לבידוד VCM.
5. לדגור את הרקמות הכדוריות ב- SB בטמפרטורת הסביבה במשך 15 דקות.
6. החלף בעדינות את ה- SB ב- 500-750 μL של PB כל אחד (בהתאם לצפיפות הרצויה של התאים הסופיים) וטריטורט את הרקמות (~ 30 פעמים) באמצעות פיפטה פסטר מלוטשת להבה כדי לפזר את התאים.
   הערה: הקרדיומיוציטים (CMs) מוכנים כעת למחקרים אלקטרופיזיולוגיים ומאוחסנים בטמפרטורת החדר עד 8 שעות.
7. לדגימה אחידה, פיפטו בעדינות את התאים למעלה ולמטה כמה פעמים כדי להחיה מחדש לפני הוספת טיפה מהם למחקרים מתאימים.

3. דיסוציאציה של תאי שריר חלק וסקולרי (VSM) מדגי זברה בוגרים וצעירים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים

1. מריטת בולבוס עורקי (BA) מרקמות CV באותה גישה כמו שלב 2.1 ואיגרת חמישה BAs בוגרים לתוך צינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל המכיל חיץ S1 (1.5 מ"ל) (טבלה 2). במקרה של דגי זברה צעירים, בריכה עשרה BAs, ועבור זחלים מעל שבועיים, בריכה 30-40 BAs.
   הערה: לא ניתן מבחינה מעשית לבודד תאי VSM מזחלי דגי זברה הצעירים משבועיים.
2. החלף את S1 ב- 400 μL של חיץ S2 (טבלה 2) ואפשר עיכול פפאין ( ראה טבלת חומרים) של ה- BAs על תרמושייקר ב- 37 °C ו- 800 סל"ד למשך ~ 20 דקות.
3. אפשרו ל-BAs המעכלים חלקית להתיישב למשך דקה אחת והחליפו את ה-S2 הסופר-נאטנטי ב-500 מיקרו-ליטר של חיץ S3 (טבלה 2) המכיל קולגן. לעכל את הרקמות על תרמושייקר ב-37°C וב-800 סל"ד למשך 3-5 דקות.
4. סיים את העיכול על ידי סיבוב עדין של הרקמות בצנטריפוגה קטנה (2,000 x גרם בטמפרטורת הסביבה) במשך 3-5 שניות והחלפת S3 סופר-נאטנט ב-500 μL של S1.
5. יש לטרפד בעדינות את הרקמות הכדוריות (~ 15 פעמים) כדי לפזר תאי VSM ולצלחת על כיסויי זכוכית בגודל המתאים.
   הערה: גודל הכיסוי נקבע על ידי גודל תא ההקלטה של מהדק התיקון, במקרה זה, נעשה שימוש ב- 5 x 5 מ"מ).
   1. יש לשמור את הכיסויים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי שהתאים יתחברו וישתמשו בהם תוך 6 שעות.

4. בידוד לבבות מדגי זברה עובריים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים

1. הוסיפו טריקיין (150 מ"ג/ליטר; 1 מ"ל לכל צלחת פטרי בגודל 100 מ"מ x 20 מ"מ) ל~300 עוברים (2-5 dpf), שנאספו מתנאי הדגירה שלהם (איור 2A).
   1. רכז את העוברים המורדמים על-ידי העברתם לצינור צנטריפוגה בגודל 5 מ"ל באמצעות פיפטה של העברה, תוך הסרת מדיה עודפת (E3) מצינור הצנטריפוגה (איור 2B).
2. שטפו את העוברים ב-3 מ"ל של חיץ פרפוזיה קר (PB) פעמיים והחזירו ל-2 מ"ל של PB (איור 2B).
3. באמצעות מנגנון בידוד הלב העוברי (איור 2C), משכו ~1 מ"ל של העוברים לתוך מחט המזרק ומיד גרשו אותם בחזרה לתוך הצינור. חזרו על התהליך הזה 30 פעמים, בקצב של 1 שניות לכל תנועת מזרק (איור 2C).
4. מעבירים את העוברים המקוטעים דרך מסננת תאים בקוטר 100 מיקרומטר הממוקמת במשפך ואוספים את הלבבות המסוננים בצינור צנטריפוגה נוסף של 5 מ"ל. שטפו את המזרק עם 1 מ"ל של PB ואספו את השטיפה הזו גם לתוך הצינור דרך המסננת (איור 2C).
5. מערבבים היטב ונפרדים לצינורות צנטריפוגה של 1.5 מ"ל, כאשר כל צינור מכיל 1 מ"ל של התכולה. צנטריפוגות כל הצינורות על מיני צנטריפוגה ספסל במשך 5 שניות (2,000 x גרם בטמפרטורת הסביבה) ולהשליך את supernatants.
6. בצע החייאה סדרתית של הכדורים בצינורות באמצעות 1 מ"ל של PB, כלומר, להשעות את הכדור בצינור אחד באמצעות 1 מ"ל של PB ולהשתמש כי החייאה PB כדי להשעות את הכדור בצינור הבא.
7. מקטרים בעדינות על הלבבות למעלה ולמטה פעמיים לפני שמוסיפים טיפה מהם למחקרים מתאימים.

5. מחקרי הידוק טלאים על תאים קרדיווסקולריים מבודדים

הערה: ניתן להשיג הקלטות של מהדקי טלאי מבפנים החוצה ותאים שלמים מהתאים המבודדים כפי שדווח בעבר עבור זרמי ערוץ_{K ATP} בקרדיווסקולטורה⁹ של דגי זברה.

1. עבור קרדיומיוציטים בוגרים וצעירים, הוסף את התאים המנותקים (משלב 2) ישירות לתא ההקלטה מההשעיה. עבור תאי VSM, הנח את מכסה המכסה המכיל את תאי ה- VSM המצופים (משלב 3) לתוך תא ההקלטה.
2. הוסיפו לבבות עובריים שלמים מבודדים (משלב 4) לתא מהתלייה, ובצעו הקלטות של מהדקי טלאים מהמיוציטים האפיקרדיאליים (איור 2D).

תוצאות

הפרוטוקולים הנ"ל מספקים באופן אמין ושגרתי מספיק מיוציטים לבביים וכלי דם באיכות עקבית מקובלת למחקרי מהדק טלאי כפי שדווח לאחרונה במחקרים מקיפים של תעלות אשלגן רגיש ל-ATP (_{K ATP}) בסוג בר ודגי זברה מוטנטיים קרדיווסקולטוריים⁹. עקבות מייצגים של הקלטות של פעילות ערוץ_{K ATP} כזו ?...

Discussion

שיטות קודמות לבידוד מיוציטים חדריים של דגי זברה^5,6, שמטרתן ליצור מיוציטים למחקרים תרבית או אלקטרופיזיולוגיים^, סיפקו תאים בעלי תפוקה נמוכה יותר וכללו שלבים ארוכים של צנטריפוגות מרובות שהשפיעו לרעה על איכות התאים ועל כדאיותם. הפרוטוקולים המתוארים כאן אמינים...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Centrifuge Tubes	Eppendorf	22364111
10 mL Syringe	Fisher Scientific	14-955-459
19 Guage Needle	BD	305187
2,3-Butanedione Monoxime (BDM)	Sigma-Aldrich	B0753
5 mL Centrifuge Tubes	Sigma-Aldrich	EP0030119479	For embryonic heart isolation
Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer	Molecular Devices		Used for action potential recordings
Benchtop Mini Centrifuge	Southern Labware	MLX-106
Blebbistatin	Sigma-Aldrich	203390
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C4901
Cell-Strainer Sieve	Cole-Parmer	EW-06336-71	100 μm sieve for embryonic heart isolation
Collagenase Type H	Sigma-Aldrich	C8051
Collagenase Type II	Worthington	LS004176
Collagenase Type IV	Worthington	LS004188
Curved Forceps	Fisher Scientific	16-100-110
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
EGTA	Sigma-Aldrich	324626
Elastase	Worthington	LS003118
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F2442
Fine Forceps	Dumont	Style #5	Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two)
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Insulin	Sigma-Aldrich	I2643
K2ATP	Sigma-Aldrich	A8937
Large Petri Dish	Sigma-Aldrich	P5981	For dissociation
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Micro-Hematocrit Capillary Tubes	Kimble Chase	41A2502	Soda lime glass for patch pipettes
Papain	Worthington	LS003118
Pasteur Pipettes	Fisher Scientific	13-678-6A
Petri Dish	Sigma-Aldrich	P5606	100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	806552
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Scissors	Fine Science Tools	14090-09	For adult and juvenile zebrafish decapitation
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
Super Fine Forceps	Dumont	Style #SF	For isolating larval CV tissues (Need two)
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Thermoshaker	ThermoFisher Scientific	13687711
Tricaine Methanesulfonate (MS222)			For anaesthetizing zebrafish larvae
Trypsin Inhibitor	Sigma-Aldrich	T6522