Isolierung von kardialen und vaskulären glatten Muskelzellen aus adulten, juvenilen, Larven und embryonalen Zebrafischen für elektrophysiologische Studien

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die akute Isolierung lebensfähiger kardialer und vaskulärer glatter Muskelzellen aus adulten, juvenilen, larven und embryonalen Zebrafischen (Danio rerio), die für elektrophysiologische Untersuchungen geeignet sind.

Zusammenfassung

Zebrafische werden seit langem als Modell-Wirbeltierorganismus in der Herz-Kreislauf-Forschung eingesetzt. Die technischen Schwierigkeiten, einzelne Zellen aus dem kardiovaskulären Gewebe des Zebrafischs zu isolieren, schränkten die Untersuchung ihrer elektrophysiologischen Eigenschaften ein. Frühere Methoden wurden für die Dissektion von Zebrafischherzen und die Isolierung von ventrikulären Herzmyozyten beschrieben. Die Isolierung von Zebrafisch-Vorhof- und Gefäßmyozyten zur elektrophysiologischen Charakterisierung war jedoch nicht detailliert. Diese Arbeit beschreibt neue und modifizierte enzymatische Protokolle, die routinemäßig isolierte juvenile und adulte Zebrafisch-Ventrikel- und Vorhof-Kardiomyozyten sowie vaskuläre glatte Muskelzellen (VSM) aus dem bauchigen Arteriosus bereitstellen, die für Patch-Clamp-Experimente geeignet sind. Es gibt keine literarischen Beweise für elektrophysiologische Studien an kardiovaskulärem Gewebe von Zebrafischen, die in embryonalen und larven Entwicklungsstadien isoliert wurden. Partielle Dissoziationstechniken, die Patch-Clamp-Experimente an einzelnen Zellen aus Larven- und embryonalen Herzen ermöglichen, werden demonstriert.

Einleitung

Zebrafische sind kleine Teleostfische, die seit langem als Modell-Wirbeltierorganismus¹ verwendet werden und in jüngster Zeit als lebensfähiges Wirbeltiersystem für das Hochdurchsatz-Screening von Genen und Medikamenten bekannt geworden^{sind 2,3}. Die physiologische Analyse von Zebrafischgeweben ist jedoch nicht gut entwickelt. Im kardiovaskulären System wurden Methoden zur Dissektion von Zebrafischherzen⁴ und zur Isolierung von ventrikulären kardialen Myozyten ^5,6,7 beschrieben. Es gibt nur wenige detaillierte Beschreibungen der effektiven Isolierung von Vorhofmyozyten und keine Berichte über Präparate der glatten Vaskulärmuskulatur (VSM) für Patch-Clamp-Studien.

Die aktuelle Arbeit beschreibt Methoden zur Isolierung von Herz- und Gefäßmyozyten von Zebrafischen, die für elektrophysiologische und funktionelle Studien geeignet sind. Dieser Ansatz umfasst Modifikationen der zuvor berichteten Protokolle für die ventrikuläre Myozytenisolierung von Zebrafischen^5,6 und adaptiert Methoden aus VSM-Zellisolierungen von Säugetieren^8, wodurch die Isolierung von glatten Zebrafisch-Gefäßmuskelzellen aus dem bauchigen Arteriosus (BA) ermöglicht wird. Die Protokolle führen zu effizienten Ausbeuten von isolierten atrialen, ventrikulären und VSM-Zellen aus Zebrafischen, die zuverlässig in Patch-Clamp-Studien für bis zu 8 h⁹ verwendet werden können.

Trotz ihrer nahezu transparenten Larven, die sich vollständig außerhalb des elterlichen Organismus entwickeln, war die Erforschung ihres versprochenen ontogenetischen Potenzials bei der Untersuchung der kardiovaskulären Entwicklung durch Herausforderungen bei der Extraktion und Analyse von Geweben in jungen Jahren begrenzt. Der aktuelle Artikel befasst sich mit dieser Einschränkung, indem er Patch-Clamp-Experimente an Zebrafischherzen demonstriert, die bereits 3 Tage nach der Befruchtung (dpf) unter Verwendung einer angepassten, veröffentlichten Extraktionsmethode isoliert wurden¹⁰.

Protokoll

Alle Zebrafische (Wildtypstamm AB, sowohl männlich als auch weiblich) wurden gemäß den Richtlinien des Washington University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aufgezogen, gepflegt und für die Experimente behandelt.

1. Isolierung von Vorhof, Ventrikel und knolligem Arteriosus aus adulten, juvenilen und larven Zebrafischen

1. Euthanasieren Sie Fische mit Kälteschock, d.h. durch Eintauchen in 4 °C warmes Wasser, für ~10 s.
2. Mit einer gebogenen Pinzette Fische in eine große Petrischale geben, die teilweise mit Perfusionspuffer (PB) gefüllt ist (Tabelle 1) und unter ein Seziermikroskop legen.
   1. Enthaupten Sie den Fisch nur hinter den Augen mit einer Schere.
3. Halten Sie den Fisch mit gebogenen Pinzetten (feine Pinzetten für Larvenfische) in der nicht dominanten Hand, wobei die ventrale Seite dem Sezierbereich zugewandt ist. Mit der zweiten feinen Pinzette (oder superfein für Larvenfische) in der dominanten Hand die Brustmuskeln und Flossen vorsichtig aufreißen, um das kardiovaskuläre (CV) Gewebe (Atrium, Ventrikel und knolliger Arteriosus, BA) freizulegen (Abbildung 1).
4. Legen Sie die feine Pinzette in die dominante Hand und ziehen Sie die BA vorsichtig an der sich kreuzenden Spitze der BA und der ventralen Aorta.
   HINWEIS: Der BA und das Herz kommen aus der Körperhöhle.
   1. Trennen Sie die BA vorsichtig von der Aorta, indem Sie die Pinzette kneifen und die Spitze des Vorhofs lokalisieren, in die mehrere Venenäste zusammenlaufen (Sinus venosus). Mit der feinen Pinzette "zupfen" Sie die Spitze des Vorhofs vom Sinus venosus. Dadurch werden die CV-Gewebe vom Rest des Körpers isoliert (Abbildung 1).

2. Dissoziation von Kardiomyozyten aus adulten, juvenilen und larven Zebrafischen für elektrophysiologische Studien

1. Mit der feinen Pinzette "zupfen" Sie den Vorhof und den Ventrikel aus dem CV-Gewebe, das im vorherigen Schritt isoliert wurde.
   HINWEIS: Der Prozess ermöglicht eine saubere Dissektion jedes Gewebes mit minimaler Kreuzkontamination und fühlt sich an wie das Pflücken von Früchten von einem Baum.
   1. Machen Sie einen sanften Riss in den Ventrikel mit feiner Pinzette, um überschüssiges Blut abzulassen, was sichergestellt werden kann, wenn das Herzgewebe blasse Lachsfarbe von leuchtend rot wird.
2. Poolen Sie den isolierten Vorhof und den Ventrikel in separate 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen mit Perfusionspuffer (PB; 1,5 ml).
   HINWEIS: Um eine erfolgreiche Dissoziation von adulten Zebrafisch-Vorhof-Kardiomyozyten (ACMs) und ventrikulären Kardiomyozyten (VCMs) zu gewährleisten, werden typischerweise vier Vorhöfe und drei Ventrikel benötigt. Bei jungen Zebrafischen (28-90 Tage) verdoppelt sich diese Zahl.
   1. Im Falle von Larven Zebrafische (14-28 Tage), sammeln Sie so viel Gewebe wie möglich von ~ 30 Larven.
3. Ersetzen Sie die PB in den Röhrchen durch je 750 μL Aufschlusspuffer (DB) (Tabelle 1) und legen Sie die Röhrchen bei 37 °C und 800 U/min auf einen Thermoshaker. Lassen Sie die Verdauung der Gewebe zu, bis sie durchscheinend werden (~ 30 min für die Vorhöfe und ~ 40 min für die Ventrikel).
4. Beenden Sie die Verdauung, indem Sie das Gewebe in einer Minizentrifuge (2.000 x g bei Umgebungstemperatur) für 3-5 s vorsichtig herunterdrehen und den überstehenden DB durch jeweils 750 μL Stopping Buffer (SB) ersetzen (Tabelle 1).
   HINWEIS: Dieser Zentrifugationsschritt ist optional für die VCM-Isolierung.
5. Inkubieren Sie das pelletierte Gewebe im SB bei Umgebungstemperatur für 15 min.
6. Ersetzen Sie den SB vorsichtig durch jeweils 500-750 μL PB (abhängig von der gewünschten Dichte der fertigen Zellen) und trituieren Sie das Gewebe (~30 mal) mit einer flammpolierten Pasteur-Pipette, um die Zellen zu dispergieren.
   HINWEIS: Die Kardiomyozyten (CMs) sind nun bereit für elektrophysiologische Untersuchungen und werden bis zu 8 h bei Raumtemperatur gelagert.
7. Für eine gleichmäßige Probenahme pipetten Sie die Zellen einige Male vorsichtig auf und ab, um sie zu resuspendieren, bevor Sie einen Tropfen von ihnen für entsprechende Studien hinzufügen.

3. Dissoziation von Zellen der glatten vaskulären Muskulatur (VSM) aus adulten und juvenilen Zebrafischen für elektrophysiologische Studien

1. Zupfen Sie den knolligen Arteriosus (BA) aus dem CV-Gewebe mit dem gleichen Ansatz wie Schritt 2.1 und poolen Sie fünf adulte BAs in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen mit S1-Puffer (1,5 ml) (Tabelle 2). Bei jungen Zebrafischen Pool zehn BAs und bei Larven, die älter als 2 Wochen sind, Pool 30-40 BAs.
   HINWEIS: Es ist praktisch nicht möglich, VSM-Zellen aus Zebrafischlarven zu isolieren, die jünger als 2 Wochen sind.
2. Ersetzen Sie S1 durch 400 μL S2-Puffer (Tabelle 2) und lassen Sie Papain (siehe Materialtabelle) die BAs auf einem Thermoshaker bei 37 °C und 800 U/min für ~20 min aufschlussen.
3. Lassen Sie die teilweise verdauten BAs für 1 min absetzen und ersetzen Sie den Überstand S2 durch 500 μL S3-Puffer (Tabelle 2), der Kollagenase enthält. Verdauen Sie die Tücher auf einem Thermoshaker bei 37 °C und 800 U/min für 3-5 min.
4. Beenden Sie die Verdauung, indem Sie das Gewebe in einer Minizentrifuge (2.000 x g bei Umgebungstemperatur) für 3-5 s vorsichtig herunterdrehen und den Überstand S3 durch 500 μL S1 ersetzen.
5. Trituieren Sie die pelletierten Gewebe vorsichtig (~ 15 mal), um VSM-Zellen zu dispergieren und auf Glasdeckgläser geeigneter Größe zu legen.
   HINWEIS: Die Deckglasgröße wird durch die Größe der Patch-Clamp-Aufnahmekammer bestimmt, in diesem Fall wurden 5 x 5 mm verwendet).
   1. Bewahren Sie die Deckgläser 30 Minuten bei Raumtemperatur auf, damit die Zellen sie anbringen können, und verwenden Sie sie innerhalb der nächsten 6 Stunden.

4. Isolierung von Herzen aus embryonalen Zebrafischen für elektrophysiologische Untersuchungen

1. Fügen Sie Tricain (150 mg/L; 1 ml pro 100 mm x 20 mm Petrischale) zu ~300 Embryonen (2-5 dpf) hinzu, die aus ihren Inkubationsbedingungen gewonnen wurden (Abbildung 2A).
   1. Die anästhesierten Embryonen werden konzentriert, indem Sie sie mit einer Transferpipette in ein 5-ml-Zentrifugenröhrchen überführen und überschüssiges Medium (E3) aus dem Zentrifugenröhrchen entfernen (Abbildung 2B).
2. Die Embryonen werden zweimal mit 3 ml kaltem Perfusionspuffer (PB) gewaschen und in 2 ml PB resuspendiert (Abbildung 2B).
3. Mit dem embryonalen Herzisolierungsapparat (Abbildung 2C) ~1 ml der Embryonen in die Spritzennadel ziehen und sofort wieder in das Röhrchen ausstoßen. Wiederholen Sie diesen Vorgang 30 Mal mit einer Rate von 1 s pro Spritzenbewegung (Abbildung 2C).
4. Führen Sie die fragmentierten Embryonen durch ein 100-μm-Zellsieb in einem Trichter und sammeln Sie die gefilterten Herzen in einem weiteren 5-ml-Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie die Spritze mit 1 ml PB aus, und sammeln Sie diese Spülung ebenfalls durch das Sieb in das Röhrchen (Abbildung 2C).
5. Gut mischen und in 1,5 ml Zentrifugenröhrchen trennen, wobei jedes Röhrchen 1 ml des Inhalts enthält. Zentrifugieren Sie alle Röhrchen auf einer Minizentrifuge auf einem Tischgerät für 5 s (2.000 x g bei Umgebungstemperatur) und entsorgen Sie die Überstände.
6. Führen Sie eine serielle Resuspension der Pellets in den Röhrchen mit 1 ml PB durch, d. h. resuspendieren Sie das Pellet in einem Röhrchen mit 1 ml PB und verwenden Sie dieses resuspendierte PB, um das Pellet im nächsten Röhrchen zu resuspendieren.
7. Pipetten Sie die Herzen zweimal vorsichtig auf und ab, bevor Sie einen Tropfen davon für entsprechende Studien hinzufügen.

5. Patch-Clamp-Studien an isolierten kardiovaskulären Zellen

HINWEIS: Inside-Out- und Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen aus den isolierten Zellen können wie zuvor für_{K-ATP-Kanalströme} im Zebrafisch-Karovaskulatur⁹ berichtet werden.

1. Bei adulten und juvenilen Kardiomyozyten werden die dissoziierten Zellen (aus Schritt 2) aus der Suspension direkt in die Aufnahmekammer gegeben. Bei VSM-Zellen legen Sie das Deckglas mit den plattierten VSM-Zellen (aus Schritt 3) in die Aufnahmekammer.
2. Fügen Sie isolierte intakte embryonale Herzen (aus Schritt 4) aus der Suspension in die Kammer hinzu und machen Sie Patch-Clamp-Aufnahmen von den Epikardialmyozyten (Abbildung 2D).

Ergebnisse

Die oben genannten Protokolle liefern zuverlässig und routinemäßig ausreichend kardiale und vaskuläre Myozyten von gleichbleibender Qualität, die für Patch-Clamp-Studien geeignet sind, wie kürzlich in umfangreichen Studien von ATP-sensitiven Kaliumkanälen (K_ATP) in Wildtyp- und mutierten Zebrafisch-Kardiovaskulatur berichtet^{wurde 9}. Repräsentative Spuren von Aufzeichnungen einer solchen_{K-ATP-Kanalaktivität} von isolierten Kardiomyozyten sind in A...

Diskussion

Frühere Methoden zur Isolierung ventrikulärer Myozyten^5,6 von Zebrafischen, die darauf abzielten, Myozyten für Kultur- oder elektrophysiologische Studien zu erzeugen, lieferten Zellen mit geringerer Ausbeute und beinhalteten langwierige Schritte mehrerer Zentrifugationen^, die die Zellqualität und Lebensfähigkeit beeinträchtigten. Die hier beschriebenen Protokolle sind zuverlässig, decken jedes der signifikanten kardiovaskulären Gewebe (Ventrikel, Vorhöfe...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Centrifuge Tubes	Eppendorf	22364111
10 mL Syringe	Fisher Scientific	14-955-459
19 Guage Needle	BD	305187
2,3-Butanedione Monoxime (BDM)	Sigma-Aldrich	B0753
5 mL Centrifuge Tubes	Sigma-Aldrich	EP0030119479	For embryonic heart isolation
Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer	Molecular Devices		Used for action potential recordings
Benchtop Mini Centrifuge	Southern Labware	MLX-106
Blebbistatin	Sigma-Aldrich	203390
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C4901
Cell-Strainer Sieve	Cole-Parmer	EW-06336-71	100 μm sieve for embryonic heart isolation
Collagenase Type H	Sigma-Aldrich	C8051
Collagenase Type II	Worthington	LS004176
Collagenase Type IV	Worthington	LS004188
Curved Forceps	Fisher Scientific	16-100-110
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
EGTA	Sigma-Aldrich	324626
Elastase	Worthington	LS003118
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F2442
Fine Forceps	Dumont	Style #5	Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two)
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Insulin	Sigma-Aldrich	I2643
K2ATP	Sigma-Aldrich	A8937
Large Petri Dish	Sigma-Aldrich	P5981	For dissociation
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Micro-Hematocrit Capillary Tubes	Kimble Chase	41A2502	Soda lime glass for patch pipettes
Papain	Worthington	LS003118
Pasteur Pipettes	Fisher Scientific	13-678-6A
Petri Dish	Sigma-Aldrich	P5606	100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	806552
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Scissors	Fine Science Tools	14090-09	For adult and juvenile zebrafish decapitation
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
Super Fine Forceps	Dumont	Style #SF	For isolating larval CV tissues (Need two)
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Thermoshaker	ThermoFisher Scientific	13687711
Tricaine Methanesulfonate (MS222)			For anaesthetizing zebrafish larvae
Trypsin Inhibitor	Sigma-Aldrich	T6522