전기 생리 학적 연구를위한 성체, 청소년, 애벌레 및 배아 제브라 피쉬에서 심장 및 혈관 평활근 세포 분리

요약

본 프로토콜은 전기생리학적 연구에 적합한 성체, 청소년, 유충 및 배아 제브라피쉬(Danio rerio)로부터 생존가능한 심장 및 혈관 평활근 세포의 급성 단리를 기술한다.

초록

제브라피쉬는 오랫동안 심혈관 연구에서 모델 척추동물 유기체로 사용되어 왔습니다. 제브라 피쉬 심혈관 조직에서 개별 세포를 분리하는 기술적 어려움은 전기 생리 학적 특성을 연구하는 데 제한적이었습니다. 이전의 방법은 제브라 피쉬 심장의 해부와 심실 심장 근육 세포의 분리에 대해 설명되었습니다. 그러나, 전기 생리 학적 특성화를위한 제브라 피쉬 심방 및 혈관 근육 세포의 분리는 상세하지 않았다. 이 연구는 패치 클램프 실험에 적합한 구근 동맥의 혈관 평활근 (VSM) 세포뿐만 아니라 분리 된 청소년 및 성인 제브라 피쉬 심실 및 심방 심근 세포를 일상적으로 제공하는 새롭고 수정 된 효소 프로토콜을 설명합니다. 배아 및 애벌레 발달 단계에서 분리 된 제브라 피쉬 심혈관 조직에 대한 전기 생리 학적 연구에 대한 문헌적 증거는 없습니다. 유충 및 배아 심장의 개별 세포에 대한 패치 클램프 실험을 허용하는 부분 해리 기술이 시연됩니다.

서문

제브라피쉬는 오랫동안 모델 척추동물 유기체1로 사용되어 왔으며 최근에는 유전자 및 약물 ^2,3의 고처리량 스크리닝을 위한 실행 가능한 척추동물 시스템으로 두각을 나타내고 있는 작은 텔레오스트 물고기입니다. 그러나 제브라 피쉬 조직의 생리 학적 분석은 잘 발달되어 있지 않습니다. 심장 혈관계에서 제브라 피쉬 심장⁴의 해부와 심실 심장 근육 세포의 분리 ^5,6,7에 대한 방법이 설명되었습니다. 심방 근육 세포의 효과적인 분리에 대한 자세한 설명은 거의 없으며 패치 클램프 연구를위한 혈관 평활근 (VSM) 준비에 대한보고는 없습니다.

현재의 연구는 전기 생리 학적 및 기능적 연구에 적합한 제브라 피쉬 심장 및 혈관 근육 세포의 분리 방법론을 설명합니다. 이 접근법은 제브라피쉬 심실 근세포 분리 ^5,6<....

프로토콜

모든 제브라피쉬(야생형 균주 AB, 수컷과 암컷 모두)는 워싱턴 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 지침에 따라 실험을 위해 사육, 유지 및 처리되었습니다.

1. 성체, 청소년 및 유충 제브라 피쉬에서 심방, 심실 및 구근 동맥의 분리

1. 냉 충격, 즉 4°C의 물에 ~10초 동안 담가 물고기를 안락사시킵니다.
2. 구부러진 집게를 사용하여 생선을 관류 완충액(PB)(표 1)으로 부분적으로 채워진 큰 페트리 접시에 옮기고 해부 현미경 아래에 놓습니다.
   1. 가위를 사용하여 눈 바로 뒤쪽의 물고기를 참수하십시오.
3. 구부러진 집게 (애벌레 물고기를위한 미세한 집게)를 사용하여 복부 쪽이 해부 범위를 향하도록 비 지배적 인 손에 물고기를 잡습니다. 두 번째 미세한 집게(유충 물고기의 경우 극세)를 주로 손에 들고 가슴 근육과 지느러미를 부드럽게 찢어 심혈관 조직(심방, 심실 및 구근 동맥, BA)을 드러냅니다(그림 1).
4. 지배적 인 손에 미세한 집게를 놓고 BA와 복부 대동맥의 교차 끝에서 BA를 부드럽게 당깁니다.
   알림: ....

결과

상기 프로토콜은 야생형 및 돌연변이 제브라피쉬 심혈관구조에서 ATP 민감성 칼륨(K_ATP) 채널에 대한 광범위한 연구에서 최근에 보고된 바와 같이 패치 클램프 연구에 적합한 일관된 품질의 충분한 심장 및 혈관 근세포를 안정적이고 일상적으로 제공합니다⁹. 단리된 심근세포로부터의 이러한_{K ATP} 채널 활성의 기록의 대표적인 흔적이 도 3A-C

토론

배양 또는 전기 생리 학적 연구를 위해 근육 세포를 생성하는 것을 목표로하는 제브라 피쉬 심실 근육 세포 ^5,6을 분리하기위한 이전 방법은 낮은 수율의 세포를 제공하고 세포 품질 및 생존력에 악영향을 미치는 다중 원심 분리의 긴 단계를 포함했습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 신뢰할 수 있으며 중요한 심혈관 조직 (심실, 심방 및 VSM) 각각을 다루.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Centrifuge Tubes	Eppendorf	22364111
10 mL Syringe	Fisher Scientific	14-955-459
19 Guage Needle	BD	305187
2,3-Butanedione Monoxime (BDM)	Sigma-Aldrich	B0753
5 mL Centrifuge Tubes	Sigma-Aldrich	EP0030119479	For embryonic heart isolation
Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer	Molecular Devices		Used for action potential recordings
Benchtop Mini Centrifuge	Southern Labware	MLX-106
Blebbistatin	Sigma-Aldrich	203390
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C4901
Cell-Strainer Sieve	Cole-Parmer	EW-06336-71	100 μm sieve for embryonic heart isolation
Collagenase Type H	Sigma-Aldrich	C8051
Collagenase Type II	Worthington	LS004176
Collagenase Type IV	Worthington	LS004188
Curved Forceps	Fisher Scientific	16-100-110
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
EGTA	Sigma-Aldrich	324626
Elastase	Worthington	LS003118
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F2442
Fine Forceps	Dumont	Style #5	Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two)
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Insulin	Sigma-Aldrich	I2643
K2ATP	Sigma-Aldrich	A8937
Large Petri Dish	Sigma-Aldrich	P5981	For dissociation
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Micro-Hematocrit Capillary Tubes	Kimble Chase	41A2502	Soda lime glass for patch pipettes
Papain	Worthington	LS003118
Pasteur Pipettes	Fisher Scientific	13-678-6A
Petri Dish	Sigma-Aldrich	P5606	100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	806552
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Scissors	Fine Science Tools	14090-09	For adult and juvenile zebrafish decapitation
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
Super Fine Forceps	Dumont	Style #SF	For isolating larval CV tissues (Need two)
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Thermoshaker	ThermoFisher Scientific	13687711
Tricaine Methanesulfonate (MS222)			For anaesthetizing zebrafish larvae
Trypsin Inhibitor	Sigma-Aldrich	T6522