Выделение сердечных и сосудистых гладкомышечных клеток из взрослых, ювенильных, личиночных и эмбриональных рыбок данио для электрофизиологических исследований

Резюме

Настоящий протокол описывает острую изоляцию жизнеспособных сердечных и сосудистых гладкомышечных клеток от взрослых, ювенильных, личиночных и эмбриональных рыбок данио (Danio rerio), пригодных для электрофизиологических исследований.

Аннотация

Рыбки данио уже давно используются в качестве модели организма позвоночных в сердечно-сосудистых исследованиях. Технические трудности выделения отдельных клеток из сердечно-сосудистых тканей рыбок данио ограничивают изучение их электрофизиологических свойств. Предыдущие методы были описаны для рассечения сердца рыбок данио и выделения желудочковых сердечных миоцитов. Однако выделение предсердных и сосудистых миоцитов рыбок данио для электрофизиологической характеристики не было подробно описано. В этой работе описываются новые и модифицированные ферментативные протоколы, которые обычно обеспечивают изолированные ювенильные и взрослые желудочковые и предсердные кардиомиоциты рыбок данио, а также сосудистые гладкомышечные клетки (VSM) из луковичного артериоза, подходящие для экспериментов с зажимом пластырей. Литературных свидетельств электрофизиологических исследований сердечно-сосудистых тканей рыбок данио, выделенных на эмбриональной и личиночной стадиях развития, не имеется. Продемонстрированы методы частичной диссоциации, позволяющие проводить эксперименты с зажимом пластыря на отдельных клетках личиночного и эмбрионального сердец.

Введение

Рыбки данио - это небольшие телеостные рыбы, которые долгое время использовались в качестве модельного организма позвоночных¹ и недавно приобрели известность как жизнеспособная система позвоночных для высокопроизводительного скрининга генов и лекарств ^2,3. Однако физиологический анализ тканей рыбок данио развит недостаточно. В сердечно-сосудистой системе описаны методы рассечения сердца рыбок данио⁴ и выделения желудочковых сердечных миоцитов ^5,6,7. Существует несколько подробных описаний эффективного выделения предсердных миоцитов и нет сообщений о препаратах гладкой мускулатуры сосудов (VSM) для исследований зажимов.

В настоящей работе описана методология выделения сердечных и сосудистых миоцитов рыбок данио, жизнеспособных для электрофизиологических и функциональных исследований. Этот подход включает модификации ранее сообщенных протоколов выделения желудочковых миоцитов рыбок данио ^5,6 и адаптирует методы из изоляции клеток VSM млекопитающих⁸, что позволяет выделять сосудистые гладкомышечные клетки рыбок данио из луковичного артериоза (БА). Протоколы приводят к эффективному выходу изолированных предсердных, желудочковых и VSM клеток рыбок данио, которые могут быть надежно использованы в исследованиях зажимов в течение 8 ч⁹.

Несмотря на их почти прозрачные личинки, которые развиваются полностью вне родительского организма, изучение их обещанного онтогенетического потенциала в изучении сердечно-сосудистого развития было ограничено проблемами в извлечении и анализе тканей в молодом возрасте. В настоящей статье рассматривается это ограничение путем демонстрации экспериментов с зажимом патча на сердцах рыбок данио, изолированных уже через 3 дня после оплодотворения (dpf), с использованием адаптированного, опубликованного метода экстракции¹⁰.

протокол

Все рыбки данио (штамм дикого типа AB, как мужской, так и женский) были выращены, поддержаны и обработаны для экспериментов в соответствии с руководящими принципами Комитета по уходу и использованию животных Вашингтонского университета (IACUC).

1. Выделение предсердий, желудочков и луковичных артериозов от взрослых, молодых и личиночных рыбок данио

1. Усыпляйте рыбу с помощью холодного шока, т.е. погружаясь в воду с температурой 4 °C, на ~10 с.
2. Используя изогнутые щипцы, переложите рыбу в большую чашку Петри, частично заполненную перфузионным буфером (ПБ) (таблица 1) и поместите под рассекающий микроскоп.
   1. Обезглавить рыбу только сзади от глаз, используя ножницы.
3. Используя изогнутые щипцы (тонкие щипцы для личинок рыб), держите рыбу в недоминирующей руке вентральной стороной, обращенной к рассечению. Со второй парой тонких щипцов (или сверхтонких для личинок рыб) в доминирующей руке осторожно разорвите грудные мышцы и плавники, чтобы выявить сердечно-сосудистые (CV) ткани (предсердие, желудочек и луковичный артериоз, BA) (Рисунок 1).
4. Поместив тонкие щипцы в доминирующую руку, осторожно потяните БА на пересекающемся кончике БА и вентральной аорты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: БА и сердце выйдут из полости тела.
   1. Осторожно отделите БА от аорты, защемляя щипцы и располагая кончик предсердий, в который сходятся несколько венозных ветвей (синусовый венозус). Используя тонкие щипцы, «выщипните» кончик предсердия с синусового веноза. Это изолирует сердечно-сосудистые ткани от остальной части тела (рисунок 1).

2. Диссоциация кардиомиоцитов от взрослых, молодых и личинок рыбок данио для электрофизиологических исследований

1. Используя тонкие щипцы, «выщипните» предсердие и желудочек из сердечно-сосудистой ткани, выделенной на более ранней стадии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс позволяет проводить чистое рассечение каждой ткани с минимальным перекрестным загрязнением и ощущается сродни выщипыванию плодов с дерева.
   1. Сделайте нежный разрыв в желудочек, используя тонкие щипцы, чтобы слить лишнюю кровь, что может быть обеспечено, когда сердечная ткань станет бледно-лососевого цвета из ярко-красного.
2. Объедините изолированные предсердия и желудочек в отдельные центрифужные трубки объемом 1,5 мл, содержащие перфузионный буфер (ПБ; 1,5 мл).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы гарантировать успешную диссоциацию взрослых предсердных кардиомиоцитов (ACM) и желудочковых кардиомиоцитов (VCM), обычно необходимы четыре предсердия и три желудочка. В случае с молодью рыбок данио (28-90 дней) это число удваивается.
   1. В случае личинок рыбок данио (14-28 дней) соберите как можно больше ткани из ~30 личинок.
3. Замените ПБ в трубках на 750 мкл буфера пищеварения (DB) (таблица 1) каждая и поместите трубки на термообвал при 37 °C и 800 об/мин. Позвольте пищеварению тканей до тех пор, пока они не станут полупрозрачными (~ 30 мин для предсердий и ~40 мин для желудочков).
4. Завершите пищеварение, осторожно раскручивая ткани в настольной мини-центрифуге (2000 х г при температуре окружающей среды) в течение 3-5 с и замените надводный DB на 750 мкл стоп-буфера (SB) каждый (таблица 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап центрифугирования является дополнительным для изоляции VCM.
5. Инкубировать гранулированные ткани в СБ при температуре окружающей среды в течение 15 мин.
6. Осторожно замените SB на 500-750 мкл ПБ каждый (в зависимости от желаемой плотности конечных клеток) и тритурируйте ткани (~ 30 раз), используя огнеполированную пипетку Пастера для диспергирования клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кардиомиоциты (КМ) теперь готовы к электрофизиологическим исследованиям и хранятся при комнатной температуре до 8 ч.
7. Для равномерного отбора проб осторожно пипеткой клетки вверх и вниз пару раз, чтобы повторно суспендировать, прежде чем добавлять каплю их для соответствующих исследований.

3. Диссоциация клеток гладких мышц сосудов (VSM) от взрослых и молодых рыбок данио для электрофизиологических исследований

1. Выщипните луковичный артериоз (БА) из тканей CV, используя тот же подход, что и на этапе 2.1, и объедините пять взрослых БА в центрифужную трубку объемом 1,5 мл, содержащую буфер S1 (1,5 мл) (таблица 2). В случае молоди рыбок данио пул десять БА, а для личинок старше 2 недель - 30-40 БА.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Практически невозможно выделить клетки VSM из личинок рыбок данио моложе 2 недель.
2. Замените S1 на 400 мкл буфера S2 (таблица 2) и разрешите папаин (см. Таблицу материалов) переваривать БА на термообвале при 37 °C и 800 об/мин в течение ~20 мин.
3. Дайте частично переваренным БА отстояться в течение 1 мин и замените супернатант S2 500 мкл буфера S3 (таблица 2), содержащего коллагеназу. Переваривайте ткани на термошейкере при 37 °C и 800 об/мин в течение 3-5 мин.
4. Завершите пищеварение, осторожно раскрутив ткани в настольной мини-центрифуге (2000 х г при температуре окружающей среды) в течение 3-5 с и заменив супернатант S3 на 500 мкл S1.
5. Аккуратно протрите гранулированные ткани (~15 раз), чтобы диспергировать клетки VSM и пластину на стеклянные крышки соответствующего размера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Размер крышки определяется размером камеры записи патч-зажима, в данном случае использовалось 5 х 5 мм).
   1. Держите крышки при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы клетки прикрепились и использовали их в течение следующих 6 часов.

4. Выделение сердец от эмбриональных рыбок данио для электрофизиологических исследований

1. Добавьте трикаин (150 мг/л; 1 мл на чашку Петри 100 мм х 20 мм) к ~300 эмбрионам (2-5 dpf), собранным из условий их инкубации (рисунок 2A).
   1. Концентрируйте обезболенные эмбрионы, перенося их в центрифужную трубку объемом 5 мл с помощью трансферной пипетки, удаляя избыточную среду (E3) из трубки центрифуги (рисунок 2B).
2. Дважды промыть эмбрионы 3 мл холодового перфузионного буфера (ПБ) и повторно суспендировать в 2 мл ПБ (рисунок 2B).
3. Используя аппарат изоляции эмбрионального сердца (рисунок 2C), втяните ~ 1 мл эмбрионов в иглу шприца и немедленно выталкивайте их обратно в трубку. Повторите этот процесс 30 раз со скоростью 1 с на одно движение шприца (рисунок 2C).
4. Пропустите фрагментированные эмбрионы через сито клеточного ситечка размером 100 мкм, помещенное в воронку, и соберите отфильтрованные сердца в другую трубку центрифуги объемом 5 мл. Промойте шприц 1 мл ПБ и соберите этот промывку в трубку через сито (рисунок 2C).
5. Хорошо перемешайте и разделите на 1,5 мл центрифужные трубки, каждая из которых содержит 1 мл содержимого. Центрифугируйте все трубки на настольной мини-центрифуге в течение 5 с (2000 х г при температуре окружающей среды) и выбросьте супернатанты.
6. Проводят последовательную ресуспензию гранул в трубах с использованием 1 мл ПБ, т.е. повторно суспендируют гранулу в одной трубке с использованием 1 мл ПБ и используют этот повторно суспендированный ПБ для повторного суспендирования гранулы в следующей трубе.
7. Осторожно пипеткой сердца вверх и вниз два раза, прежде чем добавить каплю их для соответствующих исследований.

5. Патч-зажимные исследования изолированных сердечно-сосудистых клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Из изолированных клеток могут быть получены записи с вывернутыми и цельноклеточными зажимами, как сообщалось ранее для течений канала K_ATP в кардиоваскулатуре^рыбок данио 9.

1. Для взрослых и ювенильных кардиомиоцитов добавьте диссоциированные клетки (из шага 2) непосредственно в записывающую камеру из суспензии. Для ячеек VSM поместите крышку, содержащую покрытые ячейки VSM (из шага 3), в камеру записи.
2. Добавьте изолированные интактные эмбриональные сердца (с этапа 4) в камеру из суспензии и сделайте записи зажимов из эпикардиальных миоцитов (рисунок 2D).

Результаты

Вышеуказанные протоколы надежно и регулярно обеспечивают достаточное количество сердечных и сосудистых миоцитов постоянного качества, поддающихся исследованиям зажимов, о чем недавно сообщалось в обширных исследованиях АТФ-чувствительных калиевых (K_ATP) каналов в кардиовакуля?...

Обсуждение

Предыдущие методы выделения желудочковых миоцитов рыбок ^{данио 5,6}, направленные на генерацию миоцитов для культуральных или электрофизиологических исследований, обеспечивали клетки с более низким выходом и включали длительные этапы множественных центрифугаций, чт...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Centrifuge Tubes	Eppendorf	22364111
10 mL Syringe	Fisher Scientific	14-955-459
19 Guage Needle	BD	305187
2,3-Butanedione Monoxime (BDM)	Sigma-Aldrich	B0753
5 mL Centrifuge Tubes	Sigma-Aldrich	EP0030119479	For embryonic heart isolation
Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer	Molecular Devices		Used for action potential recordings
Benchtop Mini Centrifuge	Southern Labware	MLX-106
Blebbistatin	Sigma-Aldrich	203390
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C4901
Cell-Strainer Sieve	Cole-Parmer	EW-06336-71	100 μm sieve for embryonic heart isolation
Collagenase Type H	Sigma-Aldrich	C8051
Collagenase Type II	Worthington	LS004176
Collagenase Type IV	Worthington	LS004188
Curved Forceps	Fisher Scientific	16-100-110
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
EGTA	Sigma-Aldrich	324626
Elastase	Worthington	LS003118
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F2442
Fine Forceps	Dumont	Style #5	Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two)
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Insulin	Sigma-Aldrich	I2643
K2ATP	Sigma-Aldrich	A8937
Large Petri Dish	Sigma-Aldrich	P5981	For dissociation
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Micro-Hematocrit Capillary Tubes	Kimble Chase	41A2502	Soda lime glass for patch pipettes
Papain	Worthington	LS003118
Pasteur Pipettes	Fisher Scientific	13-678-6A
Petri Dish	Sigma-Aldrich	P5606	100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	806552
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Scissors	Fine Science Tools	14090-09	For adult and juvenile zebrafish decapitation
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
Super Fine Forceps	Dumont	Style #SF	For isolating larval CV tissues (Need two)
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Thermoshaker	ThermoFisher Scientific	13687711
Tricaine Methanesulfonate (MS222)			For anaesthetizing zebrafish larvae
Trypsin Inhibitor	Sigma-Aldrich	T6522