Method Article
* These authors contributed equally
פרוטוקול זה מתאר את השלבים ליצירת מודל תלת-ממדי של הפצת מטבוליטים במהלך זיהום טריפנוסמאטיד, כולל איסוף דגימות, מיצוי מטבוליט, סקירה כללית של רכישת נתוני ספקטרומטר מסה כרומטוגרפיה-טנדם נוזלית, יצירת מודל תלת-ממדי, ולבסוף, הדמיית נתונים.
טרופיזם פתוגן וטרופיזם מחלות מתייחסים למיקומי הרקמות המתיישבים באופן סלקטיבי או פגומים על ידי פתוגנים, מה שמוביל לתסמיני מחלה מקומיים. טפילים טריפנוסומטידים נגועים בבני אדם כוללים טריפנוזומה קרוזי, הסוכן הסיבתי של מחלת צ'אגס; טריפנוסומה ברוסי, הסוכן הסיבתי של מחלת שינה; ומיני לישמניה , סוכנים סיבתיים של לישמניאזיס. במשותף, הם משפיעים על 20 מיליון אנשים ברחבי העולם. טפילים אלה מראים טרופיזם ספציפי: לב, ושט, המעי הגס עבור T. cruzi, רקמת שומן, לבלב, עור, מערכת הדם ומערכת העצבים המרכזית עבור T. brucei, עור עבור זני לישמניה דרמוטרופיים, כבד, טחול, ומח עצם עבור זני לישמניה קרביים. נקודת מבט מרחבית היא אפוא חיונית כדי להבין פתוגנזה מחלת טריפנוסומטיד. קרטוגרפיה כימית מייצרת הדמיה תלת-ממדית של שפע מולקולות קטנות הנוצרות באמצעות ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית, בהשוואה לפרמטרים מיקרוביולוגיים ואימונולוגיים. פרוטוקול זה מדגים כיצד ניתן ליישם קרטוגרפיה כימית כדי לחקור תהליכים פתוגניים במהלך זיהום טריפנוסומטיד, החל מדגימת רקמות שיטתית ומיצוי מטבוליט, ואחריו רכישת נתוני ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפיה-טנדם נוזלית, וסיכום עם הדור של מפות תלת-ממדיות של התפלגות מטבוליטים. שיטה זו יכולה לשמש לשאלות מחקר מרובות, כגון דרישות מזין עבור קולוניזציה רקמות על ידי T. cruzi, T. brucei, או Leishmania, אימונומטבוליזם באתרים של זיהום, ואת הקשר בין הפרעה מטבולית רקמות מקומיות תסמיני מחלה קלינית, המוביל תובנה מקיפה לתוך מחלת טריפנוסומטיד פתוגנזה.
טפילים טריפנוסומטידים מורכבים ממיני לישמניה, טריפנוזומים אפריקאים (טריפנוסומה ברוסי), וטפילים אמריקאים (טריפנוזומה קרוזי). לישמניה פרוטוזואה גורמת לישמניאזיס, הכוללת ריפוי עצמי ולישמניאזיס עורית מקומית מוגבלת עצמית, לישמניאזיס mucocutaneous שבו רקמות הרירית של הפה, האף והגרון נפגעות, ולישמניאזיס קרביים עם טפיל טרופיזם לאיברים הקרביים הגורמים חום והפטוספנומגליה 1,2. T. brucei גורם טריפנוזומיאזיס אפריקאי אנושי (HAT), הידוע גם בשם מחלת שינה, שדווח בעיקר במדינות אפריקה3. הסימנים והתסמינים הקליניים כוללים hepatosplenomegaly, חום, כאב ראש, כאבי שרירים ושלד, לימפדינופתיות, ואנמיה בשלב המו-לימפתי כאשר טפילים לוקליזציה למחזור הדם ולימפטיקה. זה ואחריו השלב מנינגו-אנצפליטי, שבו טפילים לוקליזציה למערכת העצבים המרכזית ולגרום הפרעות שינה, שינוי התנהגותי, ובסופו של דבר תרדמת קטלנית4. ט. קרוזי גורם למחלת צ'אגס, אנדמית ביבשת אמריקה. אנשים נגועים חווים שלב אקוטי ראשוני, בדרך כלל אסימפטומטי, עם טפיל טרופיזם רחב. כ -10%-30% מהאנשים הנגועים חווים תסמיני שלב כרוניים לאחר עשרות שנים של זיהום, המאופיינת במגה-ושט, מגה-קולון וסיבוכים לב וכלי דם5,6.
מטבולומיקה חוקרת מינים מולקולריים קטנים (50-1,500 Da), כולל תרכובות ביולוגיות מחילוף חומרים ראשוני או משני ותרכובות שמקורן חיצונית כגון תרופות או מולקולות שמקורן במזון. בהקשר של אינטראקציות מארח-פתוגן, מטבולומיקה יכולה לחקור את ההשפעה של זיהום על סביבות מטבוליט מארח, חיוני בגישה להשפעת הפתוגן על הפונדקאי. זה יכול גם להעריך התאמות פתוגן לסביבה התזונתית והאימונולוגית המארח7,8,9. ספקטרומטריית מסה (MS) וספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית (NMR) הם כלי חילוף חומרים נפוצים המשמשים לזיהוי, כימות ואפיון מטבוליטים. גישה זו "omics" ניתן ליישם גם גילוי סמנים ביולוגיים ופיתוח תרופות10,11.
בהתחשב בטרופיזם הרקמה הספציפי של טפילים טריפנוסומטידים, ניתוחי מטבולומיקה מרחבית יכולים לאפשר תובנה משמעותית על הפתוגנזה של המחלות שהם גורמים. מיפוי ההתפלגות המרחבית של מטבוליטים גילה מטבוליטים מושפעים באופן מקומי על ידי זיהום טריפנוזומה קרוזי כרוני ברקמת הלב של העכבר וזיהום טריפנוזומה קרוזי חריף וארוך טווח במערכת העיכול של העכבר6,12,13. באופן ספציפי, קרטוגרפיה כימית תלת-ממדית הדגימה נתק בין התמדה טפילית ושינויים מטבוליים ברקמת הלב של עכברים נגועים בקרוזוני טריפנוזומה קרוזי כרונית. חילוף החומרים היה מוטרד ביותר בחלקים נמוכים ואפיים של הלב, התאמת עם אתרים של תסמיני מחלת צ'אגס (מפרצות אפיות לב). משפחות מטבוליטים מוטרדים על ידי זיהום באתרי לב ספציפיים בקורלציה לחומרת המחלה כוללים acylcarnitines ו גליצריפוספוכולינים12,13,14. במערכת העיכול, שינויים מטבוליים מתמשכים במקביל לאתרים של תסמיני מחלת צ'אגס: ושט והמעי הגס. לעומת זאת, חילוף החומרים מנורמל מחדש באתרים שאינם קשורים לתסמיני מחלת צ'אגס, כגון המעי הדק. מטבוליטים מוטרדים באופן מקומי על ידי זיהום במערכת העיכול כוללים אצילקרנטין, גליצריפוספוצולין, קינורנין, טריפטופן, וחומצה כולית. בנוסף, ניתוחים אלה אפשרו זיהוי של מנגנון מטבולי חדש של סובלנות למחלת צ'אגס6. יישום שיטות אלה לחקר לישמניאזיס עורית חשף הפרעות מטבוליות משמעותיות באתר הנגע, אך גם שינויים מטבוליים ספציפיים ברקמה מטבולית סמוכה לנגע, מקרוסקופית בריאה. לדוגמה, גלוטמין התרוקן באתר הנגע, ואילו גליצרופוספוצולין ב m/ z (יחס מסה למטען) 200-299, 400-499, 500-599, ו 600-699 גדלו באופן משמעותי באתר הנגע. מחשב (O-34:1) הוגדל רק באתרים סמוכים לנגע15.
מטרת כתב יד זה היא להדגים את הצעדים הדרושים ליצירת מודלים תלת-ממדיים של הפצת מטבוליטים ("קרטוגרפיה כימית") כפי שהם חלים על מודלים של זיהום טפיל טריפנוסומטיד (איור 1). גישה זו מתבססת על מספר התפתחויות קריטיות בהקשר של מטבולומיקה ועיבוד נתונים מטבולומיים, במיוחד פיתוח של תוכנת 'ili כדי להתוות נתוני מטבולומיקה על מודלים תלת-ממדיים בקלות16.
כל הניסויים בבעלי חיים שתוארו אושרו על ידי אוניברסיטת אוקלהומה או אוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו מוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש ועדה. כל השלבים לטיפול בחומר זיהומי בוצעו בתוך ארון בטיחות ביולוגית (מחלקה II, סוג A2) ועל פי תקנות מקומיות.
1. איסוף רקמות
2. מיצוי מטבוליט
הערה: יש להשתמש רק בנוזלים באיכות LC-MS וברגנטים מסוג LC-MS לאורך כל הדרך. שיטה זו הותאמה מהפניה20.
3. רכישת נתוני LC-MS
4. עיבוד נתונים של LC-MS
5.3D ייצור דגמים
6. 'ili יצירת עלילה
מספר תכונות המטבוליט המתקבלות תלוי בסוג הרקמה המנותח ובפרמטרים של עיבוד נתונים. לדוגמה, פרוטוקול זה שימש כדי לנתח את ההשפעה המרחבית של זיהום T. cruzi על מטבולום מערכת העיכול במודל עכבר של זיהום T. cruzi. בעבודה קודמת, זכר C3H / HeJ הוזרקו תוך-פרטני עם 1,000 CL + לוק T. קרוזי טפילים32,6. בעלי חיים הומתו 12 או 89 ימים לאחר ההדבקה, וניתוח קרטוגרפיה כימית של 13 קטעים רציפים של מערכת העיכול בוצע כמתואר בפרוטוקול זה. ניתוח זה הוביל לטבלת תכונות של 5,502 תכונות, אשר הוצגו לאחר מכן לתלת-ממד באמצעות השלבים המתוארים בפרוטוקול זה. גישה זו מאפשרת הדמיה של תכונות מטבוליט בבעלי חיים בודדים גבוהים באתר של עומס טפילים גבוה (קינורנין, איור 2B לעומת עומס טפילים, איור 2A), של מטבוליטים עם חלוקה דיפרנציאלית בין אזורי רקמות (גלוטמין, איור 2C) ותכונות מטבוליט שנמצאות ברמות דומות על פני מעיים קטנים וגדולים (LPE 16:0 איור 2D ). Kynurenine נבחר להדמיה בגלל הקשר הידוע שלה דלקת ופרסומים קודמים על היכולת של מטבוליטים שמקורם kynurenine נגזר לווסת T. cruzi load33. מודלים אקראיים של למידת מכונה המבוססים על יער חשפו בעבר קשר בין רמות קינורנין למצב זיהום6. גלוטמין נבחר להדמיה המבוססת על פרסומים קודמים המדגימים קשר בין זמינות אין ויטרו גלוטמין לבין רגישות לתרופה T. cruzi34. התפלגות דיפרנציאלית אושרה באמצעות רגרסיה לוגיסטית, p < 0.05. LPE 16:0 נבחר לאחר בדיקה חזותית של הנתונים כדי לגלות תכונות מטבוליט שנמצאו ברמות דומות באתרי רקמות שונים.
איור 1: מבט כולל על הפרוטוקול. האיור נוצר עם BioRender.com. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ניתוח קרטוגרפיה כימית. עכברי C3H/HeJ זכרים הוזרקו תוך-פרטני עם 1,000 CL +luc T. cruzi טפילים32. בעלי חיים הומתו 12 או 89 ימים לאחר ההדבקה, ומערכת העיכול נאספה וחתכה באופן שיטתי (שלב 1)6. מטבוליטים חולצו כמו בשלב 2 ונותחו על ידי LC-MS / MS.3D יצירת הדגם בוצעה באמצעות תוכנת SketchUp (שלב 5), והנתונים שורטטו בתלת-ממד כמו בשלב 6. (A) התפלגות טפילים בעכבר מסוים, 12 ימים לאחר ההדבקה. (B) התפלגות מטבוליט קינורנין באותו עכבר, 12 ימים לאחר ההדבקה. (ג) התפלגות גלוטמין ממוצעת על פני עכברים נגועים, 89 ימים לאחר ההדבקה. (D) רמות דומות של m /z 454.292 זמן שמירה 2.929 דקות, ביאור כמו 2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (LPE 16:0), באותו עכבר כמו A ו- B במעי הדק והמעי הגס. דגימות ונתונים נוצרו ב- 6. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
הבנת זיהומים trypanosomatid חיוני כדי להנחות פיתוח תרופות חדשניות וגישות טיפול. שיטת קרטוגרפיה כימית זו צפויה באופן ייחודי לספק תובנות מעשיות על הקשר בין חילוף החומרים לבין פתוגנזה מחלת טריפנוסומטיד, ובכך לענות על צורך תרגומי זה.
רק ממיסים בדרגת LC-MS מומלצים במהלך מיצוי מטבוליט וניתוח טרשת נפוצה, כדי להפחית את זיהום הרקע. זיהום פולימרי35, המופק בדרך כלל מסרט פרפין ו/או פלסטיק אחר36,37,38, יש להימנע במידת האפשר. Parafilm, בפרט, לא חייב לשמש. היבטים אלה חיוניים מאז איכות הנתונים LC-MS תלויה בחומרים המשמשים במהלך הכנת מדגם והפקת מטבוליט. יש להבטיח את איכות הנתונים לפני יצירת תוויות 'ili'. בנוסף, יצירת מפות מטבולומיקה מרחבית מקיפות אלה דורשת איסוף של כל דגימות הרקמות הסמוכות ומיצוי מטבוליטים מכל הדגימות שנאספו כדי למנוע פערים במפות אלה. נהלי גבייה, לוגיסטיקה של מיצוי מטבוליט וניתוח LC-MS, ולכן יש לשקול ולתכנן עלויות בהתאם.
ניתן לשנות פרוטוקול זה כדי לענות על צרכי המשתמש בדרכים מרובות. לדוגמה, הקוטביות והמסיסות של ממיסים המשמשים במהלך מיצוי מטבוליט ישפיעו על מה מטבוליטים מזוהים39. כדי למקסם את המגוון של תכונות מטבוליט שזוהו עבור ניתוחי קרטוגרפיה כימית לא ממוקדת, שילוב שלבי חילוץ מרובים וממסים מומלץ. לדוגמה, שיטה זו משתמשת dichloromethane, מתנול, ומים כמו ממסים מיצוי כי הם מאפשרים זיהוי מדויק של מולקולות לא קוטביות וקוטביות20,40. עם זאת, ממיסים אלה אינם מתאימים באופן אוניברסלי לכל ניסוי טרשת נפוצה, והחוקרים צריכים לבחור ממיסים לחילוץ בהתבסס על מטרות הפרויקט שלהם. כמו כן, ניתן להשתמש בתנאי LC-MS/MS שונים, כגון החלפת כרומטוגרפיה הפוכה בשלב עם כרומטוגרפיה פאזה רגילה. עמודות חלופיות יכולות לשמש גם לאיסוף נתונים בשלב הפוך במקום כרומטוגרפיה C8, אם כי מבחינה אמפירית, כרומטוגרפיה C8 הוא חזק יותר שומנים ברקמות ויש לו תדר סתימה נמוך יותר. מבחינה מושגית, פרוטוקולים אלה יכולים להיות מיושמים גם על שיטות ספקטרומטר מסה אחרות כגון ספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה-מסה, וכו '.
גישה חלופית היא הדמיית ספקטרומטריית מסה. ואכן, שלא כמו גישות הדמיית ספקטרומטר מסה, ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית אינה משמרת מטבעה מידע מרחבי10. קרטוגרפיה כימית מתקרבת לגשר על פער זה על ידי הכללת מיקום דגימה בזמן תפיסת הפרויקט, במטה-נתונים לדוגמה ובשלבי עיבוד נתונים. כוחה של גישת קרטוגרפיה כימית זו, שלא כמו הדמיית ספקטרומטריית מסה, היא היכולת לספק ביאורים בטוחים (יוזמת תקני מטבולומיקה רמה 1 או רמת 2 ביאורים confidence41), בניגוד להדמיית ספקטרומטריית מסה שבה עיקר היישומים מסתמכים על מסה מדויקת רק לביאור. הדמיית ספקטרומטריית מסה תאפשר מיפוי מרחבי מגורען עדין, לפעמים עד לרמת התא הבודד, למשל,42,43. לעומת זאת, גישות קרטוגרפיה כימית מאפשרות מיפוי חוצה איברים בקנה מידה גדול של התפלגות מטבוליטים ללא צורך בכישורי קריוזקציה מיוחדים מאוד של בעלי חיים שלמים. קרטוגרפיה כימית מספקת ראיות משלימות לגישות התמלול המרחביות הרבות המתפתחות, למשל,44, עם היתרון של התמקדות בשכבת 'omics הקרובה ביותר לפנוטיפ'45. שיטות חלופיות לכימות עומס טפילים כוללות מדידת ביולומינציה בזמן איסוף המדגם6. ניתן גם לאסוף מקטעים עדינים כדי לאפשר מיקרוסקופיה קונפוקלית או אלקטרונית כדי להעריך את נטל הטפילים המקומי ואת הנזק לרקמות. הומוגניאט המים, המשמש לכימות ציטוקינים בפרוטוקול זה ובפרסומים קודמים13, יכול לשמש גם לכימות סמנים מבוססי חלבון של נזק לרקמות.
ישנן גם דרכים מרובות להשיג מודלים תלת-ממדיים המתאימים להתוויית נתוני LC-MS המתקבלים. בנוסף לשיטה המוצעת כאן, ניתן לרכוש דגמים המיוצרים מראש מספקים מקוונים שונים. ודא שתנאי השימוש תואמים לשימוש המיועד, במיוחד בנוגע לפרסום. מודלים עבור איברים גדולים ניתן ליצור דה נובו באמצעות סורקים 3D על פי הוראות הסורק. קיימות חלופות כגון MATLAB להפקה והדמיה של מודלים תלת-ממדיים עבור קרטוגרפיה כימית46, אך הם יושמו בעיקר לפני הפיתוח של 'ili16. MATLAB היא חבילת כלים לניתוח ותכנות נתונים המציעה מגוון רחב של יישומים בתחומים רבים. עם זאת, MATLAB אינו חופשי ולא קוד פתוח, והוא דורש היכרות עם ממשקי MATLAB, במיוחד בהתחשב MATLAB לא פותח לעיבוד נתוני ספקטרומטריית מסה. החלופות של שיטה מוצעת זו, כלומר SketchUp, Meshlab ו- 'ili, נגישות באופן חופשי, ידידותיות למשתמש, ומציעות פונקציות דומות כמו MATLAB למטרות קרטוגרפיה כימית.
שיטה זו היא חזקה לגבי הכנת מדגם ומיצוי מטבוליט. פתרון בעיות נחוץ לרוב בשלב רכישת הנתונים של LC-MS. זה מעבר להיקף של מאמר זה. הקוראים מופנים לפרסומים מצוינים על פתרון בעיות של רכישת נתונים של LC-MS, כולל 20,47. כמו כן, המורכבות של ביאור מטבוליט הם מעבר להיקף ההתמקדות של שיטה זו ביצירת מודל 3D. הפניות שימושיות בנושא זה כוללות 24,25,48,49.
בעוד שיטה זו בוחנת ביעילות פתוגנזה המחלה, יש מגבלות לגישה זו, שחלקם נפוצים על פני כל ניסוי מטבולומיקה. מגבלה אחת כזו היא שיעור הביאור הנמוך של תכונות LC-MS50, אשר מותנה בזמינות ובאיכות של ספריות ספקטרליות התייחסות. מגבלה נוספת היא כי פרוטוקול זה אינו משמר mRNA בשל חוסר תאימות של ריאגנטים שימור RNA כגון RNAlater עם ניתוח LC-MS / MS. עם זאת, איכות החלבון מתאימה לניתוחים במורד הזרם ולכן יכולה להחליף ניתוחים מבוססי mRNA.
גישה של קרטוגרפיה כימית לזיהום פתוגנזה משקפת ישירות כיצד זיהומים חיידקיים, ויראליים או טפיליים מתפתחים במערכות איברים וגורמים למחלות מקומיות. ניתוח תת-דגימות אזוריות אלה ויצירת מודלים תלת-ממדיים מעבירים בסופו של דבר כיצד מטבוליטים פועלים במרחב התלת-ממדי, ושופכים אור על ממדים מרחביים אלה שלא זוהו בעבר של ביולוגיה מולקולרית. באמצעות פרוטוקול זה, למשל, לוקליזציה מטבוליט הושווה עומס טפילים Trypanosoma cruzi. התוצאות הבהירו את הקשר בין הפתוגן לרקמת המארח וגם הדגימו את הדינמיקה המטבולית של התקדמות סימפטום מחלת צ'אגס6. שיטות קרטוגרפיה כימיות יושמו גם בנושאים שונים, כגון אינטראקציה סביבתית שנבנתה על ידי בני אדם51,52,53, ההרכב הכימי של מערכות איברים כמו עור אנושי46 וריאות54, וחילוף חומרים של צמחים ואינטראקציות סביבה55. יישומים עתידיים יכולים לכלול הערכת סובלנות וחוסן למחלות מקומיות, או את הקשר בין רמות מטבוליט מקומיות, טרופיזם פתוגן וטרופיזם של מחלות במודלים שמעבר לזיהום טריפנוסומטיד. גישה זו צריכה להיות גם ישימות רחבה כדי להרחיב את פרוטוקולי הפרמקוקינטיקה הנוכחיים, כדי להעריך את הקשר בין רמות התרופה רקמות מקומיות חילוף החומרים של התרופה לעומת הקשר מטבולי הכולל, נזק לרקמות, אישור פתוגן. בסך הכל, קרטוגרפיה כימית מאפשרת מחקרים ייחודיים של הפצות מטבוליטים בסוגי מדגם שונים, עם יישומים כולל פתוגנזה של מחלות, בריאות האדם, אינטראקציות בין האדם לסביבה ודינמיקה מיקרוביאלית.
אין ניגוד אינטרסים לדווח.
לורה-איזבל מקול, PhD, מחזיקה חוקרת בפרס פתוגנזה למחלות זיהומיות מקרן בורוז וולקום. המחברים מבקשים עוד להכיר בתמיכתו של מספר פרס NIH R21AI1488886, מענק פיילוט ממרכז אוקלהומה למחלות נשימה וזיהום (OCRID) תחת מספר הפרס NIH P20GM103648, וקרנות סטארט-אפ מאוניברסיטת אוקלהומה (ל- LIM). התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המממנים. המחברים גם רוצים להודות למפתחים של הכלים המשמשים בפרוטוקול זה. כל הפרסומים הרלוונטיים צוטטו, במידת הצורך.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL Eppendorf tubes | NA | NA | any brand, as available |
1 L bottle, pyrex | NA | NA | any brand, as available |
1 L graduated cylinder, pyrex | NA | NA | any brand, as available |
2 mL SafeLock Eppendorf tubes | VWR | 20901-540 | use the appropriate tube model for the available tissue homogenizer |
3D model (de-novo generated according to protocol steps, or purchased) | NA | NA | as appropriate for system under investigation |
5 mm stainless steel bead | Qiagen | 69989 | |
96 well plate | Fisher | 3252449 | |
AATTCCTCCAAGCAGCGGATA primer | NA | NA | any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007). |
analytical balance | NA | NA | any brand, as available |
ASTCGGCTGATCGTTTTCGA primer | NA | NA | any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007). |
benchtop centrifuge with microcentrifuge, falcon tube and 96-well-plate capacity | NA | NA | any brand, as available |
biosafety cabinet | NA | NA | class II, type A2; any brand, as available |
CAGCAAGCATCTATGCACTTAG ACCCC primer | NA | NA | any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003). |
camera | NA | NA | any brand, as available. A cellphone camera is adequate for this protocol |
chemiluminescent-capable imaging system | NA | NA | any system, as available |
cotton balls | NA | NA | any brand, as available |
cryogloves | VWR | 97008-208 | replace with any brand, as available |
dissection scissors | NA | NA | any brand, as available |
dry ice | NA | NA | any brand, as available |
extra-length forceps | NA | NA | any brand, as available |
flammable-grade refrigerator | NA | NA | any brand, as available |
freezer storage boxes for microcentrifuge tubes | NA | NA | any brand, as available |
fume hood | NA | NA | any brand, as available |
high-resolution mass spectrometer | NA | NA | any brand, as available, such as ThermoFisher Q-Exactive Plus (catalog number 0726030) |
ice bucket | NA | NA | any brand, as available |
ili software | ili.embl.de | NA | |
isoflurane | Covetrus | 29405 | |
large tupperware | NA | NA | any brand, as available; large enough to comfortably contain mouse, cotton ball |
LC-MS grade acetonitrile | Fisher Optima | A955-4 | |
LC-MS grade dicholoromethane | Fisher Optima | D151-4 | |
LC-MS grade formic acid | Fisher Optima | A11750 | |
LC-MS grade methanol | Fisher Optima | A456-4 | |
LC-MS grade water | Fisher Optima | W64 | |
liquid chromatography column | Phenomenex | 00B-4499-AN | may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest |
liquid chromatography column guard cartridge | Phenomenex | AJ0-8784 | may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest |
liquid chromatography column guard cartridge holder | Phenomenex | AJ0-9000 | may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest |
liquid nitrogen | NA | NA | any brand, as available |
luciferin | Goldbio | LUCK-1G | |
MeshLab software | https://www.meshlab.net/ | NA | |
Meshmixer software | https://www.meshmixer.com/ | NA | |
MS calibrant | NA | NA | appropriate one for available instrument |
MS data processing software | NA | NA | multiple options available; authors recommend MZmine |
MSConvert software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | NA | |
Nanodrop | ThermoFisher | ND-ONE-W | other nanodrop models are also suitable |
p1000 pipet tips | NA | NA | use the appropriate brand to fit available pipettors |
p1000 pipettor | NA | NA | any brand, as available |
p20 pipette tips | NA | NA | use the appropriate brand to fit available pipettors |
p20 pipettor | NA | NA | any brand, as available |
p200 pipette tips | NA | NA | use the appropriate brand to fit available pipettors |
p200 pipettor | NA | NA | any brand, as available |
personal protective equipment (gloves, lab coat, safety glasses/goggles; faceshield) | NA | NA | any brand, as available |
Q-Plex Mouse Cytokine - Screen (16-Plex) | Quansys biosciences | 110949MS | can replace with other protein-based cytokine assays such as other commercial cytokine ELISA kits |
Quick-DNA Miniprep Plus Kit (200 preps) | Zymo | D4069 | replace with any brand of mammalian DNA extraction kit, as available |
real-time thermocycler | NA | NA | any brand, as available |
salt shaker or tea infuser | NA | NA | any brand; to contain isoflurane-soaked cotton ball and prevent contact with mouse skin |
SketchUp software | https://www.sketchup.com/ | NA | |
specimen forceps | NA | NA | any brand, as available |
speedvac with microcentrifuge tube and 96-well-plate capacity | NA | NA | any brand, as available |
spreadsheet software | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel | NA | can replace with other spreadsheet management software, as applicable |
sulfachloropyridazine | Sigma | S9882-100G | |
sulfadimethoxine | Sigma | S7007-10G | |
Sybr green qPCR reaction mix | Fisher | A25780 | can replace with other Sybr green qPCR reaction mixes, as desired |
TCCCTCTCATCAGTTCTAT GGCCCA primer | NA | NA | any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003). |
tissue homogenizer | NA | NA | any brand, as available; for example, Qiagen TissueLyser II, catalog number 85300, with TissueLyser Adapter Set (2 x 24), catalog number 69982 |
tissue samples | NA | NA | from appropriate infection model |
TissueLyser single-bead dispenser | Qiagen | 69965 | |
UHPLC | NA | NA | any brand, as available, such as ThermoFisher Vanquish (catalog number IQLAAAGABHFAPUMBHV) |
ultra-low temperature freezer (-80) | NA | NA | any brand, as available |
ultrasonic bath | NA | NA | any system, as available |
wet ice | NA | NA | any brand, as available |
zone-free sealing film | VWR | 490007-390 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved