전기 생리 학적 연구를위한 성체, 청소년, 애벌레 및 배아 제브라 피쉬에서 심장 및 혈관 평활근 세포 분리

요약

본 프로토콜은 전기생리학적 연구에 적합한 성체, 청소년, 유충 및 배아 제브라피쉬(Danio rerio)로부터 생존가능한 심장 및 혈관 평활근 세포의 급성 단리를 기술한다.

초록

제브라피쉬는 오랫동안 심혈관 연구에서 모델 척추동물 유기체로 사용되어 왔습니다. 제브라 피쉬 심혈관 조직에서 개별 세포를 분리하는 기술적 어려움은 전기 생리 학적 특성을 연구하는 데 제한적이었습니다. 이전의 방법은 제브라 피쉬 심장의 해부와 심실 심장 근육 세포의 분리에 대해 설명되었습니다. 그러나, 전기 생리 학적 특성화를위한 제브라 피쉬 심방 및 혈관 근육 세포의 분리는 상세하지 않았다. 이 연구는 패치 클램프 실험에 적합한 구근 동맥의 혈관 평활근 (VSM) 세포뿐만 아니라 분리 된 청소년 및 성인 제브라 피쉬 심실 및 심방 심근 세포를 일상적으로 제공하는 새롭고 수정 된 효소 프로토콜을 설명합니다. 배아 및 애벌레 발달 단계에서 분리 된 제브라 피쉬 심혈관 조직에 대한 전기 생리 학적 연구에 대한 문헌적 증거는 없습니다. 유충 및 배아 심장의 개별 세포에 대한 패치 클램프 실험을 허용하는 부분 해리 기술이 시연됩니다.

서문

제브라피쉬는 오랫동안 모델 척추동물 유기체1로 사용되어 왔으며 최근에는 유전자 및 약물 ^2,3의 고처리량 스크리닝을 위한 실행 가능한 척추동물 시스템으로 두각을 나타내고 있는 작은 텔레오스트 물고기입니다. 그러나 제브라 피쉬 조직의 생리 학적 분석은 잘 발달되어 있지 않습니다. 심장 혈관계에서 제브라 피쉬 심장⁴의 해부와 심실 심장 근육 세포의 분리 ^5,6,7에 대한 방법이 설명되었습니다. 심방 근육 세포의 효과적인 분리에 대한 자세한 설명은 거의 없으며 패치 클램프 연구를위한 혈관 평활근 (VSM) 준비에 대한보고는 없습니다.

현재의 연구는 전기 생리 학적 및 기능적 연구에 적합한 제브라 피쉬 심장 및 혈관 근육 세포의 분리 방법론을 설명합니다. 이 접근법은 제브라피쉬 심실 근세포 분리 ^5,6에 대해 이전에 보고된 프로토콜의 수정을 포함하고 포유류 VSM 세포 분리⁸의 방법을 적용하여 구근 동맥(BA)에서 제브라피쉬 혈관 평활근 세포를 분리할 수 있습니다. 이 프로토콜은 최대 8 h⁹ 동안 패치 클램프 연구에 안정적으로 사용할 수있는 제브라 피쉬에서 분리 된 심방, 심실 및 VSM 세포의 효율적인 수율을 제공합니다.

부모 유기체 외부에서 완전히 발달하는 거의 투명한 유충에도 불구하고 심혈관 발달을 연구하는 데있어 약속 된 개체 유전 학적 잠재력을 탐구하는 것은 어린 나이에 조직을 추출하고 분석하는 데 어려움을 겪었습니다. 현재 기사는 적응되고 발표 된 추출 방법¹⁰을 사용하여 수정 후 3 일 (dpf)에 분리 된 제브라 피쉬 심장에 대한 패치 클램프 실험을 시연함으로써 이러한 한계를 해결합니다.

프로토콜

모든 제브라피쉬(야생형 균주 AB, 수컷과 암컷 모두)는 워싱턴 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 지침에 따라 실험을 위해 사육, 유지 및 처리되었습니다.

1. 성체, 청소년 및 유충 제브라 피쉬에서 심방, 심실 및 구근 동맥의 분리

1. 냉 충격, 즉 4°C의 물에 ~10초 동안 담가 물고기를 안락사시킵니다.
2. 구부러진 집게를 사용하여 생선을 관류 완충액(PB)(표 1)으로 부분적으로 채워진 큰 페트리 접시에 옮기고 해부 현미경 아래에 놓습니다.
   1. 가위를 사용하여 눈 바로 뒤쪽의 물고기를 참수하십시오.
3. 구부러진 집게 (애벌레 물고기를위한 미세한 집게)를 사용하여 복부 쪽이 해부 범위를 향하도록 비 지배적 인 손에 물고기를 잡습니다. 두 번째 미세한 집게(유충 물고기의 경우 극세)를 주로 손에 들고 가슴 근육과 지느러미를 부드럽게 찢어 심혈관 조직(심방, 심실 및 구근 동맥, BA)을 드러냅니다(그림 1).
4. 지배적 인 손에 미세한 집게를 놓고 BA와 복부 대동맥의 교차 끝에서 BA를 부드럽게 당깁니다.
   알림: BA와 심장은 체강에서 나옵니다.
   1. 집게를 꼬집고 여러 정맥 가지가 수렴하는 심방 끝 부분 (부비동 정맥)을 찾아 BA를 대동맥에서 조심스럽게 분리하십시오. 가는 집게를 사용하여 부비동 정맥에서 심방 끝을 '뽑아'냅니다. 이것은 CV 조직을 신체의 나머지 부분과 분리합니다 (그림 1).

2. 전기 생리 학적 연구를위한 성체, 청소년 및 유충 제브라 피쉬의 심근 세포 해리

1. 가는 집게를 사용하여 이전 단계에서 분리된 CV 조직에서 심방과 심실을 '뽑아냅니다'.
   알림: 이 과정을 통해 교차 오염을 최소화하면서 각 조직을 깨끗하게 해부할 수 있으며 나무에서 과일을 따는 것과 같은 느낌을 줍니다.
   1. 미세한 집게를 사용하여 심실을 부드럽게 찢어 과도한 혈액을 배출하면 심장 조직이 밝은 빨간색에서 옅은 연어 색으로 변할 때 보장 할 수 있습니다.
2. 분리된 아트리움과 심실을 관류 완충액(PB; 1.5mL)이 포함된 별도의 1.5mL 원심분리 튜브에 모읍니다.
   참고: 성인 제브라피쉬 심방 심근 세포(ACM)와 심실 심근 세포(VCM)의 성공적인 해리를 보장하려면 일반적으로 4개의 심방과 3개의 심실이 필요합니다. 청소년 제브라 피쉬 (28-90 일)의 경우이 숫자는 두 배가됩니다.
   1. 애벌레 제브라 피쉬 (14-28 일)의 경우 ~ 30 마리의 유충에서 가능한 한 많은 조직을 수집하십시오.
3. 튜브의 PB를 각각 750μL의 분해 완충액(DB)(표 1)으로 교체하고 튜브를 37°C 및 800rpm의 열쉐이커에 놓습니다. 조직이 반투명해질 때까지 소화를 허용합니다 (심방의 경우 ~ 30 분, 심실의 경우 ~ 40 분).
4. 벤치탑 미니 원심분리기(주변 온도에서 2,000 x g )에서 3-5초 동안 조직을 부드럽게 회전시켜 소화를 종료하고 상청액 DB를 각각 750μL의 정지 완충액(SB)으로 교체합니다(표 1).
   참고: 이 원심분리 단계는 VCM 절연의 경우 선택 사항입니다.
5. 펠렛 조직을 SB의 주변 온도에서 15분 동안 배양합니다.
6. SB를 각각 500-750μL의 PB로 부드럽게 교체하고(최종 세포의 원하는 밀도에 따라 다름) 화염 광택 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직을 분쇄하여(~30배) 세포를 분산시킵니다.
   참고: 심근세포(CM)는 이제 전기생리학적 연구를 위한 준비가 되었으며 실온에서 최대 8시간 동안 보관됩니다.
7. 균일한 샘플링을 위해 세포를 위아래로 부드럽게 몇 번 피펫팅하여 다시 부유시킨 후 해당 연구를 위해 한 방울 추가합니다.

3. 전기생리학적 연구를 위한 성체 및 청소년 제브라피쉬의 혈관 평활근(VSM) 세포 해리

1. 단계 2.1과 동일한 접근법을 사용하여 CV 조직에서 구근 동맥(BA)을 뽑고 5개의 성인 BA를 S1 완충액(1.5mL)이 포함된 1.5mL 원심분리 튜브에 풀링합니다(표 2). 어린 제브라 피쉬의 경우 10 개의 BA를 풀링하고 2 주 이상 된 유충의 경우 30-40 BA를 풀링합니다.
   참고 : 2 주 미만의 제브라 피쉬 유충에서 VSM 세포를 분리하는 것은 실질적으로 불가능합니다.
2. S1을 400μL의 S2 버퍼(표 2)로 교체하고 37°C 및 800rpm의 열쉐이커에서 ~20분 동안 BA의 파파인( 재료 표 참조) 분해를 허용합니다.
3. 부분적으로 소화된 BA를 1분 동안 가라앉히고 상청액 S2를 콜라게나제가 함유된 S3 완충액(표 2) 500μL로 교체합니다. 37°C 및 800rpm의 열쉐이커에서 3-5분 동안 조직을 소화합니다.
4. 벤치탑 미니 원심분리기(주변 온도에서 2,000 x g )에서 조직을 3-5초 동안 부드럽게 회전시키고 상청액 S3를 500μL의 S1로 교체하여 소화를 종료합니다.
5. 펠렛 조직을 부드럽게 분쇄하여(~15배) VSM 세포를 분산시키고 적절한 크기의 유리 커버슬립에 플레이트합니다.
   알림: 커버슬립 크기는 패치 클램프 기록 챔버의 크기에 따라 결정됩니다(이 경우 5 x 5mm가 사용됨).
   1. 커버슬립을 실온에서 30분 동안 보관하여 셀이 부착되어 다음 6시간 이내에 사용할 수 있도록 합니다.

4. 전기 생리 학적 연구를위한 배아 제브라 피쉬에서 심장 분리

1. 배양 조건에서 수집한 ~300개의 배아(2-5dpf)에 트리카인(150mg/L, 100mm x 20mm 페트리 접시당 1ml)을 추가합니다(그림 2A).
   1. 이송 피펫을 사용하여 마취된 배아를 5mL 원심분리 튜브로 옮겨 농축하고 원심분리 튜브에서 과도한 배지(E3)를 제거합니다(그림 2B).
2. 3mL의 저온 관류 완충액(PB)으로 배아를 두 번 세척하고 2mL의 PB에 재현탁합니다(그림 2B).
3. 배아 심장 격리 장치(그림 2C)를 사용하여 ~1mL의 배아를 주사기 바늘에 넣고 즉시 튜브로 다시 배출합니다. 주사기 동작당 1초의 속도로 이 과정을 30회 반복합니다(그림 2C).
4. 단편화된 배아를 깔때기에 놓인 100μm 세포 여과기 체를 통과시키고 여과된 심장을 다른 5mL 원심분리 튜브에 수집합니다. 1mL의 PB로 주사기를 헹구고 이 헹굼도 체를 통해 튜브에 모읍니다(그림 2C).
5. 잘 섞어 1.5mL 원심분리 튜브로 분리하고 각 튜브에 내용물 1mL가 들어 있습니다. 벤치탑 미니 원심분리기의 모든 튜브를 5초(주변 온도에서 2,000 x g ) 동안 원심분리하고 상층액을 폐기합니다.
6. 1mL의 PB를 사용하여 튜브에서 펠릿의 연속 재현탁을 수행, 즉 1mL의 PB를 사용하여 한 튜브에 펠릿을 재현탁하고 그 재현탁된 PB를 사용하여 다음 튜브에 펠릿을 재현탁합니다.
7. 해당 연구를 위해 하트를 한 방울 추가하기 전에 하트를 위아래로 부드럽게 두 번 피펫팅합니다.

5. 분리된 심혈관 세포에 대한 패치 클램프 연구

참고: 분리된 세포의 내부 외부 및 전체 세포 패치 클램프 기록은 제브라피쉬 심혈관계⁹의 K_ATP 채널 전류에 대해 이전에 보고된 대로 얻을 수 있습니다.

1. 성인 및 청소년 심근 세포의 경우, 해리 된 세포 (2 단계에서)를 현탁액에서 기록 챔버에 직접 추가하십시오. VSM 셀의 경우 도금된 VSM 셀(3단계)이 포함된 커버슬립을 기록 챔버에 넣습니다.
2. 분리된 온전한 배아 심장(4단계에서)을 현탁액에서 챔버에 추가하고 심외막 근세포에서 패치 클램프 기록을 만듭니다(그림 2D).

결과

상기 프로토콜은 야생형 및 돌연변이 제브라피쉬 심혈관구조에서 ATP 민감성 칼륨(K_ATP) 채널에 대한 광범위한 연구에서 최근에 보고된 바와 같이 패치 클램프 연구에 적합한 일관된 품질의 충분한 심장 및 혈관 근세포를 안정적이고 일상적으로 제공합니다⁹. 단리된 심근세포로부터의 이러한_{K ATP} 채널 활성의 기록의 대표적인 흔적이 도 3A-C

토론

배양 또는 전기 생리 학적 연구를 위해 근육 세포를 생성하는 것을 목표로하는 제브라 피쉬 심실 근육 세포 ^5,6을 분리하기위한 이전 방법은 낮은 수율의 세포를 제공하고 세포 품질 및 생존력에 악영향을 미치는 다중 원심 분리의 긴 단계를 포함했습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 신뢰할 수 있으며 중요한 심혈관 조직 (심실, 심방 및 VSM) 각각을 다루...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Centrifuge Tubes	Eppendorf	22364111
10 mL Syringe	Fisher Scientific	14-955-459
19 Guage Needle	BD	305187
2,3-Butanedione Monoxime (BDM)	Sigma-Aldrich	B0753
5 mL Centrifuge Tubes	Sigma-Aldrich	EP0030119479	For embryonic heart isolation
Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer	Molecular Devices		Used for action potential recordings
Benchtop Mini Centrifuge	Southern Labware	MLX-106
Blebbistatin	Sigma-Aldrich	203390
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C4901
Cell-Strainer Sieve	Cole-Parmer	EW-06336-71	100 μm sieve for embryonic heart isolation
Collagenase Type H	Sigma-Aldrich	C8051
Collagenase Type II	Worthington	LS004176
Collagenase Type IV	Worthington	LS004188
Curved Forceps	Fisher Scientific	16-100-110
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
EGTA	Sigma-Aldrich	324626
Elastase	Worthington	LS003118
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F2442
Fine Forceps	Dumont	Style #5	Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two)
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Insulin	Sigma-Aldrich	I2643
K2ATP	Sigma-Aldrich	A8937
Large Petri Dish	Sigma-Aldrich	P5981	For dissociation
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Micro-Hematocrit Capillary Tubes	Kimble Chase	41A2502	Soda lime glass for patch pipettes
Papain	Worthington	LS003118
Pasteur Pipettes	Fisher Scientific	13-678-6A
Petri Dish	Sigma-Aldrich	P5606	100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	806552
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Scissors	Fine Science Tools	14090-09	For adult and juvenile zebrafish decapitation
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
Super Fine Forceps	Dumont	Style #SF	For isolating larval CV tissues (Need two)
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Thermoshaker	ThermoFisher Scientific	13687711
Tricaine Methanesulfonate (MS222)			For anaesthetizing zebrafish larvae
Trypsin Inhibitor	Sigma-Aldrich	T6522