Isolement de cellules musculaires lisses cardiaques et vasculaires provenant de poissons-zèbres adultes, juvéniles, larvaires et embryonnaires pour des études électrophysiologiques

Résumé

Le présent protocole décrit l’isolement aigu de cellules musculaires lisses cardiaques et vasculaires viables provenant de poissons-zèbres adultes, juvéniles, larvaires et embryonnaires (Danio rerio), adaptés aux études électrophysiologiques.

Résumé

Le poisson zèbre a longtemps été utilisé comme organisme vertébré modèle dans la recherche cardiovasculaire. Les difficultés techniques liées à l’isolement de cellules individuelles à partir des tissus cardiovasculaires du poisson zèbre ont limité l’étude de leurs propriétés électrophysiologiques. Des méthodes antérieures ont été décrites pour la dissection de cœurs de poisson zèbre et l’isolement des myocytes cardiaques ventriculaires. Cependant, l’isolement des myocytes auriculaires et vasculaires du poisson zèbre pour la caractérisation électrophysiologique n’a pas été détaillé. Ce travail décrit des protocoles enzymatiques nouveaux et modifiés qui fournissent régulièrement des cardiomyocytes ventriculaires et auriculaires juvéniles et adultes juvéniles et adultes, ainsi que des cellules vasculaires du muscle lisse (VSM) de l’artériose bulbeuse, adaptées aux expériences de patch-clamp. Il n’y a eu aucune preuve littéraire d’études électrophysiologiques sur des tissus cardiovasculaires de poisson zèbre isolés aux stades embryonnaire et larvaire du développement. Des techniques de dissociation partielle qui permettent des expériences de patch-clamp sur des cellules individuelles de cœurs larvaires et embryonnaires sont démontrées.

Introduction

Le poisson zèbre est un petit poisson téléostéen qui a longtemps été utilisé comme organisme vertébré modèle¹ et qui a récemment pris de l’importance en tant que système vertébré viable pour le criblage à haut débit des gènes et des médicaments ^2,3. Cependant, l’analyse physiologique des tissus du poisson zèbre n’est pas bien développée. Dans le système cardiovasculaire, des méthodes ont été décrites pour la dissection des cœurs de poisson zèbre⁴ et l’isolement des myocytes cardiaques ventriculaires ^5,6,7. Il existe peu de descriptions détaillées de l’isolement efficace des myocytes auriculaires et aucun rapport de préparations de muscles lisses vasculaires (VSM) pour les études patch-clamp.

Les travaux actuels décrivent une méthodologie pour l’isolement des myocytes cardiaques et vasculaires du poisson zèbre, viable pour les études électrophysiologiques et fonctionnelles. Cette approche comprend des modifications des protocoles précédemment signalés pour l’isolement des myocytes ventriculaires du poisson zèbre ^5,6 et adapte les méthodes à partir des isolements de cellules VSM de mammifères^8, permettant l’isolement des cellules musculaires lisses vasculaires^du poisson zèbre de l’artériose bulbeuse (BA). Les protocoles permettent d’obtenir des rendements efficaces de cellules auriculaires, ventriculaires et VSM isolées provenant de poissons-zèbres qui peuvent être utilisées de manière fiable dans les études patch-clamp jusqu’à 8 h⁹.

Malgré leurs larves presque transparentes qui se développent entièrement en dehors de l’organisme parental, l’exploration de leur potentiel ontogénétique promis dans l’étude du développement cardiovasculaire a été limitée par les défis liés à l’extraction et à l’analyse des tissus à un jeune âge. Le présent article aborde cette limitation en démontrant des expériences de patch-clamp sur des cœurs de poissons-zèbres isolés dès 3 jours après la fécondation (dpf), en utilisant une méthode d’extraction adaptée^{et publiée 10}.

Protocole

Tous les poissons-zèbres (souche sauvage AB, mâle et femelle) ont été élevés, entretenus et manipulés pour les expériences conformément aux directives du Washington University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Isolement de l’oreillette, du ventricule et de l’artériel bulbeux du poisson-zèbre adulte, juvénile et larvaire

1. Euthanasier les poissons par choc froid, c’est-à-dire en les immergeant dans de l’eau à 4 °C, pendant ~10 s.
2. À l’aide d’une pince incurvée, transférer le poisson dans une grande boîte de Petri partiellement remplie de tampon de perfusion (PB) (tableau 1) et placer sous un microscope à dissection.
   1. Décapita le poisson juste en arrière des yeux, à l’aide d’une paire de ciseaux.
3. À l’aide de pinces incurvées (pinces fines pour les larves de poissons), tenez le poisson dans la main non dominante avec le côté ventral faisant face à la lunette de dissection. Avec la deuxième paire de pinces fines (ou superfines pour les larves de poissons) dans la main dominante, déchirez doucement les muscles pectoraux et les nageoires pour révéler les tissus cardiovasculaires (CV) (oreillette, ventricule et artérie bulbeuse, BA) (Figure 1).
4. En plaçant la pince fine dans la main dominante, tirez doucement le BA à l’extrémité intersectaire du BA et de l’aorte ventrale.
   REMARQUE: Le BA et le cœur sortiront de la cavité corporelle.
   1. Séparez soigneusement le BA de l’aorte en pinçant la pince et en localisant l’extrémité de l’oreillette dans laquelle convergent plusieurs branches veineuses (sinus veineux). À l’aide de la pince fine, « arracher » l’extrémité de l’oreillette du sinus veineux. Cela isole les tissus CV du reste du corps (Figure 1).

2. Dissociation des cardiomyocytes du poisson-zèbre adulte, juvénile et larvaire pour les études électrophysiologiques

1. À l’aide de la pince fine, « arracher » l’oreillette et le ventricule du tissu CV isolé à l’étape précédente.
   REMARQUE: Le processus permet une dissection propre de chaque tissu avec une contamination croisée minimale et ressemble à la cueillette de fruits d’un arbre.
   1. Faites une légère déchirure dans le ventricule à l’aide de fines pinces pour drainer l’excès de sang, ce qui peut être assuré lorsque le tissu cardiaque prend la couleur saumon pâle du rouge vif.
2. Regrouper l’oreillette et le ventricule isolés dans des tubes centrifugés séparés de 1,5 mL contenant un tampon de perfusion (PB; 1,5 mL).
   REMARQUE: Pour garantir une dissociation réussie des cardiomyocytes auriculaires (MCA) et des cardiomyocytes ventriculaires (VCM) adultes, quatre oreillettes et trois ventricules sont généralement nécessaires. Dans le cas du poisson-zèbre juvénile (28-90 jours), ce nombre est doublé.
   1. Dans le cas des larves de poisson-zèbre (14-28 jours), prélever autant de tissu que possible de ~30 larves.
3. Remplacez le PB dans les tubes par 750 μL de tampon de digestion (DB) (tableau 1) chacun et placez les tubes sur un thermoshaker à 37 °C et 800 tr/min. Laisser digérer les tissus jusqu’à ce qu’ils deviennent translucides (~30 min pour les oreillettes et ~40 min pour les ventricules).
4. Terminez la digestion en faisant tourner doucement les tissus dans une mini-centrifugeuse de paillasse (2 000 x g à température ambiante) pendant 3 à 5 s et remplacez le surnageant DB par 750 μL de tampon d’arrêt (SB) chacun (tableau 1).
   Remarque : Cette étape de centrifugation est facultative pour l’isolation VCM.
5. Incuber les tissus granulés dans le SB à température ambiante pendant 15 min.
6. Remplacez doucement le SB par 500-750 μL de PB chacun (selon la densité souhaitée des cellules finales) et triturez les tissus (~30 fois) à l’aide d’une pipette Pasteur polie à la flamme pour disperser les cellules.
   NOTE: Les cardiomyocytes (CM) sont maintenant prêts pour les études électrophysiologiques et stockés à température ambiante jusqu’à 8 heures.
7. Pour un échantillonnage uniforme, pipeter doucement les cellules de haut en bas plusieurs fois pour les remettre en suspension avant d’en ajouter une goutte pour les études correspondantes.

3. Dissociation des cellules des muscles lisses vasculaires (VSM) des poissons-zèbres adultes et juvéniles pour des études électrophysiologiques

1. Prélever l’artériel bulbeux (AB) des tissus CV en utilisant la même approche que l’étape 2.1 et regrouper cinq BA adultes dans un tube à centrifuger de 1,5 mL contenant un tampon S1 (1,5 mL) (tableau 2). Dans le cas des poissons-zèbres juvéniles, mettre en pool dix BA et, pour les larves âgées de plus de 2 semaines, 30 à 40 BA.
   REMARQUE: Il n’est pas pratiquement possible d’isoler les cellules VSM des larves de poisson zèbre de moins de 2 semaines.
2. Remplacer S1 par 400 μL de tampon S2 (tableau 2) et laisser la papaïne (voir le tableau des matières) digérer les BA sur un thermoshaker à 37 °C et 800 tr/min pendant ~20 min.
3. Laisser les BA partiellement digérés se déposer pendant 1 min et remplacer le surnageant S2 par 500 μL de tampon S3 (tableau 2) contenant de la collagénase. Digérer les tissus sur un thermoshaker à 37 °C et 800 rpm pendant 3-5 min.
4. Terminez la digestion en faisant tourner doucement les tissus dans une mini-centrifugeuse de paillasse (2 000 x g à température ambiante) pendant 3 à 5 s et en remplaçant le surnageant S3 par 500 μL de S1.
5. Triturer doucement les tissus granulés (~15 fois) pour disperser les cellules VSM et les plaquer sur des lamelles de verre de taille appropriée.
   NOTE: La taille de la lamelle de couverture est déterminée par la taille de la chambre d’enregistrement à pince de brassage, dans ce cas, 5 x 5 mm ont été utilisés).
   1. Gardez les lamelles de couverture à température ambiante pendant 30 minutes pour que les cellules puissent s’y fixer et les utiliser dans les 6 heures suivantes.

4. Isolement de cœurs de poissons-zèbres embryonnaires pour des études électrophysiologiques

1. Ajouter de la tricaïne (150 mg/L; 1 ml par boîte de Petri de 100 mm x 20 mm) à ~300 embryons (2-5 dpf), prélevés dans leurs conditions d’incubation (figure 2A).
   1. Concentrer les embryons anesthésiés en les transférant dans un tube centrifuge de 5 mL à l’aide d’une pipette de transfert, en retirant l’excès de milieu (E3) du tube centrifuge (figure 2B).
2. Laver les embryons avec 3 mL de tampon de perfusion (PB) à froid deux fois et les remettre en suspension dans 2 mL de PB (Figure 2B).
3. À l’aide de l’appareil d’isolement cardiaque embryonnaire (figure 2C), prélever ~1 mL des embryons dans l’aiguille de la seringue et les renvoyer immédiatement dans le tube. Répétez ce processus 30 fois, à raison de 1 s par mouvement de seringue (Figure 2C).
4. Passez les embryons fragmentés à travers un tamis à crépine cellulaire de 100 μm placé dans un entonnoir et recueillez les cœurs filtrés dans un autre tube à centrifuger de 5 mL. Rincer la seringue avec 1 mL de PB et recueillir ce rinçage dans le tube à travers le tamis (Figure 2C).
5. Bien mélanger et séparer dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL, chaque tube contenant 1 mL du contenu. Centrifuger tous les tubes sur une mini-centrifugeuse de paillasse pendant 5 s (2 000 x g à température ambiante) et jeter les surnageants.
6. Effectuer une remise en suspension en série des pastilles dans les tubes en utilisant 1 mL de PB, c’est-à-dire remettre la pastille en suspension dans un tube en utilisant 1 mL de PB et utiliser ce PB remis en suspension pour remettre la pastille en suspension dans le tube suivant.
7. Pipeter doucement les cœurs de haut en bas deux fois avant d’en ajouter une goutte pour les études correspondantes.

5. Études patch-clamp sur des cellules cardiovasculaires isolées

REMARQUE: Des enregistrements de patch-clamp à l’envers et à cellules entières à partir des cellules isolées peuvent être obtenus comme indiqué précédemment pour les courants du canal_{K ATP} dans la cardiovascularisation⁹ du poisson zèbre.

1. Pour les cardiomyocytes adultes et juvéniles, ajouter les cellules dissociées (à partir de l’étape 2) directement dans la chambre d’enregistrement de la suspension. Pour les cellules VSM, placez la lamelle de recouvrement contenant les cellules VSM plaquées (à partir de l’étape 3) dans la chambre d’enregistrement.
2. Ajouter des cœurs embryonnaires intacts isolés (à partir de l’étape 4) dans la chambre à partir de la suspension, et faire des enregistrements patch-clamp à partir des myocytes épicardiques (Figure 2D).

Résultats

Les protocoles ci-dessus fournissent de manière fiable et systématique suffisamment de myocytes cardiaques et vasculaires de qualité constante pouvant faire l’objet d’études patch-clamp, comme cela a été récemment rapporté dans des études approfondies sur les canaux potassiques sensibles à l’ATP (K_ATP) chez les poissons zèbres de type sauvage et mutants⁹. Des traces représentatives d’enregistrements de l’activité de ces canaux K_ATP à partir de cardiomy...

Discussion

Les méthodes antérieures d’isolement des myocytes ventriculaires du poisson zèbre^5,6, visant à générer des myocytes pour la culture ou des études électrophysiologiques^, fournissaient des cellules à faible rendement et impliquaient de longues étapes de centrifugations multiples qui nuisaient à la qualité et à la viabilité cellulaires. Les protocoles décrits ici sont fiables, couvrent chacun des tissus cardiovasculaires importants (ventricule, orei...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Centrifuge Tubes	Eppendorf	22364111
10 mL Syringe	Fisher Scientific	14-955-459
19 Guage Needle	BD	305187
2,3-Butanedione Monoxime (BDM)	Sigma-Aldrich	B0753
5 mL Centrifuge Tubes	Sigma-Aldrich	EP0030119479	For embryonic heart isolation
Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer	Molecular Devices		Used for action potential recordings
Benchtop Mini Centrifuge	Southern Labware	MLX-106
Blebbistatin	Sigma-Aldrich	203390
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C4901
Cell-Strainer Sieve	Cole-Parmer	EW-06336-71	100 μm sieve for embryonic heart isolation
Collagenase Type H	Sigma-Aldrich	C8051
Collagenase Type II	Worthington	LS004176
Collagenase Type IV	Worthington	LS004188
Curved Forceps	Fisher Scientific	16-100-110
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
EGTA	Sigma-Aldrich	324626
Elastase	Worthington	LS003118
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F2442
Fine Forceps	Dumont	Style #5	Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two)
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Insulin	Sigma-Aldrich	I2643
K2ATP	Sigma-Aldrich	A8937
Large Petri Dish	Sigma-Aldrich	P5981	For dissociation
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Micro-Hematocrit Capillary Tubes	Kimble Chase	41A2502	Soda lime glass for patch pipettes
Papain	Worthington	LS003118
Pasteur Pipettes	Fisher Scientific	13-678-6A
Petri Dish	Sigma-Aldrich	P5606	100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	806552
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Scissors	Fine Science Tools	14090-09	For adult and juvenile zebrafish decapitation
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
Super Fine Forceps	Dumont	Style #SF	For isolating larval CV tissues (Need two)
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Thermoshaker	ThermoFisher Scientific	13687711
Tricaine Methanesulfonate (MS222)			For anaesthetizing zebrafish larvae
Trypsin Inhibitor	Sigma-Aldrich	T6522