JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השלבים ליצירת מודל תלת-ממדי של הפצת מטבוליטים במהלך זיהום טריפנוסמאטיד, כולל איסוף דגימות, מיצוי מטבוליט, סקירה כללית של רכישת נתוני ספקטרומטר מסה כרומטוגרפיה-טנדם נוזלית, יצירת מודל תלת-ממדי, ולבסוף, הדמיית נתונים.

Abstract

טרופיזם פתוגן וטרופיזם מחלות מתייחסים למיקומי הרקמות המתיישבים באופן סלקטיבי או פגומים על ידי פתוגנים, מה שמוביל לתסמיני מחלה מקומיים. טפילים טריפנוסומטידים נגועים בבני אדם כוללים טריפנוזומה קרוזי, הסוכן הסיבתי של מחלת צ'אגס; טריפנוסומה ברוסי, הסוכן הסיבתי של מחלת שינה; ומיני לישמניה , סוכנים סיבתיים של לישמניאזיס. במשותף, הם משפיעים על 20 מיליון אנשים ברחבי העולם. טפילים אלה מראים טרופיזם ספציפי: לב, ושט, המעי הגס עבור T. cruzi, רקמת שומן, לבלב, עור, מערכת הדם ומערכת העצבים המרכזית עבור T. brucei, עור עבור זני לישמניה דרמוטרופיים, כבד, טחול, ומח עצם עבור זני לישמניה קרביים. נקודת מבט מרחבית היא אפוא חיונית כדי להבין פתוגנזה מחלת טריפנוסומטיד. קרטוגרפיה כימית מייצרת הדמיה תלת-ממדית של שפע מולקולות קטנות הנוצרות באמצעות ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית, בהשוואה לפרמטרים מיקרוביולוגיים ואימונולוגיים. פרוטוקול זה מדגים כיצד ניתן ליישם קרטוגרפיה כימית כדי לחקור תהליכים פתוגניים במהלך זיהום טריפנוסומטיד, החל מדגימת רקמות שיטתית ומיצוי מטבוליט, ואחריו רכישת נתוני ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפיה-טנדם נוזלית, וסיכום עם הדור של מפות תלת-ממדיות של התפלגות מטבוליטים. שיטה זו יכולה לשמש לשאלות מחקר מרובות, כגון דרישות מזין עבור קולוניזציה רקמות על ידי T. cruzi, T. brucei, או Leishmania, אימונומטבוליזם באתרים של זיהום, ואת הקשר בין הפרעה מטבולית רקמות מקומיות תסמיני מחלה קלינית, המוביל תובנה מקיפה לתוך מחלת טריפנוסומטיד פתוגנזה.

Introduction

טפילים טריפנוסומטידים מורכבים ממיני לישמניה, טריפנוזומים אפריקאים (טריפנוסומה ברוסי), וטפילים אמריקאים (טריפנוזומה קרוזי). לישמניה פרוטוזואה גורמת לישמניאזיס, הכוללת ריפוי עצמי ולישמניאזיס עורית מקומית מוגבלת עצמית, לישמניאזיס mucocutaneous שבו רקמות הרירית של הפה, האף והגרון נפגעות, ולישמניאזיס קרביים עם טפיל טרופיזם לאיברים הקרביים הגורמים חום והפטוספנומגליה 1,2. T. brucei גורם טריפנוזומיאזיס אפריקאי אנושי (HAT), הידוע גם בשם מחלת שינה, שדווח בעיקר במדינות אפריקה3. הסימנים והתסמינים הקליניים כוללים hepatosplenomegaly, חום, כאב ראש, כאבי שרירים ושלד, לימפדינופתיות, ואנמיה בשלב המו-לימפתי כאשר טפילים לוקליזציה למחזור הדם ולימפטיקה. זה ואחריו השלב מנינגו-אנצפליטי, שבו טפילים לוקליזציה למערכת העצבים המרכזית ולגרום הפרעות שינה, שינוי התנהגותי, ובסופו של דבר תרדמת קטלנית4. ט. קרוזי גורם למחלת צ'אגס, אנדמית ביבשת אמריקה. אנשים נגועים חווים שלב אקוטי ראשוני, בדרך כלל אסימפטומטי, עם טפיל טרופיזם רחב. כ -10%-30% מהאנשים הנגועים חווים תסמיני שלב כרוניים לאחר עשרות שנים של זיהום, המאופיינת במגה-ושט, מגה-קולון וסיבוכים לב וכלי דם5,6.

מטבולומיקה חוקרת מינים מולקולריים קטנים (50-1,500 Da), כולל תרכובות ביולוגיות מחילוף חומרים ראשוני או משני ותרכובות שמקורן חיצונית כגון תרופות או מולקולות שמקורן במזון. בהקשר של אינטראקציות מארח-פתוגן, מטבולומיקה יכולה לחקור את ההשפעה של זיהום על סביבות מטבוליט מארח, חיוני בגישה להשפעת הפתוגן על הפונדקאי. זה יכול גם להעריך התאמות פתוגן לסביבה התזונתית והאימונולוגית המארח7,8,9. ספקטרומטריית מסה (MS) וספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית (NMR) הם כלי חילוף חומרים נפוצים המשמשים לזיהוי, כימות ואפיון מטבוליטים. גישה זו "omics" ניתן ליישם גם גילוי סמנים ביולוגיים ופיתוח תרופות10,11.

בהתחשב בטרופיזם הרקמה הספציפי של טפילים טריפנוסומטידים, ניתוחי מטבולומיקה מרחבית יכולים לאפשר תובנה משמעותית על הפתוגנזה של המחלות שהם גורמים. מיפוי ההתפלגות המרחבית של מטבוליטים גילה מטבוליטים מושפעים באופן מקומי על ידי זיהום טריפנוזומה קרוזי כרוני ברקמת הלב של העכבר וזיהום טריפנוזומה קרוזי חריף וארוך טווח במערכת העיכול של העכבר6,12,13. באופן ספציפי, קרטוגרפיה כימית תלת-ממדית הדגימה נתק בין התמדה טפילית ושינויים מטבוליים ברקמת הלב של עכברים נגועים בקרוזוני טריפנוזומה קרוזי כרונית. חילוף החומרים היה מוטרד ביותר בחלקים נמוכים ואפיים של הלב, התאמת עם אתרים של תסמיני מחלת צ'אגס (מפרצות אפיות לב). משפחות מטבוליטים מוטרדים על ידי זיהום באתרי לב ספציפיים בקורלציה לחומרת המחלה כוללים acylcarnitines ו גליצריפוספוכולינים12,13,14. במערכת העיכול, שינויים מטבוליים מתמשכים במקביל לאתרים של תסמיני מחלת צ'אגס: ושט והמעי הגס. לעומת זאת, חילוף החומרים מנורמל מחדש באתרים שאינם קשורים לתסמיני מחלת צ'אגס, כגון המעי הדק. מטבוליטים מוטרדים באופן מקומי על ידי זיהום במערכת העיכול כוללים אצילקרנטין, גליצריפוספוצולין, קינורנין, טריפטופן, וחומצה כולית. בנוסף, ניתוחים אלה אפשרו זיהוי של מנגנון מטבולי חדש של סובלנות למחלת צ'אגס6. יישום שיטות אלה לחקר לישמניאזיס עורית חשף הפרעות מטבוליות משמעותיות באתר הנגע, אך גם שינויים מטבוליים ספציפיים ברקמה מטבולית סמוכה לנגע, מקרוסקופית בריאה. לדוגמה, גלוטמין התרוקן באתר הנגע, ואילו גליצרופוספוצולין ב m/ z (יחס מסה למטען) 200-299, 400-499, 500-599, ו 600-699 גדלו באופן משמעותי באתר הנגע. מחשב (O-34:1) הוגדל רק באתרים סמוכים לנגע15.

מטרת כתב יד זה היא להדגים את הצעדים הדרושים ליצירת מודלים תלת-ממדיים של הפצת מטבוליטים ("קרטוגרפיה כימית") כפי שהם חלים על מודלים של זיהום טפיל טריפנוסומטיד (איור 1). גישה זו מתבססת על מספר התפתחויות קריטיות בהקשר של מטבולומיקה ועיבוד נתונים מטבולומיים, במיוחד פיתוח של תוכנת 'ili כדי להתוות נתוני מטבולומיקה על מודלים תלת-ממדיים בקלות16.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים שתוארו אושרו על ידי אוניברסיטת אוקלהומה או אוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו מוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש ועדה. כל השלבים לטיפול בחומר זיהומי בוצעו בתוך ארון בטיחות ביולוגית (מחלקה II, סוג A2) ועל פי תקנות מקומיות.

1. איסוף רקמות

  1. להדביק מודלים מתאימים של בעלי חיים זיהום טריפנוסומטיד, בדרך כלל עכברים או אוגרים.
    הערה: יש מגוון ניכר של מודלים עכבר עבור זיהום trypanosomatid, בהתאם לתסמינים הרצויים להיות מיוצר, מהירות התקדמות המחלה, חומרת המחלה, וכו '. המשתמשים יכולים לבחור לנוחיותם.
    1. עבור מודלים זיהום לישמניאזיס עורית, להדביק תת עורית במשטח הרגליים או תוך עורית באוזן15.
    2. עבור מודלים זיהום לישמניאזיס הקרביים, להדביק תוך ורידי1,17.
    3. עבור מודלים של מחלת צ'אגס וזיהום מחלת שינה, להדביק intraperitoneally6,12,18,19. לקבוע את מינון הטפיל לשימוש בהתבסס על זן הטפיל ונקודות זמן מתוכננות.
  2. תכנן עמדות חלוקה.
    1. תכנן ליצור קטעים עם מינימום של 10 מ"ג של רקמה לכל סעיף. עדיף להשתמש 30-50 מ"ג.
    2. עבור מודלים של זיהום מחלת צ'אגס, תכנן לאסוף מקטעי לב ומעיים באופן שיטתי.
    3. עבור מודלים זיהום לישמניאזיס עורי, לאסוף רקמה ניוונית ודגימות סמוכות נגע.
    4. עבור מודלים זיהום לישמניאזיס הקרביים, תוכנית לאסוף טחול ואונות כבד מרובות. אתרי רקמות נוספים כגון רקמת שומן עשויים גם להיות עניין לאסוף.
      אזהרה: דגימות מבעלי חיים נגועים חייבות להיות מטופלות תחת פרוטוקול בטיחות ביולוגית מתאים שאושר על ידי המוסד. זה יהיה בדרך כלל כרוך דרישות ציוד מגן אישי (PPE) ורק פתיחת צינורות ואיסוף דגימות בתוך ארון בטיחות ביולוגית (מחלקה II, סוג A2).
  3. תווית ושקילה צינורות להומוגניזציה.
    1. השתמש בסוג הצינור המתאים למערכת ההומוגניזציה הזמינה. עבור TissueLyser, השתמש 2 מ"ל צינורות microcentrifuge.
    2. המתת חסד של עכברים בנקודות הזמן הרצויות של זיהום באמצעות מנת יתר איזופלוריין כפי שאושרה על ידי IACUC מוסדי או על פי פרוטוקול שאושר על ידי IACUC.
    3. רקמת סעיף באופן שיטתי כמתוכנן, עם סעיף אחד לכל צינור.
    4. זכור לשטוף ציוד איסוף מדגם בין דגימות עם ממס החילוץ (50% מתנול בפרוטוקול זה).
  4. שמירה על מכסה הצינור פתוח, מיד להצמיד דגימות להקפיא חנקן נוזלי.
    אזהרה: אין לסגור צינורות עד שכל חנקן נוזלי נכנס הצינור התאדה לחלוטין כדי למנוע צינורות מלהתפוצץ כמו חנקן מתרחב. לנקוט צעדים נאותים כדי להבטיח כי העור לא בא במגע עם חנקן נוזלי (להשתמש כפפות קריו מלקחיים להחזיק את הצינורות). ללבוש מגן פנים בטיחות.
  5. לאחסן את הצינורות על קרח יבש עד שכל הדגימות הרצויות נאספו.
  6. נקודת השהיה: לאחסן דוגמאות ב -80 °C (80 °F) עד מוכן לעשות עקירות.
  7. לשקול צינורות כדי לקבוע משקל דגימת רקמות. הקלט בגיליון אלקטרוני.
    1. שמור את הדגימות קפואות במהלך תהליך השקילה: לשמור צינורות על קרח יבש, לשקול במהירות, להחזיר על קרח יבש מיד. אל תאפשר לדגימות להפשיר בזמן השקילה.

2. מיצוי מטבוליט

הערה: יש להשתמש רק בנוזלים באיכות LC-MS וברגנטים מסוג LC-MS לאורך כל הדרך. שיטה זו הותאמה מהפניה20.

  1. הכן את כל ממסים החילוץ (LC-MS כיתה H2O, מתנול LC-MS כיתה, ממוסמר עם 4 מיקרומטר של sulfachlorpyridazine, LC-MS כיתה dichloromethane: מתנול ממוסמר עם 2 מיקרומטר של sulfachlorpyridazine) בבקבוקי זכוכית L 1, באמצעות כלי זכוכית ייעודיים.
    הערה: נפח להיות מוכן צריך להיות מחושב על סמך משקלים מדגם, בהתחשב 500 μL של מים לכל 50 מ"ג של מדגם, 500 μL של מתנול ממוסמר עם 4 מיקרומטר של sulfachlorpyridazine לכל 50 מ"ג של מדגם ו 1,000 μL של dichloromethane prechilled: מתנול זינק עם 2 מיקרומטר של sulfachlorpyridazine לכל 50 מ"ג של מדגם, הגדלת הנפח המחושב על ידי 10% כדי לאפשר אי דיוק צנרת. יש לאחסן ממס מיצוי בטמפרטורה של 4 °C (50 °F) לפחות למשך הלילה כדי לצנן מראש.
  2. בצע הומוגניזציה על בסיס מים של דגימות הרקמה לפי השלבים שהוזכרו להלן.
    1. הוסף חרוז נירוסטה אחד 5 מ"מ (ראה טבלת חומרים) לכל אחד צינורות microcentrifuge 2 מ"ל המכילים דגימות רקמה, באמצעות מתקן חרוזים. שמור את הצינורות על קרח.
    2. הפוך צינור ריק אחד המכיל LC-MS כיתה H2O כי יעבור את כל השלבים וישמש חילוץ ריק. השתמש באמצעי האחסון H2O הממוצע מהפקות מדגם. הוסף H2O LC-MS כיתה מצוננת לדגימות הרקמה הקפואה.
      1. לנרמל את נפח המים למשקל הרקמה על ידי הוספת 500 μL של מים / 50 מ"ג של מדגם, באמצעות משקולות המדגם מחושב בשלב 1.7.
        אזהרה: אם מטפלים בדגימות ביולוגיות, המשיכו לעקוב אחר פרוטוקול הבטיחות הביולוגית המתאים שאושר על ידי המוסד. זה יהיה בדרך כלל כרוך בדרישות עבור ציוד מגן אישי (PPE) ופתיחת צינורות רק בתוך ארון בטיחות ביולוגית (מחלקה II, סוג A2).
    3. דגימות הומוגניזציה במהירות של 25 הרץ למשך 3 דקות באמצעות הומוגניזר רקמות (ראה טבלת חומרים).
      1. סגור את הצינורות בחוזקה כדי למנוע שפיכת ריאגנטים במהלך העיבוד.
    4. לאסוף כ 1/10th של נפח הומוגניזציה עבור מיצוי DNA, qPCR, ניתוחים מבוססי חלבון, או ניתוחים אחרים (אם תרצה). יש לאחסן בצינור מיקרוצנטריפוגה או בלוחית של 96 באר (בהתאם לנפח שנאסף) עד 6 חודשים בטמפרטורה של עד 80 °C (80 °F), אם יש לבצע ניסויי הפקת DNA ביום אחר. משכי אחסון ארוכים יותר עשויים להיות אפשריים אך לא נבדקו.
      1. בצע עקירות דנ"א באמצעות כל ערכה מסחרית סטנדרטית להפקת דנ"א של יונקים (ראה טבלת חומרים) מרקמות כמתואר בהפניה13. לכמת את תפוקת ה- DNA ולאחסן את ה- DNA שחולץ ב -20 °C (60 °F). כמות DNA מקובלת ואיכות עבור qPCR נצפתה אפילו עד 3 שנים מאוחר יותר.
        הערה: שלב זה יכול להתבצע על הומוגנט קפוא ביום הבא מן החילוץ מטבוליט.
      2. בצע qPCR כמתואר בהפניה13, באמצעות 180 ng של DNA שחולץ.
        הערה: זה יכול להתבצע על DNA שנאסף ביום הקודם קפוא ב -20 °C (60 °F).
        1. במקרה של מחקרים על זיהום T. cruzi, להשתמש בפריימרים הבאים: ASTCGGCTGATCGTTTTCGA ו AATTCCTCCAAGCAGGGATA כדי לכמת את רמות הטפילים21 ואת הפריימרים הבאים כדי לנרמל כדי לארח רמות DNA: TCCCTCTCATCAGTTCTTGGCCCA ו CAGCAAGCATCTATGACTTAGACCCCCC22 (ראה טבלת חומרים).
          הערה: מחזורי qPCR המומלצים הם כדלקמן: denature ב 95 °C (95 °F) במשך 10 דקות; לבצע 40 מחזורים ב 95 °C (95 °F) עבור 30 s, ולאחר מכן 58 °C (58 °F) עבור 60 s, ולבסוף 72 °C (60 °F) עבור 60 s. בצע ניתוח עקומת ההיתוך בהתאם לתרמו-מחזור הזמין. עבד נתונים באמצעות שיטת ΔΔCt23 כדי להשיג עומס טפילים יחסי בין אתרי דגימה. כימות מוחלט ניתן להשיג על ידי השוואת ערכי ΔΔCt נגזר מדגם לעקומה סטנדרטית שנוצרת מכמויות ידועות של טפילים, זינק לתוך דגימות רקמות נגועות, וחולץ כמו בשלבים 2.2 כדי 2.2.4.1.
      3. בצע אפיון מבוסס חלבון של תגובות חיסוניות באמצעות ערכות ציטוקינים מרובות ציטוקינים או ערכות ELISA מסחריות סטנדרטיות (ראה טבלת חומרים) כמתואר בהפניה13 על ההומוגנאט המאוחסן.
    5. שמור לפחות מחצית 500 μL של נפח הומוגניזציה עבור מיצוי מטבוליט.
  3. בצע מיצוי מטבוליט מימית.
    הערה: ניתן להתאים את בחירת הממסים בהתבסס על התכונות הכימיות של מטבוליטים מעניינים.
    1. הוסף מתנול כיתה LC-MS קר כקרח מתובל עם 4 מיקרומטר של sulfachlorpyridazine להומוגנט כדי להשיג ריכוז סופי של 50% מתנול עם 2 מיקרומטר של sulfachlorpyridazine במים.
      זהירות: מתנול דליק ומסוכן. השתמש בהליכי בטיחות מתאימים, כולל טיפול בתוך מכסה המנוע של אדים או ארון בטיחות ביולוגית.
    2. דגימות הומוגניזציה ברקמות הומוגניזר במהירות של 25 הרץ למשך 3 דקות. דגימות צנטריפוגה ב 16,000 x g ב 4 °C (65 °F) במשך 10 דקות.
    3. לאסוף נפח שווה של supernatant לתוך צלחת 96-well-well. בחר את עוצמת הקול כך שתתאים לנפח הקטן ביותר של מים מתנול + המשולבים בכל הדגימות. זהו השבר המימי.
      1. מניחים בצד כל סופר-ננט הומוגני מימי שנותר ב-80 °C (80 °F) כגיבוי.
    4. שמור את השאריות המוצקות על הקרח תוך איסוף supernatants.
    5. מיצוי מימי יבש סופר-טבעי עד יבש (~ 3 שעות או לילה). יש להשתמש במהירות מרבית וללא חימום.
    6. להקפיא את צלחת 96-היטב מיובשת ב -80 °C (80 °F).
  4. בצע מיצוי מטבוליט אורגני.
    הערה: ניתן להתאים את בחירת הממסים בהתבסס על התכונות הכימיות של מטבוליטים מעניינים.
    1. הוסף 1,000 μL לכל 50 מ"ג של המדגם של dichloromethane prechilled: מתנול זינק עם 2 מיקרומטר של sulfachlorpyridazine לשאריות מוצקות משלב 2.3.4.
      שים לב: השתמש בנהלי בטיחות מתאימים בעת טיפול בממסים, כולל טיפול בתוך מכסה מנוע אדים עם קצב זרימה טוב.
    2. דגימות הומוגניזציה ברקמות הומוגניזר במהירות של 25 הרץ למשך 5 דקות. צנטריפוגה הדגימות ב 16,000 x g ב 4 °C (65 °F) במשך 10 דקות.
    3. לאסוף נפח שווה של supernatant לתוך צלחת 96-well-well. בחר את עוצמת הקול כך שתתאים לנפח הקטן ביותר של דיכלורומתאן: מתנול, על פני כל הדגימות. זה השבר האורגני.
    4. לאחסן את הכדור ב -80 °C (80 °F) כגיבוי. אחסן את התמצית האורגנית הנותרת בטמפרטורה של -80 °C כגיבוי. ייבשו את התמצית האורגנית במכסה המנוע של האדים למשך הלילה.
    5. להקפיא את צלחת 96-היטב מיובשת ב -80 °C (80 °F).

3. רכישת נתוני LC-MS

  1. יש לשפץ תמציות מימיות ואורגניות ל-60 μL כל אחד מ-50% מתנול + 2 מיקרומטר של סולפאדימתוקסין, ולשלב. Sonicate במשך 10 דקות; לאחר מכן, צנטריפוגה במשך 10 דקות ולהעביר את supernatant נקי 96 - wellplate. יש לאטום עם חותם צלחת ללא אזורים ולהניח את הצלחת בדגימה אוטומטית של LC.
    שים לב: השתמש בנהלי בטיחות מתאימים בעת טיפול בממסים, כולל טיפול בתוך מכסה מנוע אדים עם קצב זרימה טוב.
  2. חבר שלבים ניידים מתאימים למערכת LC (ראה טבלת חומרים).
    הערה: עבור מצב חיובי הפוך שלב LC, המחברים ממליצים LC-MS כיתה H2O + 0.1% חומצה פורמית כמו שלב נייד A ו LC-MS כיתה acetonitrile + 0.1% חומצה פורמית כמו שלב B נייד עם קצב זרימה של 0.5 מ"ל / דקה ושיפוע LC 7.5 דקות. שלבי מעבר הצבע מומלצים הם כפי שפורסמו בהפניה6: 0-1 דקות, 2% B; 1-2.5 דקות, עלייה ליניארית ל 98% B; 2.5-4.5 דקות, להחזיק ב 98% B; 4.5-5.5 דקות, ירידה ליניארית ל-2% B; 5.5-7.5 דק', החזק ב-2% B.
  3. ודא שהמכשיר נקי. כייל טרשת נפוצה במצב חיובי ושלילי.
  4. בצע הערכת ביצועים של טרשת נפוצה בהתאם לכלי.
  5. צור רצף ריצה של טרשת נפוצה.
    1. התחל עם 2 ריקים, 2 תקנים (6-mixes), ו 5 פקדי איכות משולבים (QC) בסדרת דילול, החל מ 2 μL של נפח הזרקה ולהגדיל צעדים עד נפח הזרקת μL 30.
    2. הפוך את סדר הדגימה לאקראי.
    3. אחרי כל 12 דגימות, להפעיל ריק, ולאחר מכן QC במאגר.
  6. חבר עמודת C8 LC (גודל חלקיקים של 1.7 מיקרומטר, גודל נקבוביות 100 Å, 50 x 2.1 מ"מ אורך x קוטר פנימי) ונטר אחר דליפות ולחץ גב מוגזם. פתור בעיות לפי הליך ההפעלה הסטנדרטי של המכשיר.
  7. הפעל את רצף ההפעלה של MS ואסוף נתוני LC-MS/MS תלויי נתונים.
    הערה: עבור מכשיר Q-Exactive Plus MS, השתמש ב-Heated Electrospray Ionization וברכישת MS2 תלוית נתונים (5 העליונים) במצב חיובי, רזולוציה של 70,000 עבור MS1 ו- 17,500 עבור MS2, יעד AGC של 1E6 עבור MS1 ו- 2E5 עבור MS2, IT מרבי של 100 אלפיות השנייה עבור MS1 ו- MS2, טווח סריקה ל- 100-1500 m/z עבור MS1, וחלון בידוד MS2 של 1 מ '/z. הגדר את גז הנדן ל-35, גז עזר ל-10 וסחף את הגז ל-0, תרסיס מתח ל-3.8 קילוואט, טמפרטורת נימי ל-320 מעלות צלזיוס, רמת RF של עדשת S ל-50 וטמפרטורת גז עזר ל-350 מעלות צלזיוס.
    1. אמת את איכות הנתונים: בדוק את החסר ההתחלתי (אשר היעדר פסגות עיקריות), תקנים (אשר את נוכחות הפסגות הצפויות ואת צורת השיא הסימטרית) ו- QCs (אשר את נוכחותם של פסגות צפויות, צורת שיא ועוצמת שיא צפויה).
    2. נטר מעת לעת את הפעלת MS במהלך רצף הריצה.
  8. לאחר סיום הריצה, בדוק את הנתונים עבור כל זריקות שלא נענו או שגיאות אחרות.
  9. אחסן את עמודת ה- LC כפי שהומלץ על-ידי היצרן. הסר ולאחסן דוגמאות ב -80 °C (80 °F).
  10. העלה נתונים גולמיים למאגר הנתונים.
    הערה: MassIVE (massive.ucsd.edu) מומלץ לאפשר את הקישור במורד הזרם לרשת מולקולרית עבור ביאורים מטבוליטים24,25.

4. עיבוד נתונים של LC-MS

  1. המר קבצים גולמיים לתבנית פתוחה ( .mzXML או .mzML) באמצעות MSConvert26.
    1. העלה נתונים גולמיים ונתוני mzXML או mzML למאגר הנתונים.
  2. צור טבלת תכונות. ישנם כלים מרובים לעשות זאת (MZmine, MS-DIAL, openMS, XCMS, וכו '27,28,29,30).
    הערה: MZmine מומלץ מכיוון שהוא חופשי, קוד פתוח, והוא יכול לייבא ישירות קבצי mzXML לאחר MSconvert, יש אפשרויות ממשק משתמש גרפי לעיבוד נתונים וניטור ההשפעה של בחירת פרמטרים, והוא יכול לייצא ישירות ל- GNPS עבור רשת מולקולרית24.
    הערה: בצע את תיעוד הכלים והשתמש בפרמטרים המתאימים לכלי הזמין. פרטים נוספים ניתן למצוא גם בהפניה 31.
    1. יצא טבלת תכונות בתבנית .csv.

5.3D ייצור דגמים

  1. ציירו ביד דגם תלת-ממד דה נובו כדי לשנות את קנה המידה בהתאם לשלבים המוזכרים להלן.
    1. צלם תמונה של איבר העניין.
    2. בצע את הפעולות הבאות בתוכנת SketchUp (ראה רשימת חומרים) כפי שצוין להלן.
      1. מחק את תמונת ברירת המחדל של אדם המופיעה בעת פתיחת התוכנה.
      2. לחץ על קובץ > ייבוא כדי לייבא תמונה של האיברים מעניינים.
      3. לחצו על הכלי קווים ובחרו באפשרות Freehand . השתמש בכלי העיפרון כדי לעקוב ולצייר את קווי המתאר של איברי העניין. הקפד לסגור את הקו על-ידי ציור כל הדרך חזרה לנקודת ההתחלה. לאחר סגירת הקו בהצלחה, האזור המצויר יופיע באופן אוטומטי מוצלל.
      4. בחרו בכלי דחיפה/משיכה ומשכו למעלה על האזור המוצל כדי להמיר את הציור מדו-ממד לתלת-ממד.
      5. מחיקת תמונת העוגב: בחר בלחצן מחק ולאחר מכן לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על התמונה ובחר מחק.
      6. יצא את הקובץ בתבנית .dae: > קבצים ייצוא > מודל תלת-ממד.
    3. שפר את הריאליזם של המודל לפי השלבים המוזכרים להלן.
      1. יבא את הדגם לתוכנת MeshLab (ראה טבלת חומרים): פתח את MeshLab ובחר קובץ > ייבוא רשת שינוי. בחר את מודל ה- .dae שנוצר בשלב הקודם. תפריט אפשרויות קדם-פתיחה יופיע. בחר אישור.
      2. בחר מסגרת תיל בתפריט העליון. לאחר מכן, בחר: מסננים > Remeshing, פישוט ושחזור > משטחי חלוקת משנה: נקודת אמצע. השאר את כל הערכים כברירת מחדל ובחר החל פעמיים. בדוק באופן חזותי את תצוגת מסגרת התיל של המודל כדי לוודא שהוא מרושת היטב. סגור את התפריט המוקפץ.
      3. יצא את המודל בתבנית .stl: קובץ > יצא רשת שינוי כ ולאחר מכן בחר תבנית קובץ STL ( *.stl) בתפריט הנפתח קבצים מסוג . לחץ על שמור. בחרו ' אישור ' בתפריט הנפתח הבא.
      4. פתח את תוכנת Meshmixer (ראה טבלת חומרים). לחץ על לחצן ייבוא (+). בחר את קובץ ה - .stl שנוצר בשלב הקודם. השתמשו במברשות פיסול > > Drag and Sculpt > מברשות > כלי ניפוח כדי לשלוף את משטחי הדגם שיש לעגל.
      5. לאחר שלמודל יש את המראה הרצוי, שמור אותו בתבנית .stl: קובץ > ייצוא. תן שם לקובץ כרצונך ובחר בתבנית בינארית STL ( *.stl) בתפריט הנפתח שמור כסוג. לחץ על שמור. אם מופיע תפריט מוקפץ, לחץ על המשך.

6. 'ili יצירת עלילה

  1. השג קואורדינטות למיקומים במודל התלת-ממד התואמות לאתרי הדגימה.
    1. פתחו את דגם התלת-ממד משלב 5.1.3.5 בתוכנת MeshLab : קבצים > ייבוא רשת שינוי. בחר את המודל שנוצר בשלב 5.1.3.5. לחץ על אישור בחלון המוקפץ עיבוד לאחר הפתיחה .
    2. לקבלת קואורדינטות x, y ו- z עבור כל נקודת דגימה: בחרו בכלי PickPoints ולחצו באמצעות לחצן העכבר הימני במרווחי זמן קבועים על פני השטח של דגם התלת-ממד. לאחר בחירת כל הקואורדינטות הרצויות, לחץ על לחצן השמירה העליון בחלון המוקפץ טופס .
      הערה: פעולה זו תייצא את הקואורדינטות בתבנית קובץ .pp ניתן לפתוח קובץ זה בתוכנת גיליון אלקטרוני.
    3. בתוכנת גיליון אלקטרוני: פתח את קובץ ה- .pp שנוצר בשלב 6.1.2. התאם תצוגת נתונים באמצעות נתונים > טקסט לעמודות > מופרדים. לחץ על הבא ולאחר מכן בחר רווח ולחץ על סיום.
    4. עצב מחדש כך שרק ערכים מספריים יישארו בתאי הגיליון האלקטרוני על-ידי בחירה באפשרות בית > חפש ובחר > החלף. בתיבה חפש את, הזן: y =". השאר את התיבה החלף ב ריקה. לחץ על החלף הכל ולאחר מכן על אישור. חזור על הפעולה עבור x=" ועבור z=" ועבור " />. הערכים מוכנים כעת לשלב 6.2.
  2. צור את טבלת התכונות 'ili'. שיטה זו הותאמה מתוך Reference16.
    1. בתוכנת גיליון אלקטרוני, בנה את טבלת התכונות. שורות תואמות לכל מיקום ועמודות לנתונים.
      הערה: העמודות הראשונות חייבות להיות שם המיקום (שם לדוגמה), ואחריהן קואורדינטות x, y ו- z של נקודות הדגימה שהושגו בשלב 6.1.2 (עם כותרות עמודות x, y, z). הגיס החמישי חייב להיות תחת הכותרת "רדיוס".
    2. הדבק את שפע תכונות המטה-נתונים והמטבוליט המתאימות בעמודות הגיליון האלקטרוני הבאות.
    3. בעמודה "רדיוס", הזן את הגודל הרצוי של כתמי הדגימה שיש לדמיין בדגם. קבע את הערכים עבור רדיוס באופן אמפירי: הזן 1 כברירת מחדל ולאחר מכן הערך אם יש להתאים רדיוס או קואורדינטות בשלב 6.3. שמור את הקובץ בתבנית .csv (קובץ > שמירה בשם) ולאחר מכן בחר CSV (מופרד באמצעות פסיקים) (*.csv) בתפריט הנפתח. תן שם לקובץ כרצונך. לחץ על שמור.
  3. פתח את הנתונים ב- 'ili (תוכנה שפותחה על ידי 16).
    1. פתחו את אתר 'אילי' (ili.embl.de). בחר משטח. גררו ושחררו את דגם התלת-ממד שנוצר בחלון הדפדפן. גרור ושחרר את טבלת התכונות שנוצרה באותו חלון דפדפן.
    2. השתמשו במקרא בפינה השמאלית התחתונה כדי להקרין את עמודת הנתונים הרצויה במודל התלת-ממד. ודא שהכתמים והרדיי שנבחרו בשלב 6.2.1 תואמים לאתרי הדגימה. במידת הצורך, התאם ערכים בטבלת התכונות או בחר קואורדינטות נוספות ב- MeshLab (ראה שלב 6.1.2).
      הערה: ניתן לשפר את הפריט החזותי גם על-ידי בחירה באטימות הגבול של כתמים > והגדרת המחוון לערך המקסימלי שלו.
    3. בחר ברצף כל עמודת נתונים כדי להעריך את ההתפלגות של תכונת מטבוליט זו בדגם התלת-ממד.
      הערה: גישה זו יכולה לשמש גם כדי לדמיין רק תכונות מטבוליט ספציפיות של עניין, למשל, אלה עם p < 0.05 או שינוי קיפול מסוים בין דגימות נגועות ולא נגועות, כפי שנקבע בכלי ניתוח סטטיסטיים חיצוניים. ניתן לבחור תכונות שניתן להציגן באופן חזותי גם מחוץ ל- 'ili באמצעות גישות למידת מכונה כגון יער אקראי.
  4. בצע תצוגה חזותית של נתונים ליניאריים/יומן רישום בהתאם לשלבים המוזכרים להלן.
    1. באמצעות הכרטיסיה מיפוי בפינה השמאלית העליונה של הדף, בחר ליניארי או לוגריתמי בתפריט הנפתח קנה מידה .
    2. הגדר קנה מידה זהה עבור כל התוויות אם תדמיין תכונות מרובות.
      הערה: האתר בוחר באופן אוטומטי את המינימום והמקסימום עבור כל עמודת נתונים להצגה.
    3. לקביעת קנה המידה באופן ידני, בטלו את הבחירה באפשרות 'מינימום/מרבי אוטומטי ' והזינו את קנה המידה הרצוי. כל הנתונים יוצגו כעת באותו קנה מידה.
  5. שנה את סרגל הצבעים של הנתונים (גווני אפור, כחול-לבן-אדום וכו').
    1. שנה את סרגל הצבעים לערכת הצבעים הרצויה בתפריט מיפוי באמצעות התפריט הנפתח מפת צבע . ודא שערכת הצבעים שנבחרה ידידותית לעיוור צבעים.
  6. לשינוי הצבע של דגם התלת-ממד או צבע הרקע, השתמשו באפשרויות 'צבע ורקע' בתפריט 'תלת-ממד'.
  7. הסתר צירים תלת-ממדיים על-ידי ביטול הבחירה בתיבה הצג את המקור תחת התפריט 'תלת-ממד'.
  8. שמור את התמונה על-ידי צילום מסך, באמצעות כלי החיתוך, או מקש הקיצור Crtl + S עבור Windows או Linux ו figure-protocol-19798- + S ב- OS X.

תוצאות

מספר תכונות המטבוליט המתקבלות תלוי בסוג הרקמה המנותח ובפרמטרים של עיבוד נתונים. לדוגמה, פרוטוקול זה שימש כדי לנתח את ההשפעה המרחבית של זיהום T. cruzi על מטבולום מערכת העיכול במודל עכבר של זיהום T. cruzi. בעבודה קודמת, זכר C3H / HeJ הוזרקו תוך-פרטני עם 1,000 CL + לוק T. קרוזי טפילים32,6. בעלי חיים הומתו 12 או 89 ימים לאחר ההדבקה, וניתוח קרטוגרפיה כימית של 13 קטעים רציפים של מערכת העיכול בוצע כמתואר בפרוטוקול זה. ניתוח זה הוביל לטבלת תכונות של 5,502 תכונות, אשר הוצגו לאחר מכן לתלת-ממד באמצעות השלבים המתוארים בפרוטוקול זה. גישה זו מאפשרת הדמיה של תכונות מטבוליט בבעלי חיים בודדים גבוהים באתר של עומס טפילים גבוה (קינורנין, איור 2B לעומת עומס טפילים, איור 2A), של מטבוליטים עם חלוקה דיפרנציאלית בין אזורי רקמות (גלוטמין, איור 2C) ותכונות מטבוליט שנמצאות ברמות דומות על פני מעיים קטנים וגדולים (LPE 16:0 איור 2D ). Kynurenine נבחר להדמיה בגלל הקשר הידוע שלה דלקת ופרסומים קודמים על היכולת של מטבוליטים שמקורם kynurenine נגזר לווסת T. cruzi load33. מודלים אקראיים של למידת מכונה המבוססים על יער חשפו בעבר קשר בין רמות קינורנין למצב זיהום6. גלוטמין נבחר להדמיה המבוססת על פרסומים קודמים המדגימים קשר בין זמינות אין ויטרו גלוטמין לבין רגישות לתרופה T. cruzi34. התפלגות דיפרנציאלית אושרה באמצעות רגרסיה לוגיסטית, p < 0.05. LPE 16:0 נבחר לאחר בדיקה חזותית של הנתונים כדי לגלות תכונות מטבוליט שנמצאו ברמות דומות באתרי רקמות שונים.

figure-results-1717
איור 1: מבט כולל על הפרוטוקול. האיור נוצר עם BioRender.com. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2112
איור 2: ניתוח קרטוגרפיה כימית. עכברי C3H/HeJ זכרים הוזרקו תוך-פרטני עם 1,000 CL +luc T. cruzi טפילים32. בעלי חיים הומתו 12 או 89 ימים לאחר ההדבקה, ומערכת העיכול נאספה וחתכה באופן שיטתי (שלב 1)6. מטבוליטים חולצו כמו בשלב 2 ונותחו על ידי LC-MS / MS.3D יצירת הדגם בוצעה באמצעות תוכנת SketchUp (שלב 5), והנתונים שורטטו בתלת-ממד כמו בשלב 6. (A) התפלגות טפילים בעכבר מסוים, 12 ימים לאחר ההדבקה. (B) התפלגות מטבוליט קינורנין באותו עכבר, 12 ימים לאחר ההדבקה. (ג) התפלגות גלוטמין ממוצעת על פני עכברים נגועים, 89 ימים לאחר ההדבקה. (D) רמות דומות של m /z 454.292 זמן שמירה 2.929 דקות, ביאור כמו 2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (LPE 16:0), באותו עכבר כמו A ו- B במעי הדק והמעי הגס. דגימות ונתונים נוצרו ב- 6. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

הבנת זיהומים trypanosomatid חיוני כדי להנחות פיתוח תרופות חדשניות וגישות טיפול. שיטת קרטוגרפיה כימית זו צפויה באופן ייחודי לספק תובנות מעשיות על הקשר בין חילוף החומרים לבין פתוגנזה מחלת טריפנוסומטיד, ובכך לענות על צורך תרגומי זה.

רק ממיסים בדרגת LC-MS מומלצים במהלך מיצוי מטבוליט וניתוח טרשת נפוצה, כדי להפחית את זיהום הרקע. זיהום פולימרי35, המופק בדרך כלל מסרט פרפין ו/או פלסטיק אחר36,37,38, יש להימנע במידת האפשר. Parafilm, בפרט, לא חייב לשמש. היבטים אלה חיוניים מאז איכות הנתונים LC-MS תלויה בחומרים המשמשים במהלך הכנת מדגם והפקת מטבוליט. יש להבטיח את איכות הנתונים לפני יצירת תוויות 'ili'. בנוסף, יצירת מפות מטבולומיקה מרחבית מקיפות אלה דורשת איסוף של כל דגימות הרקמות הסמוכות ומיצוי מטבוליטים מכל הדגימות שנאספו כדי למנוע פערים במפות אלה. נהלי גבייה, לוגיסטיקה של מיצוי מטבוליט וניתוח LC-MS, ולכן יש לשקול ולתכנן עלויות בהתאם.

ניתן לשנות פרוטוקול זה כדי לענות על צרכי המשתמש בדרכים מרובות. לדוגמה, הקוטביות והמסיסות של ממיסים המשמשים במהלך מיצוי מטבוליט ישפיעו על מה מטבוליטים מזוהים39. כדי למקסם את המגוון של תכונות מטבוליט שזוהו עבור ניתוחי קרטוגרפיה כימית לא ממוקדת, שילוב שלבי חילוץ מרובים וממסים מומלץ. לדוגמה, שיטה זו משתמשת dichloromethane, מתנול, ומים כמו ממסים מיצוי כי הם מאפשרים זיהוי מדויק של מולקולות לא קוטביות וקוטביות20,40. עם זאת, ממיסים אלה אינם מתאימים באופן אוניברסלי לכל ניסוי טרשת נפוצה, והחוקרים צריכים לבחור ממיסים לחילוץ בהתבסס על מטרות הפרויקט שלהם. כמו כן, ניתן להשתמש בתנאי LC-MS/MS שונים, כגון החלפת כרומטוגרפיה הפוכה בשלב עם כרומטוגרפיה פאזה רגילה. עמודות חלופיות יכולות לשמש גם לאיסוף נתונים בשלב הפוך במקום כרומטוגרפיה C8, אם כי מבחינה אמפירית, כרומטוגרפיה C8 הוא חזק יותר שומנים ברקמות ויש לו תדר סתימה נמוך יותר. מבחינה מושגית, פרוטוקולים אלה יכולים להיות מיושמים גם על שיטות ספקטרומטר מסה אחרות כגון ספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה-מסה, וכו '.

גישה חלופית היא הדמיית ספקטרומטריית מסה. ואכן, שלא כמו גישות הדמיית ספקטרומטר מסה, ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית אינה משמרת מטבעה מידע מרחבי10. קרטוגרפיה כימית מתקרבת לגשר על פער זה על ידי הכללת מיקום דגימה בזמן תפיסת הפרויקט, במטה-נתונים לדוגמה ובשלבי עיבוד נתונים. כוחה של גישת קרטוגרפיה כימית זו, שלא כמו הדמיית ספקטרומטריית מסה, היא היכולת לספק ביאורים בטוחים (יוזמת תקני מטבולומיקה רמה 1 או רמת 2 ביאורים confidence41), בניגוד להדמיית ספקטרומטריית מסה שבה עיקר היישומים מסתמכים על מסה מדויקת רק לביאור. הדמיית ספקטרומטריית מסה תאפשר מיפוי מרחבי מגורען עדין, לפעמים עד לרמת התא הבודד, למשל,42,43. לעומת זאת, גישות קרטוגרפיה כימית מאפשרות מיפוי חוצה איברים בקנה מידה גדול של התפלגות מטבוליטים ללא צורך בכישורי קריוזקציה מיוחדים מאוד של בעלי חיים שלמים. קרטוגרפיה כימית מספקת ראיות משלימות לגישות התמלול המרחביות הרבות המתפתחות, למשל,44, עם היתרון של התמקדות בשכבת 'omics הקרובה ביותר לפנוטיפ'45. שיטות חלופיות לכימות עומס טפילים כוללות מדידת ביולומינציה בזמן איסוף המדגם6. ניתן גם לאסוף מקטעים עדינים כדי לאפשר מיקרוסקופיה קונפוקלית או אלקטרונית כדי להעריך את נטל הטפילים המקומי ואת הנזק לרקמות. הומוגניאט המים, המשמש לכימות ציטוקינים בפרוטוקול זה ובפרסומים קודמים13, יכול לשמש גם לכימות סמנים מבוססי חלבון של נזק לרקמות.

ישנן גם דרכים מרובות להשיג מודלים תלת-ממדיים המתאימים להתוויית נתוני LC-MS המתקבלים. בנוסף לשיטה המוצעת כאן, ניתן לרכוש דגמים המיוצרים מראש מספקים מקוונים שונים. ודא שתנאי השימוש תואמים לשימוש המיועד, במיוחד בנוגע לפרסום. מודלים עבור איברים גדולים ניתן ליצור דה נובו באמצעות סורקים 3D על פי הוראות הסורק. קיימות חלופות כגון MATLAB להפקה והדמיה של מודלים תלת-ממדיים עבור קרטוגרפיה כימית46, אך הם יושמו בעיקר לפני הפיתוח של 'ili16. MATLAB היא חבילת כלים לניתוח ותכנות נתונים המציעה מגוון רחב של יישומים בתחומים רבים. עם זאת, MATLAB אינו חופשי ולא קוד פתוח, והוא דורש היכרות עם ממשקי MATLAB, במיוחד בהתחשב MATLAB לא פותח לעיבוד נתוני ספקטרומטריית מסה. החלופות של שיטה מוצעת זו, כלומר SketchUp, Meshlab ו- 'ili, נגישות באופן חופשי, ידידותיות למשתמש, ומציעות פונקציות דומות כמו MATLAB למטרות קרטוגרפיה כימית.

שיטה זו היא חזקה לגבי הכנת מדגם ומיצוי מטבוליט. פתרון בעיות נחוץ לרוב בשלב רכישת הנתונים של LC-MS. זה מעבר להיקף של מאמר זה. הקוראים מופנים לפרסומים מצוינים על פתרון בעיות של רכישת נתונים של LC-MS, כולל 20,47. כמו כן, המורכבות של ביאור מטבוליט הם מעבר להיקף ההתמקדות של שיטה זו ביצירת מודל 3D. הפניות שימושיות בנושא זה כוללות 24,25,48,49.

בעוד שיטה זו בוחנת ביעילות פתוגנזה המחלה, יש מגבלות לגישה זו, שחלקם נפוצים על פני כל ניסוי מטבולומיקה. מגבלה אחת כזו היא שיעור הביאור הנמוך של תכונות LC-MS50, אשר מותנה בזמינות ובאיכות של ספריות ספקטרליות התייחסות. מגבלה נוספת היא כי פרוטוקול זה אינו משמר mRNA בשל חוסר תאימות של ריאגנטים שימור RNA כגון RNAlater עם ניתוח LC-MS / MS. עם זאת, איכות החלבון מתאימה לניתוחים במורד הזרם ולכן יכולה להחליף ניתוחים מבוססי mRNA.

גישה של קרטוגרפיה כימית לזיהום פתוגנזה משקפת ישירות כיצד זיהומים חיידקיים, ויראליים או טפיליים מתפתחים במערכות איברים וגורמים למחלות מקומיות. ניתוח תת-דגימות אזוריות אלה ויצירת מודלים תלת-ממדיים מעבירים בסופו של דבר כיצד מטבוליטים פועלים במרחב התלת-ממדי, ושופכים אור על ממדים מרחביים אלה שלא זוהו בעבר של ביולוגיה מולקולרית. באמצעות פרוטוקול זה, למשל, לוקליזציה מטבוליט הושווה עומס טפילים Trypanosoma cruzi. התוצאות הבהירו את הקשר בין הפתוגן לרקמת המארח וגם הדגימו את הדינמיקה המטבולית של התקדמות סימפטום מחלת צ'אגס6. שיטות קרטוגרפיה כימיות יושמו גם בנושאים שונים, כגון אינטראקציה סביבתית שנבנתה על ידי בני אדם51,52,53, ההרכב הכימי של מערכות איברים כמו עור אנושי46 וריאות54, וחילוף חומרים של צמחים ואינטראקציות סביבה55. יישומים עתידיים יכולים לכלול הערכת סובלנות וחוסן למחלות מקומיות, או את הקשר בין רמות מטבוליט מקומיות, טרופיזם פתוגן וטרופיזם של מחלות במודלים שמעבר לזיהום טריפנוסומטיד. גישה זו צריכה להיות גם ישימות רחבה כדי להרחיב את פרוטוקולי הפרמקוקינטיקה הנוכחיים, כדי להעריך את הקשר בין רמות התרופה רקמות מקומיות חילוף החומרים של התרופה לעומת הקשר מטבולי הכולל, נזק לרקמות, אישור פתוגן. בסך הכל, קרטוגרפיה כימית מאפשרת מחקרים ייחודיים של הפצות מטבוליטים בסוגי מדגם שונים, עם יישומים כולל פתוגנזה של מחלות, בריאות האדם, אינטראקציות בין האדם לסביבה ודינמיקה מיקרוביאלית.

Disclosures

אין ניגוד אינטרסים לדווח.

Acknowledgements

לורה-איזבל מקול, PhD, מחזיקה חוקרת בפרס פתוגנזה למחלות זיהומיות מקרן בורוז וולקום. המחברים מבקשים עוד להכיר בתמיכתו של מספר פרס NIH R21AI1488886, מענק פיילוט ממרכז אוקלהומה למחלות נשימה וזיהום (OCRID) תחת מספר הפרס NIH P20GM103648, וקרנות סטארט-אפ מאוניברסיטת אוקלהומה (ל- LIM). התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המממנים. המחברים גם רוצים להודות למפתחים של הכלים המשמשים בפרוטוקול זה. כל הפרסומים הרלוונטיים צוטטו, במידת הצורך.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL Eppendorf tubesNANAany brand, as available
1 L bottle, pyrexNANAany brand, as available
1 L graduated cylinder, pyrexNANAany brand, as available
2 mL SafeLock Eppendorf tubesVWR20901-540use the appropriate tube model for the available tissue homogenizer
3D model (de-novo generated according to protocol steps, or purchased)NANAas appropriate for system under investigation
5 mm stainless steel beadQiagen69989
96 well plateFisher3252449
AATTCCTCCAAGCAGCGGATA primerNANAany brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007).
analytical balanceNANAany brand, as available
ASTCGGCTGATCGTTTTCGA primerNANAany brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007).
benchtop centrifuge with microcentrifuge, falcon tube and 96-well-plate capacityNANAany brand, as available
biosafety cabinetNANAclass II, type A2; any brand, as available
CAGCAAGCATCTATGCACTTAG
ACCCC primer		NANAany brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003).
cameraNANAany brand, as available. A cellphone camera is adequate for this protocol
chemiluminescent-capable imaging systemNANAany system, as available
cotton ballsNANAany brand, as available
cryoglovesVWR97008-208replace with any brand, as available
dissection scissorsNANAany brand, as available
dry iceNANAany brand, as available
extra-length forcepsNANAany brand, as available
flammable-grade refrigeratorNANAany brand, as available
freezer storage boxes for microcentrifuge tubesNANAany brand, as available
fume hoodNANAany brand, as available
high-resolution mass spectrometerNANAany brand, as available, such as ThermoFisher Q-Exactive Plus (catalog number 0726030)
ice bucketNANAany brand, as available
ili softwareili.embl.deNA
isofluraneCovetrus29405
large tupperwareNANAany brand, as available; large enough to comfortably contain mouse, cotton ball
LC-MS grade acetonitrileFisher OptimaA955-4
LC-MS grade dicholoromethaneFisher OptimaD151-4
LC-MS grade formic acidFisher OptimaA11750
LC-MS grade methanolFisher OptimaA456-4
LC-MS grade waterFisher OptimaW64
liquid chromatography columnPhenomenex00B-4499-ANmay be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest
liquid chromatography column guard cartridgePhenomenexAJ0-8784may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest
liquid chromatography column guard cartridge holderPhenomenexAJ0-9000may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest
liquid nitrogenNANAany brand, as available
luciferinGoldbioLUCK-1G
MeshLab softwarehttps://www.meshlab.net/NA
Meshmixer softwarehttps://www.meshmixer.com/NA
MS calibrantNANAappropriate one for available instrument
MS data processing softwareNANAmultiple options available; authors recommend MZmine
MSConvert softwarehttp://proteowizard.sourceforge.net/NA
NanodropThermoFisherND-ONE-Wother nanodrop models are also suitable
p1000 pipet tipsNANAuse the appropriate brand to fit available pipettors
p1000 pipettorNANAany brand, as available
p20 pipette tipsNANAuse the appropriate brand to fit available pipettors
p20 pipettorNANAany brand, as available
p200 pipette tipsNANAuse the appropriate brand to fit available pipettors
p200 pipettorNANAany brand, as available
personal protective equipment (gloves, lab coat, safety glasses/goggles; faceshield)NANAany brand, as available
Q-Plex Mouse Cytokine - Screen (16-Plex)Quansys biosciences110949MScan replace with other protein-based cytokine assays such as other commercial cytokine ELISA kits
Quick-DNA Miniprep Plus Kit (200 preps)ZymoD4069replace with any brand of mammalian DNA extraction kit, as available
real-time thermocyclerNANAany brand, as available
salt shaker or tea infuserNANAany brand; to contain isoflurane-soaked cotton ball and prevent contact with mouse skin
SketchUp softwarehttps://www.sketchup.com/NA
specimen forcepsNANAany brand, as available
speedvac with microcentrifuge tube and 96-well-plate capacityNANAany brand, as available
spreadsheet softwarehttps://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excelNAcan replace with other spreadsheet management software, as applicable
sulfachloropyridazineSigmaS9882-100G
sulfadimethoxineSigmaS7007-10G
Sybr green qPCR reaction mixFisherA25780can replace with other Sybr green qPCR reaction mixes, as desired
TCCCTCTCATCAGTTCTAT
GGCCCA primer		NANAany brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003).
tissue homogenizerNANAany brand, as available; for example, Qiagen TissueLyser II, catalog number 85300, with TissueLyser Adapter Set (2 x 24), catalog number 69982
tissue samplesNANAfrom appropriate infection model
TissueLyser single-bead dispenserQiagen69965
UHPLCNANAany brand, as available, such as ThermoFisher Vanquish (catalog number IQLAAAGABHFAPUMBHV)
ultra-low temperature freezer (-80)NANAany brand, as available
ultrasonic bathNANAany system, as available
wet iceNANAany brand, as available
zone-free sealing filmVWR 490007-390

References

  1. McCall, L. -. I., et al. Adaptation of Leishmania donovani to and visceral environments: in vivo selection and proteomic analysis. Journal of Proteome Research. 14 (2), 1033-1059 (2015).
  2. McCall, L. -. I., Zhang, W. -. W., Matlashewski, G. Determinants for the development of visceral leishmaniasis disease. PLoS Pathogens. 9 (1), 1003053 (2013).
  3. de Castro Neto, A. L., da Silveira, J. F., Mortara, R. A. Comparative analysis of virulence mechanisms of trypanosomatids pathogenic to humans. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 669079 (2021).
  4. Franco, J. R., Simarro, P. P., Diarra, A., Jannin, J. G. Epidemiology of human African trypanosomiasis. Clinical Epidemiology. 6, 257-275 (2014).
  5. Ottilie, S., et al. Rapid chagas disease drug target discovery using directed evolution in drug-sensitive yeast. ACS Chemical Biology. 12 (2), 422-434 (2017).
  6. Hossain, E., et al. Mapping of host-parasite-microbiome interactions reveals metabolic determinants of tropism and tolerance in Chagas disease. Science Advances. 6 (30), (2020).
  7. Parab, A. R., McCall, L. -. I. Tryp-ing up metabolism: Role of metabolic adaptations in kinetoplastid disease pathogenesis. Infection and Immunity. 89 (4), (2021).
  8. Lewis, C. M., McCall, L. -. I., Sharp, R. R., Spicer, P. G. Ethical priority of the most actionable system of biomolecules: the metabolome. American Journal of Physical Anthropology. 171 (2), 177-181 (2020).
  9. Liu, Z., Ulrich vonBargen, R., McCall, L. I. Central role of metabolism in Trypanosoma cruzi tropism and Chagas disease pathogenesis. Current Opinion in Microbiology. 63, 204-209 (2021).
  10. Newsom, S. N., McCall, L. -. I. Metabolomics: Eavesdropping on silent conversations between hosts and their unwelcome guests. PLoS Pathogens. 14 (4), 1006926 (2018).
  11. Wishart, D. S., et al. HMDB: the Human Metabolome Database. Nucleic Acids Research. 35, 521-526 (2007).
  12. Dean, D. A., et al. Spatial metabolomics identifies localized chemical changes in heart tissue during chronic cardiac Chagas disease. PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (10), 0009819 (2021).
  13. McCall, L. -. I., et al. Mass spectrometry-based chemical cartography of a cardiac parasitic infection. Analytical Chemistry. 89 (19), 10414-10421 (2017).
  14. Hoffman, K., et al. Alterations to the cardiac metabolome induced by chronic infection relate to the degree of cardiac pathology. ACS Infectious Diseases. 7 (6), 1638-1649 (2021).
  15. Parab, A. R., et al. Dysregulation of glycerophosphocholines in the cutaneous lesion caused by Leishmania major in experimental murine models. Pathogens. 10 (5), 593 (2021).
  16. Protsyuk, I., et al. 3D molecular cartography using LC-MS facilitated by Optimus and 'ili software. Nature Protocols. 13 (1), 134-154 (2018).
  17. McCall, L. -. I., et al. Targeting ergosterol biosynthesis in Leishmania donovani: Essentiality of Sterol 14alpha-demethylase. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003588 (2015).
  18. Tear, W. F., et al. Selectivity and physicochemical optimization of repurposed Pyrazolo[1,5-]pyridazines for the treatment of human African trypanosomiasis. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (2), 756-783 (2020).
  19. Klug, D. M., et al. Hit-to-lead optimization of benzoxazepinoindazoles as human African trypanosomiasis therapeutics. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (5), 2527-2546 (2020).
  20. Want, E. J., et al. Global metabolic profiling of animal and human tissues via UPLC-MS. Nature Protocols. 8 (1), 17-32 (2013).
  21. Piron, M., et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta Tropica. 103 (3), 195-200 (2007).
  22. Cummings, K. L., Tarleton, R. L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and Biochemical Parasitology. 129 (1), 53-59 (2003).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  24. Nothias, L. -. F., et al. Feature-based molecular networking in the GNPS analysis environment. Nature Methods. 17 (9), 905-908 (2020).
  25. Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with global natural products social molecular networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
  26. Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  27. Tsugawa, H., et al. MS-DIAL: data-independent MS/MS deconvolution for comprehensive metabolome analysis. Nature Methods. 12 (6), 523-526 (2015).
  28. Sturm, M., et al. OpenMS - an open-source software framework for mass spectrometry. BMC Bioinformatics. 9, 163 (2008).
  29. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 395 (2010).
  30. Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification. Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).
  31. . FBMN with MZmine Available from: https://ccms-ucsd.github.io/GNPSDocumentation/featurebasedmolecularnetworking-with-mzmine2/ (2021)
  32. Lewis, M. D., et al. Bioluminescence imaging of chronic Trypanosoma cruzi infections reveals tissue-specific parasite dynamics and heart disease in the absence of locally persistent infection. Cellular Microbiology. 16 (9), 1285-1300 (2014).
  33. Knubel, C. P., et al. 3-Hydroxy kynurenine treatment controls T. cruzi replication and the inflammatory pathology preventing the clinical symptoms of chronic Chagas disease. PloS One. 6 (10), 26550 (2011).
  34. Dumoulin, P. C., Vollrath, J., Tomko, S. S., Wang, J. X., Burleigh, B. Glutamine metabolism modulates azole susceptibility in amastigotes. eLife. 9, (2020).
  35. Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
  36. Weaver, R., Riley, R. J. Identification and reduction of ion suppression effects on pharmacokinetic parameters by polyethylene glycol 400. Rapid Communications in Mass Spectrometry: RCM. 20 (17), 2559-2564 (2006).
  37. Larger, P. J., Breda, M., Fraier, D., Hughes, H., James, C. A. Ion-suppression effects in liquid chromatography-tandem mass spectrometry due to a formulation agent, a case study in drug discovery bioanalysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 39 (1-2), 206-216 (2005).
  38. Furey, A., Moriarty, M., Bane, V., Kinsella, B., Lehane, M. Ion suppression; a critical review on causes, evaluation, prevention and applications. Talanta. 115, 104-122 (2013).
  39. Lu, W., et al. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  40. Masson, P., Alves, A. C., Ebbels, T. M. D., Nicholson, J. K., Want, E. J. Optimization and evaluation of metabolite extraction protocols for untargeted metabolic profiling of liver samples by UPLC-MS. Analytical Chemistry. 82 (18), 7779-7786 (2010).
  41. Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).
  42. Rappez, L., et al. SpaceM reveals metabolic states of single cells. Nature Methods. 18 (7), 799-805 (2021).
  43. Yang, B., Tsui, T., Caprioli, R. M., Norris, J. L. Sample preparation and analysis of single cells using high performance MALDI FTICR mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 2064, 125-134 (2020).
  44. Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics. Nature Reviews. Genetics. 22 (10), 627-644 (2021).
  45. Patti, G. J., Yanes, O., Siuzdak, G. Innovation: Metabolomics: the apogee of the omics trilogy. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (4), 263-269 (2012).
  46. Bouslimani, A., et al. Molecular cartography of the human skin surface in 3D. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 2120-2129 (2015).
  47. Dudzik, D., Barbas-Bernardos, C., García, A., Barbas, C. Quality assurance procedures for mass spectrometry untargeted metabolomics. A review. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 147, 149-173 (2018).
  48. Alseekh, S., et al. Mass spectrometry-based metabolomics: a guide for annotation, quantification and best reporting practices. Nature Methods. 18 (7), 747-756 (2021).
  49. Chaleckis, R., Meister, I., Zhang, P., Wheelock, C. E. Challenges, progress and promises of metabolite annotation for LC-MS-based metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 55, 44-50 (2019).
  50. Viant, M. R., Kurland, I. J., Jones, M. R., Dunn, W. B. How close are we to complete annotation of metabolomes. Current Opinion in Chemical Biology. 36, 64-69 (2017).
  51. Kapono, C. A., et al. Creating a 3D microbial and chemical snapshot of a human habitat. Scientific Reports. 8 (1), 3669 (2018).
  52. Petras, D., et al. Mass spectrometry-based visualization of molecules associated with human habitats. Analytical Chemistry. 88 (22), 10775-10784 (2016).
  53. McCall, L. -. I., et al. Analysis of university workplace building surfaces reveals usage-specific chemical signatures. Building and Environment. 162, 106289 (2019).
  54. Garg, N., et al. Three-dimensional microbiome and metabolome cartography of a diseased human lung. Cell Host & Microbe. 22 (5), 705-716 (2017).
  55. Floros, D. J., et al. Mass spectrometry based molecular 3D-cartography of plant metabolites. Frontiers in Plant Science. 8, 429 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

179

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved