Isolamento de células musculares lisas cardíacas e vasculares de zebrafish adulto, juvenil, larval e embrionário para estudos eletrofisiológicos

Resumo

O presente protocolo descreve o isolamento agudo de células musculares lisas cardíacas e vasculares viáveis de zebrafish adulto, juvenil, larval e embrionário (Danio rerio), adequados para estudos eletrofisiológicos.

Resumo

Os zebrafish têm sido usados há muito tempo como um modelo de organismo vertebrado em pesquisas cardiovasculares. As dificuldades técnicas de isolar células individuais dos tecidos cardiovasculares dos zebrafish têm sido limitantes no estudo de suas propriedades eletrofisiológicas. Métodos anteriores foram descritos para dissecção de corações de zebrafish e isolamento de miócitos cardíacos ventriculares. No entanto, o isolamento dos mócitos atrial e vascular de zebrafish para caracterização eletrofisiológica não foi detalhado. Este trabalho descreve protocolos enzimáticos novos e modificados que fornecem rotineiramente cardiomiocócitos ventriculares e atrials isolados, bem como células de músculo liso vascular (VSM) do arteriosus bulboso, adequados para experimentos de grampo de remendo. Não houve evidência literária de estudos eletrofisiológicos sobre tecidos cardiovasculares de zebrafish isolados em estágios embrionários e larvais de desenvolvimento. Técnicas parciais de dissociação que permitem experimentos de grampo de remendo em células individuais de corações larvais e embrionários são demonstradas.

Introdução

Zebrafish são pequenos peixes teleost que têm sido usados há muito tempo como um modelo de organismo vertebrado¹ e recentemente ganharam destaque como um sistema viável de vertebrados para rastreamento de alto rendimento de genes e drogas ^2,3. No entanto, a análise fisiológica dos tecidos de zebrafish não é bem desenvolvida. No sistema cardiovascular, foram descritos métodos para dissecção de corações de zebrafish⁴ e isolamento de miócitos cardíacos ventriculares ^5,6,7. Há poucas descrições detalhadas do isolamento efetivo de miócitos atrial e nenhum relato de preparações vasculares de músculo liso (VSM) para estudos de grampo de remendo.

O trabalho atual descreve metodologia para o isolamento de mócitos cardíacos e vasculares de zebrafish, viáveis para estudos eletrofisiológicos e funcionais. Esta abordagem inclui modificações de protocolos previamente relatados para o isolamento ventricular do mócito ventricular de zebrafish ^5,6 e adapta métodos de isolamento de células VSM⁸, permitindo o isolamento de zebrafish vascular smooth muscle cell do arteriosus bulboso (BA). Os protocolos resultam em rendimentos eficientes de células atrial, ventricular e VSM isoladas de zebrafish que podem ser usados de forma confiável em estudos de grampo de remendo por até 8 h⁹.

Apesar de suas larvas quase transparentes que se desenvolvem inteiramente fora do organismo parental, explorar seu potencial ongenético prometido no estudo do desenvolvimento cardiovascular tem sido limitado por desafios na extração e análise de tecidos em uma idade jovem. O artigo atual aborda essa limitação demonstrando experimentos de grampo de remendo em corações de zebrafish isolados já em 3 dias após a fertilização (dpf), utilizando um método de extração adaptado e publicado¹⁰.

Protocolo

Todos os zebrafish (cepa tipo selvagem AB, tanto masculino quanto feminino) foram criados, mantidos e tratados para os experimentos seguindo as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Washington (IACUC).

1. Isolamento do átrio, ventrículo e arterioso bulboso de zebrafish adulto, juvenil e larval

1. Eutanize peixes usando choque frio, ou seja, imergindo em água de 4 °C, por ~10 s.
2. Usando fórceps curvos, transfira peixes para uma grande placa de Petri parcialmente preenchida com Tampão de Perfusão (PB) (Tabela 1) e coloque sob um microscópio dissecando.
   1. Decapitar o peixe apenas posterior aos olhos, usando um par de tesouras.
3. Utilizando fórceps curvos (fórceps finos para peixes larvais), segure o peixe na mão não dominante com o lado ventral voltado para o escopo de dissecção. Com o segundo par de fórceps finos (ou superfinos para peixes larvais) na mão dominante, rasgue suavemente os músculos peitorais e as barbatanas para revelar os tecidos cardiovasculares (CV) (átrio, ventrículo e arterioso bulboso, BA) (Figura 1).
4. Colocando os fórceps finos na mão dominante, puxe suavemente a BA na ponta interseccionar da BA e na aorta ventral.
   NOTA: O BA e o coração sairão da cavidade corporal.
   1. Separe cuidadosamente a BA da aorta beliscando as fórceps e localizando a ponta do átrio em que múltiplos ramos venosos convergem (sinus venosus). Usando os fórceps finos, 'arrancar' a ponta do átrio do ânseio do ânseio sinuso. Isso isola os tecidos CV do resto do corpo (Figura 1).

2. Dissociação de cardiomiócitos de zebrafish adulto, juvenil e larval para estudos eletrofisiológicos

1. Usando as fórceps finas, 'arrancar' o átrio e o ventrículo do tecido CV isolados na etapa anterior.
   NOTA: O processo permite a dissecação limpa de cada tecido com contaminação cruzada mínima e se sente semelhante a arrancar frutas de uma árvore.
   1. Faça uma ruptura suave no ventrículo usando fórceps finos para drenar o excesso de sangue, o que pode ser assegurado quando o tecido cardíaco torna a cor de salmão pálido de vermelho brilhante.
2. Acumule o átrio isolado e o ventrículo em tubos de centrífugas separados de 1,5 mL contendo tampão de perfusão (PB; 1,5 mL).
   NOTA: Para garantir a dissociação bem sucedida de cardiomiócitos atrial de zebrafish adultos (ACMs) e cardiomiócitos ventriculares (VCMs), normalmente são necessários quatro átrios e três ventrículos. No caso do zebrafish juvenil (28-90 dias), esse número é dobrado.
   1. No caso do zebrafish larval (14-28 dias), colete o máximo de tecido possível de ~30 larvas.
3. Substitua o PB nos tubos por 750 μL de Tampão de Digestão (DB) (Tabela 1) cada um e coloque os tubos em um termoshaker a 37 °C e 800 rpm. Permita a digestão dos tecidos até que se tornem translúcidos (~30 min para a atria e ~40 min para os ventrículos).
4. Acabe com a digestão girando suavemente os tecidos em uma mini centrífuga de bancada (2.000 x g a temperatura ambiente) por 3-5 s e substitua o DB sobrenante por 750 μL de Stop Buffer (SB) cada um (Tabela 1).
   NOTA: Esta etapa de centrifugação é opcional para o isolamento VCM.
5. Incubar os tecidos pelleted na SB a temperatura ambiente por 15 minutos.
6. Substitua suavemente a SB por 500-750 μL de PB cada (dependendo da densidade desejada das células finais) e tritura os tecidos (~30 vezes) usando uma pipeta Pasteur polida em chamas para dispersar as células.
   NOTA: Os cardiomiócitos (CMs) estão agora prontos para estudos eletrofisiológicos e armazenados à temperatura ambiente por até 8h.
7. Para amostragem uniforme, pipeta suavemente as células para cima e para baixo algumas vezes para resuspend antes de adicionar uma gota delas para estudos correspondentes.

3. Dissociação de células do músculo liso vascular (VSM) de zebrafish adulto e juvenil para estudos eletrofisiológicos

1. Retire arteriosus bulboso bulboso (BA) dos tecidos CV usando a mesma abordagem da etapa 2.1 e poça cinco BAs adultos em um tubo de centrífuga de 1,5 mL contendo tampão S1 (1,5 mL) (Tabela 2). No caso do zebrafish juvenil, piscina dez BAs e, para larvas com mais de 2 semanas, piscina 30-40 BAs.
   NOTA: Não é praticamente viável isolar células VSM de larvas de zebrafish com menos de 2 semanas.
2. Substitua o S1 por 400 μL de tampão S2 (Tabela 2) e permita a digestão do papan (ver Tabela de Materiais) dos BAs em um termoshaker a 37 °C e 800 rpm por ~20 min.
3. Deixe que os BAs parcialmente digeridos se acalmem por 1 min e substitua o S2 supernante por 500 μL de tampão S3 (Tabela 2) contendo colagemnase. Digerir os tecidos em um termoshaker a 37 °C e 800 rpm por 3-5 min.
4. Acabe com a digestão girando suavemente os tecidos em uma mini centrífuga de bancada (2.000 x g a temperatura ambiente) por 3-5 s e substituindo s3 supernaca por 500 μL de S1.
5. Triturar suavemente os tecidos pelleted (~15 vezes) para dispersar células VSM e placas em tampas de vidro de tamanho apropriado.
   NOTA: O tamanho do deslizamento de tampa é determinado pelo tamanho da câmara de gravação de grampo de remendo, neste caso, foi utilizado 5 x 5 mm).
   1. Mantenha as tampas à temperatura ambiente por 30 minutos para que as células se conectem e use-as dentro das próximas 6 horas.

4. Isolamento de corações de zebrafish embrionário para estudos eletrofisiológicos

1. Adicione tricaine (150 mg/L; 1 ml por placa de Petri de 100 mm x 20 mm) a ~300 embriões (2-5 dpf), coletados de suas condições de incubação (Figura 2A).
   1. Concentre os embriões anestesiados transferindo-os para um tubo de centrífuga de 5 mL usando uma pipeta de transferência, removendo o excesso de mídia (E3) do tubo centrífuga (Figura 2B).
2. Lave os embriões com 3 mL de tampão de perfusão frio (PB) duas vezes e resuspende em 2 mL de PB (Figura 2B).
3. Usando o aparelho de isolamento cardíaco embrionário (Figura 2C), desenhe ~1 mL dos embriões na agulha da seringa e expulse-os imediatamente de volta para o tubo. Repita este processo 30 vezes, a uma taxa de 1 s por movimento de seringa (Figura 2C).
4. Passe os embriões fragmentados através de uma peneira de 100 μm de células colocada em um funil e colete os corações filtrados em outro tubo de centrífuga de 5 mL. Enxágüe a seringa com 1 mL de PB e colete esta enxágue bem no tubo através da peneira (Figura 2C).
5. Misture bem e separe em tubos de centrífuga de 1,5 mL, com cada tubo contendo 1 mL do conteúdo. Centrifugar todos os tubos em uma mini centrífuga de bancada por 5 s (2.000 x g a temperatura ambiente) e descartar os sobrenantes.
6. Realizar a ressuspensão serial das pelotas nos tubos usando 1 mL de PB, ou seja, resuspensar a pelota em um tubo usando 1 mL de PB e usar que resuspended PB para resuspend a pelota no próximo tubo.
7. Pipeta suavemente os corações duas vezes antes de adicionar uma gota deles para estudos correspondentes.

5. Estudos de grampos de correção em células cardiovasculares isoladas

NOTA: Gravações de grampo de remendo de dentro para fora e células inteiras das células isoladas podem ser obtidas como relatado anteriormente para as correntes do canal_{K ATP} na cardiovasculatura de zebrafish⁹.

1. Para cardiomiócitos adultos e juvenis, adicione as células dissociadas (a partir da etapa 2) diretamente à câmara de gravação da suspensão. Para células VSM, coloque o deslizamento contendo as células VSM banhadas (a partir da etapa 3) na câmara de gravação.
2. Adicione corações embrionários intactos isolados (da etapa 4) à câmara da suspensão, e faça gravações de grampo de remendo dos miócitos epicáridos (Figura 2D).

Resultados

Os protocolos acima fornecem de forma confiável e rotineiramente miócitos cardíacos e vasculares suficientes de qualidade consistente para estudos de grampo de remendo, como recentemente relatado em estudos extensivos de canais de potássio sensíveis a ATP (K_ATP) em cardiovasculatura de zebrafish de tipo selvagem e mutante⁹. Traços representativos de gravações de tais atividades do canal_{K ATP} de cardiomiócitos isolados são mostrados na Figura 3A-...

Discussão

Métodos anteriores para isolar mócitos ventriculares^de zebrafish ^5,6, destinados a gerar miócitos para cultura ou estudos eletrofisiológicos, forneceram células de menor rendimento e envolveram longas etapas de múltiplas centrífugas que afetaram negativamente a qualidade e a viabilidade da célula. Os protocolos descritos aqui são confiáveis, abrangem cada um dos tecidos cardiovasculares significativos (ventrículo, atria e VSM), e, principalmente, são ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Centrifuge Tubes	Eppendorf	22364111
10 mL Syringe	Fisher Scientific	14-955-459
19 Guage Needle	BD	305187
2,3-Butanedione Monoxime (BDM)	Sigma-Aldrich	B0753
5 mL Centrifuge Tubes	Sigma-Aldrich	EP0030119479	For embryonic heart isolation
Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer	Molecular Devices		Used for action potential recordings
Benchtop Mini Centrifuge	Southern Labware	MLX-106
Blebbistatin	Sigma-Aldrich	203390
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C4901
Cell-Strainer Sieve	Cole-Parmer	EW-06336-71	100 μm sieve for embryonic heart isolation
Collagenase Type H	Sigma-Aldrich	C8051
Collagenase Type II	Worthington	LS004176
Collagenase Type IV	Worthington	LS004188
Curved Forceps	Fisher Scientific	16-100-110
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
EGTA	Sigma-Aldrich	324626
Elastase	Worthington	LS003118
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F2442
Fine Forceps	Dumont	Style #5	Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two)
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Insulin	Sigma-Aldrich	I2643
K2ATP	Sigma-Aldrich	A8937
Large Petri Dish	Sigma-Aldrich	P5981	For dissociation
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Micro-Hematocrit Capillary Tubes	Kimble Chase	41A2502	Soda lime glass for patch pipettes
Papain	Worthington	LS003118
Pasteur Pipettes	Fisher Scientific	13-678-6A
Petri Dish	Sigma-Aldrich	P5606	100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	806552
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Scissors	Fine Science Tools	14090-09	For adult and juvenile zebrafish decapitation
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
Super Fine Forceps	Dumont	Style #SF	For isolating larval CV tissues (Need two)
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Thermoshaker	ThermoFisher Scientific	13687711
Tricaine Methanesulfonate (MS222)			For anaesthetizing zebrafish larvae
Trypsin Inhibitor	Sigma-Aldrich	T6522