JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает шаги по созданию 3D-модели распределения метаболитов во время трипаносоматидной инфекции, включая сбор образцов, извлечение метаболитов, обзор сбора данных жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии, генерацию 3D-моделей и, наконец, визуализацию данных.

Аннотация

Патогенный тропизм и тропизм болезни относятся к местам ткани, избирательно колонизированным или поврежденным патогенами, что приводит к локализованным симптомам заболевания. К заразным человеком трипаносоматидным паразитам относятся Trypanosoma cruzi, возбудитель болезни Шагаса; Trypanosoma brucei, возбудитель сонной болезни; и виды Лейшмании , возбудители лейшманиоза. В совокупности они затрагивают 20 миллионов человек по всему миру. Эти паразиты проявляют специфический тропизм: сердце, пищевод, толстая кишка для T. cruzi, жировая ткань, поджелудочная железа, кожа, кровеносная система и центральная нервная система для T. brucei, кожа для дермотропных штаммов leishmania и печень, селезенка и костный мозг для висцеротропных штаммов Leishmania . Поэтому пространственная перспектива имеет важное значение для понимания патогенеза трипаносоматидной болезни. Химическая картография генерирует 3D-визуализации плотности малых молекул, генерируемых с помощью жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии, по сравнению с микробиологическими и иммунологическими параметрами. Данный протокол демонстрирует, как химическая картография может быть применена для изучения патогенных процессов при трипаносоматидной инфекции, начиная с систематического забора тканей и экстракции метаболитов с последующим сбором данных жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии и заканчивая генерацией 3D-карт распределения метаболитов. Этот метод может быть использован для нескольких исследовательских вопросов, таких как потребности в питательных веществах для колонизации тканей T. cruzi, T. brucei или Leishmania, иммунометаболизм в местах инфекции и взаимосвязь между местным метаболическим возмущением тканей и клиническими симптомами заболевания, что приводит к всестороннему пониманию патогенеза трипаносоматидной болезни.

Введение

Паразиты Trypanosomatid состоят из видов Leishmania, африканских трипаносом (Trypanosoma brucei) и американских трипаносом (Trypanosoma cruzi). Простейшие лейшмании вызывают лейшманиоз, который включает в себя самозаживление и самоограничение локализованный кожный лейшманиоз, слизисто-кожный лейшманиоз, при котором повреждаются слизистые ткани рта, носа и горла, и висцеральный лейшманиоз с паразитарным тропизмом к висцеральным органам, вызывающим лихорадку и гепатоспленомегалию1,2. T. brucei вызывает африканский трипаносомоз человека (HAT), также известный как сонная болезнь, в основном зарегистрированный в африканских странах3. Клинические признаки и симптомы включают гепатоспленомегалию, лихорадку, головную боль, скелетно-мышечные боли, лимфаденопатии и анемию в гемо-лимфатической стадии, когда паразиты локализуются в кровотоке и лимфатической системе. За этим следует менингоэнцефалитная стадия, когда паразиты локализуются в центральной нервной системе и вызывают нарушение сна, изменение поведения и, в конечном итоге, смертельную кому4. T. cruzi вызывает болезнь Шагаса, эндемичную в Северной и Южной Америке. Инфицированные особи испытывают начальную острую стадию, обычно бессимптомную, с широким паразитарным тропизмом. Около 10-30% инфицированных людей испытывают симптомы хронической стадии после десятилетий инфекции, характеризующиеся мегаэзофагами, мегаколонами и сердечно-сосудистыми осложнениями5,6.

Метаболомика изучает малые молекулярные виды (50-1 500 Да), включая биологические соединения первичного или вторичного метаболизма и соединения внешнего происхождения, такие как лекарства или молекулы пищевого происхождения. В контексте взаимодействия хозяин-патоген метаболомика может исследовать влияние инфекции на среду метаболитов хозяина, что имеет решающее значение для доступа к воздействию патогена на хозяина. Он также может оценивать адаптацию патогенов к пищевой и иммунологической среде хозяина7,8,9. Масс-спектрометрия (МС) и спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) являются распространенными метаболомическими инструментами, используемыми для идентификации, количественной оценки и характеристики метаболитов. Этот «омический» подход также может быть применен к открытию биомаркеров и разработке лекарств10,11.

Учитывая специфический тканевый тропизм трипаносоматидных паразитов, пространственный метаболомический анализ может позволить значительно понять патогенез заболеваний, которые они вызывают. Картирование пространственного распределения метаболитов выявило метаболиты, локально пораженные хронической инфекцией Trypanosoma cruzi в сердечной ткани мыши и острой и долгосрочной инфекцией Trypanosoma cruzi в желудочно-кишечном тракте мыши6,12,13. В частности, 3D-химическая картография продемонстрировала разрыв между персистенцией паразитов и метаболическими изменениями в сердечной ткани мышей, инфицированных хронически Trypanosoma cruzi. Метаболизм был наиболее нарушен в нижних и апикальных сегментах сердца, что соответствовало местам симптомов болезни Шагаса (аневризмы сердечной апикальной аневризмы). Семейства метаболитов, возмущенные инфекцией в определенных сердечных участках и коррелирующие с тяжестью заболевания, включают ацилкарнитины и глицерофосфохолины12,13,14. В желудочно-кишечном тракте стойкие метаболические изменения совпадали с симптомами болезни Шагаса: пищеводом и толстой кишкой. Напротив, метаболизм повторно нормализуется в местах, не связанных с симптомами болезни Шагаса, таких как тонкая кишка. Метаболиты, локально нарушенные инфекцией в желудочно-кишечном тракте, включают ацилкарнитины, глицерофосфохолины, кинуренин, триптофан и холевую кислоту. Кроме того, эти анализы позволили выявить новый метаболический механизм толерантности к болезни Шагаса6. Применение этих методов для изучения кожного лейшманиоза выявило значительные метаболические возмущения в месте поражения, а также специфические метаболические изменения в пораженно-смежных, макроскопически здоровых тканях. Например, глютамин был истощен в месте поражения, тогда как глицерофосфохолины в m/z (отношение массы к заряду) 200-299, 400-499, 500-599 и 600-699 были значительно увеличены в месте поражения. ПК (О-34:1) был увеличен только на участках, прилегающих к поражению15.

Целью данной рукописи является демонстрация шагов, необходимых для создания 3D-моделей распределения метаболитов («химическая картография») применительно к моделям заражения трипаносоматидами паразитов (рисунок 1). Этот подход основывается на нескольких критических достижениях в контексте метаболомики и обработки метаболомических данных, в частности на разработке программного обеспечения 'ili для легкого отображения данных метаболомики на 3D-моделях16.

протокол

Все описанные эксперименты на животных были одобрены Университетом Оклахомы или Комитетом по институциональным уходу и использованию животных Калифорнийского университета в Сан-Диего. Все этапы обращения с инфекционным материалом выполнялись внутри шкафа биобезопасности (класс II, тип А2) и в соответствии с местными правилами.

1. Сбор тканей

  1. Заражают соответствующую трипаносоматидную инфекцию животными моделями, как правило, мышами или хомяками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Существует значительное разнообразие мышиных моделей трипаносоматидной инфекции, в зависимости от желаемых симптомов, скорости прогрессирования заболевания, тяжести заболевания и т. Д. Пользователи могут выбирать в удобное для них время.
    1. Для моделей инфекции кожного лейшманиоза заражайте подкожно в ножной подушечке или внутрикожно в ухе15.
    2. Для моделей инфекции висцерального лейшманиоза инфицируют внутривенно1,17.
    3. Для моделей болезни Шагаса и инфекции сонной болезни инфекции внутрибрюшинно6,12,18,19. Определите дозу паразита для использования на основе штамма паразита и запланированных временных показателей.
  2. Планирование позиций секционирования.
    1. Планируйте создание срезов с минимум 10 мг ткани на срез. Лучше всего употреблять 30-50 мг.
    2. Для моделей инфекции болезни Шагаса планируйте систематически собирать сердечный и желудочно-кишечный сегменты.
    3. Для моделей инфекции кожного лейшманиоза соберите пораженную ткань и соседние с поражением образцы.
    4. Для моделей инфекции висцерального лейшманиоза планируется собрать селезенку и множественные доли печени. Дополнительные участки ткани, такие как жировая ткань, также могут представлять интерес для сбора.
      ВНИМАНИЕ: Образцы инфицированных животных должны обрабатываться в соответствии с соответствующим, институционально утвержденным протоколом биобезопасности. Как правило, это связано с требованиями к средствам индивидуальной защиты (СИЗ) и только открытием трубок и сбором образцов внутри шкафа биобезопасности (класс II, тип A2).
  3. Этикетировочные и весовые трубки для гомогенизации.
    1. Используйте тип трубы, соответствующий имеющейся системе гомогенизации. Для TissueLyser используйте микроцентрифужные трубки объемом 2 мл.
    2. Усыпляйте мышей в желаемых временных точках заражения, используя передозировку изофлурана, как это одобрено институциональным IACUC или в соответствии с протоколом, одобренным IACUC.
    3. Секция ткани систематически, как и планировалось, с одним срезом на трубку.
    4. Не забудьте промыть оборудование для сбора образцов между образцами экстракционным растворителем (50% метанола в этом протоколе).
  4. Держа крышку трубки открытой, немедленно заморозьте образцы в жидком азоте.
    ВНИМАНИЕ: Не закрывайте трубки до тех пор, пока жидкий азот, попавший в трубку, полностью не испарится, чтобы предотвратить взрыв трубок при расширении азота. Примите адекватные меры, чтобы убедиться, что кожа не вступает в контакт с жидким азотом (используйте криочатки и щипцы для удержания трубок). Наденьте защитный лицевой щиток.
  5. Храните тюбики на сухом льду до тех пор, пока не будут собраны все желаемые образцы.
  6. Точка паузы: храните образцы при -80 °C до готовности к экстракции.
  7. Взвешивайте пробирки для определения веса образца ткани. Запись в электронной таблице.
    1. Держите образцы замороженными во время процесса взвешивания: держите трубки на сухом льду, быстро взвешивайте, сразу же положите обратно на сухой лед. Не допускайте размораживания образцов во время взвешивания.

2. Извлечение метаболитов

ПРИМЕЧАНИЕ: Во всем должны использоваться только жидкости и реагенты класса LC-MS. Этот метод был адаптирован из Reference20.

  1. Приготовьте все экстракционные растворители (LC-MS марки H2O, метанол марки LC-MS, шипованный 4 мкМ сульфахлорпиридазина, дихлорметан марки LC-MS: метанол с 2 мкМ сульфахлорпиридазина) в стеклянных бутылках по 1 л, используя специальную стеклянную посуду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем, подлежащий приготовлению, следует рассчитывать на основе массы образца с учетом 500 мкл воды на 50 мг образца, 500 мкл метанола, наполненного 4 мкМ сульфахлорпиридазина на 50 мг образца и 1000 мкл предварительно охлажденного дихлорметана: метанол, шипованный 2 мкМ сульфахлорпиридазина на 50 мг образца, увеличивая расчетный объем на 10%, чтобы учесть неточность пипетирования. Храните экстракционный растворитель при 4 °C, по крайней мере, на ночь для предварительного охлаждения.
  2. Выполните гомогенизацию образцов тканей на водной основе в соответствии с этапами, упомянутыми ниже.
    1. Добавьте один шарик из нержавеющей стали толщиной 5 мм (см. Таблицу материалов) в каждую из микроцентрифужных пробирок объемом 2 мл, содержащих образцы тканей, с помощью дозатора шариков. Держите трубки на льду.
    2. Сделайте одну заготовку, содержащую LC-MS класса H2O, которая будет проходить все этапы и служить вытяжной заготовкой. Используйте средний объем H2O из извлечения образцов. Добавьте охлажденный LC-MS сорт H2O к замороженным образцам тканей.
      1. Нормализуют объем воды к массе ткани путем добавления 500 мкл воды / 50 мг образца, используя веса образца, рассчитанные на этапе 1.7.
        ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: При обращении с биоопасными образцами продолжайте следовать соответствующему, институционально утвержденному протоколу по биобезопасности. Как правило, это связано с требованиями к средствам индивидуальной защиты (СИЗ) и открывающимся трубам только внутри шкафа биобезопасности (класс II, тип A2).
    3. Гомогенизируйте образцы со скоростью 25 Гц в течение 3 мин с помощью тканевого гомогенизатора (см. Таблицу материалов).
      1. Плотно закройте трубки, чтобы избежать разлива реагентов во время обработки.
    4. Соберите около 1/10 объема гомогенизации для экстракции ДНК, qPCR, анализа на основе белка или других анализов (при желании). Хранить в микроцентрифужной трубке или 96-луночной пластине (в зависимости от собранного объема) до 6 месяцев при -80 °C, если эксперименты по извлечению ДНК должны проводиться в другой день. Более длительные сроки хранения могут быть возможны, но не были протестированы.
      1. Выполняйте извлечение ДНК с использованием любого стандартного коммерческого набора для извлечения ДНК млекопитающих (см. Таблицу материалов) из тканей, как описано в ссылке 13. Количественно оцените выход ДНК и сохраните извлеченную ДНК при -20 °C. Приемлемое количество и качество ДНК для qPCR наблюдалось даже до 3 лет спустя.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап может быть выполнен на замороженном гомогенате на следующий день после экстракции метаболитов.
      2. Выполните qPCR, как описано в ссылке 13, используя 180 нг экстрагированной ДНК.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть выполнено на ДНК, собранной в предыдущий день и замороженной при -20 ° C.
        1. В случае исследований инфекции T. cruzi используйте следующие праймеры: ASTCGGCTGATCGTTTTCGA и AATTCCTCCAAGCAGCGGATA для количественной оценки уровней паразитов21 и следующие праймеры для нормализации уровня ДНК хозяина: TCCCTCTCATCAGTTCTATGGCCCA и CAGCAAGCATCTATGCACTTAGACCCC22 (см. Таблицу материалов).
          ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемые циклы qPCR следующие: денатура при 95 °C в течение 10 мин; выполнять 40 циклов при 95 °C в течение 30 с, затем 58 °C в течение 60 с и, наконец, 72 °C в течение 60 с. Выполните анализ кривой плавления в соответствии с имеющимся термоциклером. Обработка данных с использованием метода ΔΔCt23 для получения относительной паразитарной нагрузки между участками отбора проб. Абсолютная количественная оценка может быть получена путем сравнения полученных из образца значений ΔΔCt со стандартной кривой, полученной из известных количеств паразитов, шипованной в неинфицированные образцы тканей и извлеченной, как на этапах 2.2-2.2.4.1.
      3. Выполнение белковой характеристики иммунных реакций с использованием мультиплексированных наборов цитокинов или стандартных коммерческих наборов ИФА (см. Таблицу материалов), как описано в Ссылке 13 на хранящемся гомогенате.
    5. Сохраните по меньшей мере половину из 500 мкл объема гомогенизации для экстракции метаболитов.
  3. Производят водную экстракцию метаболитов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор растворителя может быть адаптирован на основе химических свойств метаболитов, представляющих интерес.
    1. Добавьте к гомогенату ледяной метанол марки LC-MS с 4 мкМ сульфахлорпиридазина для достижения конечной концентрации 50% метанола с 2 мкМ сульфахлорпиридазина в воде.
      ВНИМАНИЕ: Метанол легковоспламеняется и опасен. Используйте соответствующие процедуры безопасности, включая обращение внутри вытяжного шкафа или шкафа биобезопасности.
    2. Гомогенизируйте образцы в тканевом гомогенизаторе со скоростью 25 Гц в течение 3 мин. Образцы центрифуг при 16 000 х г при 4 °C в течение 10 мин.
    3. Соберите равный объем супернатанта в 96-луночную пластину. Выберите объем, соответствующий наименьшему объему метанола + воды, объединенной во всех образцах. Это водная фракция.
      1. Отложите все оставшиеся водные гомогенатные супернатанты при -80 °C в качестве резервной копии.
    4. Держите твердый остаток на льду во время сбора супернатантов.
    5. Сухой водный экстракционный супернатант до высыхания (~3 ч или на ночь). Используйте максимальную скорость и без нагрева.
    6. Заморозить высушенную 96-луночную плиту при -80 °C.
  4. Производят экстракцию органических метаболитов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор растворителя может быть адаптирован на основе химических свойств метаболитов, представляющих интерес.
    1. Добавьте 1000 мкл на 50 мг образца предварительно охлажденного дихлорметана: метанола, приправленного 2 мкМ сульфахлорпиридазина, к твердому остатку со стадии 2.3.4.
      ВНИМАНИЕ: Используйте соответствующие процедуры безопасности при обращении с растворителями, включая работу внутри вытяжного шкафа с хорошей скоростью потока.
    2. Гомогенизировать образцы в тканевом гомогенизаторе со скоростью 25 Гц в течение 5 мин. Центрифугирование образцов при 16 000 х г при 4 °C в течение 10 мин.
    3. Соберите равный объем супернатанта в 96-луночную пластину. Выберите объем, соответствующий наименьшему объему дихлорметана: метанола, во всех образцах. Это органическая фракция.
    4. Храните гранулы при -80 °C в качестве резервной копии. Храните оставшийся органический экстракт при -80 °C в качестве резервной копии. Высушите органический экстракт на воздухе в вытяжном шкафу на ночь.
    5. Заморозить высушенную 96-луночную плиту при -80 °C.

3. Сбор данных LC-MS

  1. Повторно суспендируют водные и органические экстракты в 60 мкл каждого из 50% метанола + 2 мкМ сульфадиметоксина и объединяют. Ультразвук в течение 10 мин; затем центрифугируют в течение 10 мин и переносят супернатант на чистую 96-луночную пластину. Уплотнение с бесзонным уплотнением пластины и поместите пластину в автосэмплер LC.
    ВНИМАНИЕ: Используйте соответствующие процедуры безопасности при обращении с растворителями, включая работу внутри вытяжного шкафа с хорошей скоростью потока.
  2. Подключите соответствующие мобильные фазы к системе LC (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для положительного режима обратной фазы LC авторы рекомендуют LC-MS-класс H2O + 0,1% муравьиной кислоты в качестве подвижной фазы A и ацетонитрил LC-MS-класса + 0,1% муравьиной кислоты в качестве подвижной фазы B со скоростью потока 0,5 мл / мин и градиентом LC 7,5 мин. Рекомендуемые шаги градиента, как описано в Ссылке 6: 0-1 мин, 2% B; 1-2,5 мин, линейное увеличение до 98% В; 2,5-4,5 мин, держать при 98% В; 4,5-5,5 мин, линейное снижение до 2% В; 5,5-7,5 мин, держать при 2% В.
  3. Убедитесь, что прибор чист. Калибруйте MS как в положительном, так и в отрицательном режиме.
  4. Выполните оценку производительности MS в зависимости от прибора.
  5. Создайте последовательность выполнения MS.
    1. Начните с 2 заготовок, 2 стандартов (6 смесей) и 5 объединенных регуляторов качества (QC) в серии разбавления, начиная с 2 мкл объема впрыска и увеличивая пошагово до 30 мкл объема впрыска.
    2. Рандомизируйте порядок выборки.
    3. После каждых 12 примеров запускайте пустой, а затем объединенный в пул QC.
  6. Подключите колонну C8 LC (размер частиц 1,7 мкм, размер пор 100 Å, длина 50 x 2,1 мм x внутренний диаметр) и следите за утечками и чрезмерным противодавлением. Устранение проблем в соответствии со стандартной операционной процедурой прибора.
  7. Запустите последовательность выполнения MS и соберите зависящие от данных данные LC-MS/MS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для прибора Q-Exactive Plus MS используйте ионизацию с подогревом электрораспыления и зависящее от данных получение MS2 (топ-5) в положительном режиме, разрешение 70 000 для MS1 и 17 500 для MS2, AGC Target 1E6 для MS1 и 2E5 для MS2, максимум IT 100 мс для MS1 и MS2, диапазон сканирования до 100-1500 м/з для MS1, и изоляционное окно MS2 1 м/з. Установите газ оболочки на 35, вспомогательный газ на 10 и газ развертки на 0, напряжение распыления до 3,8 кВ, капиллярную температуру до 320 °C, уровень ВЧ S-линзы до 50 и температуру aux-газа до 350 °C.
    1. Проверьте качество данных: проверьте начальные пробелы (подтвердите отсутствие крупных пиков), стандарты (подтвердите наличие ожидаемых пиков и симметричную форму пика) и QC (подтвердите наличие ожидаемых пиков, форму пика и ожидаемую пиковую интенсивность).
    2. Периодически отслеживайте запуск MS во время последовательности выполнения.
  8. После завершения запуска проверьте данные на наличие пропущенных инъекций или других ошибок.
  9. Храните колонку LC в соответствии с рекомендациями производителя. Извлекайте и храните образцы при температуре -80 °C.
  10. Загрузите необработанные данные в репозиторий данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: MassIVE (massive.ucsd.edu) рекомендуется для включения нисходящей связи с молекулярной сетью для аннотаций метаболитов24,25.

4. Обработка данных LC-MS

  1. Конвертируйте необработанные файлы в открытый формат (.mzXML или .mzML) с помощью MSConvert26.
    1. Загрузите необработанные данные и данные mzXML или mzML в репозиторий данных.
  2. Создание таблицы пространственных объектов. Для этого существует множество инструментов (MZmine, MS-DIAL, openMS, XCMS и т. Д. 27,28,29,30).
    ПРИМЕЧАНИЕ: MZmine рекомендуется, потому что он является бесплатным, с открытым исходным кодом и может напрямую импортировать файлы mzXML после MSconvert, имеет графические параметры пользовательского интерфейса для обработки данных и мониторинга влияния выбора параметров и может напрямую экспортировать в GNPS для молекулярной сети24.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте документации по инструменту и используйте параметры, соответствующие доступному инструменту. Дополнительную информацию также можно найти в Reference31.
    1. Экспорт таблицы объектов в формате .csv.

5.3D генерация моделей

  1. Ручная рисование 3D-модели de novo для масштабирования в соответствии с шагами, упомянутыми ниже.
    1. Сфотографируйте интересующий орган.
    2. Выполните следующие действия в программном обеспечении SketchUp (см. Таблицу материалов), как указано ниже.
      1. Удалите изображение человека по умолчанию, которое появляется при открытии программного обеспечения.
      2. Нажмите «Файл > импорт », чтобы импортировать изображение интересующих органов.
      3. Нажмите на инструмент «Линии» и выберите опцию «От руки ». Используйте инструмент карандаша, чтобы проследить и нарисовать контуры интересующих органов. Убедитесь, что линия закрыта, проведя весь путь обратно к начальной точке. Как только линия будет успешно закрыта, нарисованная область автоматически появится затененной.
      4. Выберите инструмент « Push/Pull » и поднимитесь на затененной области, чтобы преобразовать рисунок из 2D в 3D.
      5. Удалить рисунок органа: нажмите кнопку Ластик , а затем щелкните правой кнопкой мыши на рисунке и выберите Стереть.
      6. Экспортируйте файл в формате .dae: Файл > Экспорт > 3D-модель.
    3. Улучшите реалистичность модели в соответствии с шагами, упомянутыми ниже.
      1. Импортируйте модель в программное обеспечение MeshLab (см. Таблица материалов): откройте MeshLab и выберите Файл > Импорт сетки. Выберите модель .dae, созданную на предыдущем шаге. Появится меню «Параметры предварительного открытия ». Нажмите кнопку ОК.
      2. Выберите Каркас в верхнем меню. Затем выберите: Фильтры > Ремеширование, Упрощение и Реконструкция > Поверхности подразделения: Средняя точка. Оставьте все значения по умолчанию и дважды выберите Применить . Визуально осмотрите каркасный вид модели, чтобы убедиться, что он точно привязан к сетке. Закройте всплывающее меню.
      3. Экспортируйте модель в формате .stl: файл > экспортировать сетку как, а затем выберите формат файла STL (*.stl) в раскрывающемся меню Тип файлов . Нажмите кнопку Сохранить. Нажмите кнопку ОК в следующем всплывающем меню.
      4. Откройте программное обеспечение Meshmixer (см. Таблицу материалов). Нажмите на кнопку Импорт (+ ). Выберите STL-файл, созданный на предыдущем шаге. Используйте инструменты Sculpt > Brushes > Drag и Sculpt > Brushes > Inflate , чтобы вытащить поверхности модели, которые необходимо закруглить.
      5. Как только модель будет иметь желаемый внешний вид, сохраните ее в формате .stl: Файл > Экспорт. Присвойте файлу желаемое имя и выберите STL Binary Format (*.stl) в раскрывающемся меню Тип файла. Нажмите кнопку Сохранить. Если появится всплывающее меню, нажмите « Продолжить».

6. Генерация или участка

  1. Получение координат для позиций в 3D-модели, соответствующих участкам отбора проб.
    1. Откройте 3D-модель с шага 5.1.3.5 в программном обеспечении MeshLab : Файл > Импорт сетки. Выберите модель, созданную на шаге 5.1.3.5. Нажмите кнопку ОК во всплывающем окне «Обработка после открытия ».
    2. Чтобы получить координаты x, y и z для каждого места выборки: выберите инструмент PickPoints , а затем щелкните правой кнопкой мыши через регулярно расположенные интервалы по всей поверхности 3D-модели. После того, как все нужные координаты выбраны, нажмите на самую верхнюю кнопку «Сохранить » во всплывающем окне «Форма ».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это приведет к экспорту координат в формате файла .pp. Этот файл можно открыть в электронных таблицах.
    3. В программном обеспечении для работы с электронными таблицами: откройте файл .pp, созданный на шаге 6.1.2. Настройте отображение данных с помощью > текста данных в столбцы > с разделителями. Нажмите кнопку Далее, затем выберите Пробел и нажмите кнопку Готово.
    4. Переформатируйте так, чтобы в ячейках электронной таблицы оставались только числовые значения, выбрав Главная > Найти и Выбрать > Заменить. В поле Найти что введите: y=". Оставьте поле Заменить на пустое. Нажмите кнопку Заменить все, а затем на кнопку ОК. Повторите для x=" и для z=" и для " />. Теперь значения готовы к шагу 6.2.
  2. Создайте таблицу компонентов 'ili. Этот метод был адаптирован из Reference16.
    1. В программном обеспечении для работы с электронными таблицами создайте таблицу компонентов. Строки соответствуют каждой позиции, а столбцы — данным.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первыми столбцами должны быть название позиции (название образца), за которым следуют координаты x, y и z мест отбора проб, полученных на этапе 6.1.2 (с заголовками столбцов x, y, z). Пятая колонка должна называться «радиус».
    2. Вставьте соответствующие метаданные и обилие метаболитов в последующие столбцы электронной таблицы.
    3. В графе "радиус" введите желаемый размер мест отбора проб, которые должны быть визуализированы на модели. Определите значения радиуса эмпирически: введите 1 по умолчанию, а затем оцените, нужно ли корректировать радиус или координаты на шаге 6.3. Сохраните файл в формате .csv (Файл > Сохранить как), а затем выберите CSV (с разделителями-запятыми) (*.csv) в раскрывающемся меню. Присвойте файлу желаемое имя. Нажмите кнопку Сохранить.
  3. Откройте данные в 'ili (программное обеспечение, разработанное 16).
    1. Откройте веб-сайт 'ili (ili.embl.de). Выберите Поверхность. Перетащите созданную 3D-модель в окно браузера. Перетащите созданную таблицу объектов в то же окно браузера.
    2. Используйте легенду в правом нижнем углу для проецирования нужного столбца данных на 3D-модель. Убедитесь, что пятна и радиусы, выбранные на этапе 6.2.1, соответствуют участкам отбора проб. При необходимости отрегулируйте значения в таблице объектов или выберите дополнительные координаты в MeshLab (см. шаг 6.1.2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализацию также можно улучшить, выбрав Spots > Border Opacity и установив для ползунка максимальное значение.
    3. Последовательно выбирайте каждый столбец данных, чтобы оценить распределение этого метаболита на 3D-модели.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот подход также может быть использован для визуализации только конкретных метаболитных признаков, представляющих интерес, например, с p < 0,05 или определенным кратным изменением между инфицированными и неинфицированными образцами, как определено во внешних инструментах статистического анализа. Функции для визуализации также могут быть выбраны за пределами 'ili с помощью подходов машинного обучения, таких как случайный лес.
  4. Выполните визуализацию линейных/логарифмических данных в соответствии с шагами, описанными ниже.
    1. На вкладке Сопоставление в правом верхнем углу страницы выберите Линейный или Логарифмический в раскрывающемся меню Масштаб .
    2. Установите одинаковый масштаб для всех графиков при визуализации нескольких объектов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Веб-сайт автоматически выбирает минимум и максимум для каждого столбца данных для отображения.
    3. Чтобы установить масштабирование вручную, снимите флажок Auto Min/Max и введите требуемое масштабирование. Теперь все данные будут отображаться в одном масштабе.
  5. Изменение цветовой шкалы данных (оттенки серого, сине-бело-красный и т.д.).
    1. Измените цветовую шкалу на нужную цветовую схему в меню «Сопоставление» с помощью раскрывающегося меню «Цветовая карта ». Убедитесь, что выбранная цветовая схема оптимизирована для дальтонизма.
  6. Чтобы изменить цвет 3D-модели или цвет фона, используйте параметры «Цвет» и «Фон» в меню «3D».
  7. Скройте 3D-оси, сняв флажок «Показать происхождение» в меню «3D».
  8. Сохраните изображение, сделав скриншот, используя инструмент ножниц или сочетание клавиш Crtl + S для Windows или Linux и figure-protocol-25114+ S в OS X.

Результаты

Количество полученных признаков метаболита зависит от типа анализируемой ткани и параметров обработки данных. Например, этот протокол был использован для анализа пространственного влияния инфекции T. cruzi на метаболом желудочно-кишечного тракта в мышиной модели инфекции T. cruzi. В предыдущей работе самцам C3H/HeJ вводили внутрибрюшинно 1000 CL + luc T. cruzi паразитов32,6. Животные были усыплены через 12 или 89 дней после заражения, и химический картографический анализ 13 смежных сегментов желудочно-кишечного тракта был выполнен, как описано в этом протоколе. Этот анализ привел к созданию таблицы характеристик из 5 502 объектов, которые затем были визуализированы в 3D с использованием шагов, описанных в этом протоколе. Этот подход позволяет визуализировать признаки метаболитов у отдельных животных, которые находятся в месте высокой паразитарной нагрузки (кинуренин, рисунок 2B против нагрузки паразитов, рисунок 2A), метаболитов с дифференциальным распределением по областям ткани (глутамин, рисунок 2C) и метаболитные признаки, которые обнаруживаются на сопоставимых уровнях в тонком и толстом кишечнике (LPE 16: 0, рисунок 2D ). Кинуренин был выбран для визуализации из-за его известной связи с воспалением и предыдущих публикаций о способности метаболитов, полученных из кинуренина, регулировать T. cruzi load33. Случайные модели машинного обучения на основе лесов ранее выявили связь между уровнями кинуренина и инфекционным статусом6. Глютамин был выбран для визуализации на основе предыдущих публикаций, демонстрирующих связь между доступностью глутамина in vitro и лекарственной чувствительностью T. cruzi34. Дифференциальное распределение было подтверждено с помощью логистической регрессии, p < 0,05. LPE 16:0 был выбран после визуального осмотра данных для обнаружения метаболитных признаков, обнаруженных на сопоставимых уровнях по участкам тканей.

figure-results-2265
Рисунок 1: Обзор протокола. Иллюстрация создана с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2705
Рисунок 2: Химический картографический анализ. Самцам мышей C3H/HeJ вводили внутрибрюшинно 1000 паразитов CL+luc T. cruzi32. Животных усыпляли через 12 или 89 дней после заражения, а желудочно-кишечный тракт систематически собирали и разделяли (шаг 1)6. Метаболиты извлекали, как на шаге 2, и анализировали с помощью LC-MS/MS.3D генерацию модели выполняли с помощью программного обеспечения SketchUp (шаг 5), а данные строили в 3D, как на шаге 6. (A) Распространение паразитов у конкретной мыши через 12 дней после заражения. (B) Распределение метаболитов кинуренина у той же мыши через 12 дней после заражения. (C) Среднее распределение глутамина среди инфицированных мышей через 89 дней после заражения. (D) Сопоставимые уровни времени удержания m/z 454,292 мин 2,929 мин, аннотированные как 2-гексадеканоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (LPE 16:0), у той же мыши, что и у A и B в тонкой кишке и толстой кишке. Образцы и данные были сгенерированы в6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Понимание трипаносоматидных инфекций имеет важное значение для руководства новыми подходами к разработке лекарств и лечению. Этот метод химической картографии уникально способен обеспечить действенное понимание взаимосвязи между метаболизмом и патогенезом трипаносоматидной болезни, тем самым удовлетворяя эту трансляционную потребность.

Только растворители класса LC-MS рекомендуются во время экстракции метаболитов и анализа MS, чтобы уменьшить фоновое загрязнение. Полимерное загрязнение35, обычно получаемое из парафиновой пленки и/или других пластмасс36,37,38, следует избегать, где это возможно. Парафильм, в частности, никогда не должен использоваться. Эти аспекты имеют решающее значение, поскольку качество данных LC-MS зависит от материалов, используемых при подготовке образцов и извлечении метаболитов. Качество данных должно быть обеспечено до создания графиков 'ili. Кроме того, создание этих всеобъемлющих пространственных метаболомических карт требует сбора всех соседних образцов тканей и извлечения метаболитов из всех собранных образцов, чтобы избежать пробелов в этих картах. Таким образом, процедуры сбора, логистика экстракции метаболитов и анализ LC-MS, а также затраты должны рассматриваться и планироваться соответствующим образом.

Этот протокол может быть изменен для удовлетворения потребностей пользователя несколькими способами. Например, полярность и растворимость растворителей, используемых при экстракции метаболитов, будут влиять на то, какие метаболиты будут обнаружены39. Чтобы максимизировать разнообразие обнаруженных признаков метаболитов для нецелевого химического картографического анализа, рекомендуется сочетание нескольких стадий экстракции и растворителей. Например, этот метод использует дихлорметан, метанол и воду в качестве экстракционных растворителей, поскольку они позволяют точно обнаруживать неполярные и полярные молекулы20,40. Однако эти растворители не являются универсально подходящими для каждого эксперимента с рассеянным склерозом, и исследователи должны выбирать экстракционные растворители на основе целей своего проекта. Аналогичным образом, могут быть использованы различные условия LC-MS / MS, такие как замена обратнофазной хроматографии нормальной фазовой хроматографией. Альтернативные столбцы также могут использоваться для сбора данных об обратной фазе вместо хроматографии C8, хотя эмпирически хроматография C8 более устойчива к липидам тканей и имеет более низкую частоту засорения. Концептуально эти протоколы могут быть применены и к другим методам масс-спектрометрии, таким как газовая хроматография-масс-спектрометрия и т.д.

Альтернативным подходом является масс-спектрометрическая визуализация. Действительно, в отличие от методов масс-спектрометрии, жидкостная хроматография-масс-спектрометрия по своей сути не сохраняет пространственную информацию10. Подходы к химической картографии восполняют этот пробел, включая местоположение выборки во время концептуализации проекта, в метаданные образца и на этапах обработки данных. Сильной стороной этого подхода к химической картографии, в отличие от масс-спектрометрической визуализации, является способность предоставлять уверенные аннотации (Metabolomics Standards Initiative level 1 или level 2 annotation confidence41), в отличие от масс-спектрометрической визуализации, где основная часть приложений полагается на точную массу только для аннотаций. Масс-спектрометрическая визуализация позволит осуществлять мелкозернистое пространственное отображение, иногда вплоть до уровня одной клетки, например, 42,43. Напротив, подходы химической картографии позволяют крупномасштабное межорганное картирование распределения метаболитов, не требуя узкоспециализированных навыков криосекции целых животных. Химическая картография предоставляет дополнительные доказательства для многих разрабатываемых пространственных транскриптомных подходов, например, 44, с преимуществом сосредоточения внимания на «слое омики, ближайшем к фенотипу»45. Альтернативные методы количественной оценки нагрузки паразитов включают измерение биолюминесценции во время отбора проб6. Тонкие сегменты также могут быть собраны, чтобы позволить конфокальную или электронную микроскопию оценить локализованную нагрузку паразитов и повреждение тканей. Гомогенат воды, который используется для количественной оценки цитокинов в этом протоколе и предыдущих публикациях13, также может быть использован для количественной оценки белковых маркеров повреждения тканей.

Существует также несколько способов получения 3D-моделей, подходящих для построения результирующих данных LC-MS. В дополнение к методу, предложенному здесь, модели можно приобрести предварительно изготовленными у различных онлайн-поставщиков. Убедитесь, что условия использования соответствуют предполагаемому использованию, особенно в отношении публикации. Модели для больших органов могут быть сгенерированы de novo с помощью 3D-сканеров в соответствии с инструкциями сканера. Альтернативы, такие как MATLAB, существуют для создания и визуализации 3D-моделей для химической картографии46, но они были в основном реализованы до разработки 'ili16. MATLAB - это набор инструментов для анализа и программирования данных, предлагающий широкий спектр приложений во многих областях. Однако MATLAB не является ни бесплатным, ни открытым исходным кодом, и он требует знакомства с интерфейсами MATLAB, особенно учитывая, что MATLAB не был разработан для обработки данных масс-спектрометрии. Альтернативы этого предлагаемого метода, а именно SketchUp, Meshlab и 'ili, являются свободно доступными, удобными для пользователя и предлагают функции, аналогичные MATLAB для целей химической картографии.

Этот метод является надежным в отношении пробоподготовки и экстракции метаболитов. Устранение неполадок чаще всего необходимо на этапе сбора данных LC-MS. Это выходит за рамки данной статьи. Читатели направляются к отличным публикациям по устранению неполадок при сборе данных LC-MS, в том числе 20,47. Аналогичным образом, сложности аннотации метаболитов выходят за рамки фокуса этого метода на генерации 3D-моделей. Полезные ссылки по этой теме включают 24,25,48,49.

Хотя этот метод эффективно исследует патогенез заболевания, у этого подхода существуют ограничения, некоторые из которых являются общими для любого эксперимента по метаболомике. Одним из таких ограничений является низкая скорость аннотаций LC-MS features50, которая зависит от доступности и качества эталонных спектральных библиотек. Еще одним ограничением является то, что этот протокол не сохраняет мРНК из-за несовместимости реагентов сохранения РНК, таких как RNAlater, с анализом LC-MS / MS. Тем не менее, качество белка является достаточным для последующего анализа и, таким образом, может заменить анализ на основе мРНК.

Химический картографический подход к патогенезу инфекций напрямую отражает то, как бактериальные, вирусные или паразитарные инфекции развиваются в системах органов и вызывают локализованное заболевание. Анализ этих региональных подвыборок и создание 3D-моделей в конечном итоге передает, как метаболиты функционируют в трехмерном пространстве, проливая свет на эти ранее непризнанные пространственные измерения молекулярной биологии. Используя этот протокол, например, локализацию метаболитов сравнивали с нагрузкой паразита Trypanosoma cruzi. Результаты прояснили взаимосвязь между патогеном и тканью хозяина, а также продемонстрировали метаболическую динамику прогрессирования симптомов болезни Шагаса6. Методы химической картографии также были применены к различным темам, таким как взаимодействие с окружающей средой человека51,52,53, химический состав систем органов, таких как кожа человека46 и легкие54, а также метаболизм растений и взаимодействие с окружающей средой55. Будущие приложения могут включать оценку локализованной толерантности и устойчивости к болезням или взаимосвязи между локальными уровнями метаболитов, тропизмом патогена и тропизмом заболевания в моделях за пределами трипаносоматидной инфекции. Этот подход также должен иметь широкую применимость для расширения современных протоколов фармакокинетики, для оценки взаимосвязи между уровнями местных тканевых препаратов и метаболизмом лекарств по сравнению с общим метаболическим контекстом, повреждением тканей и клиренсом патогена. В целом, химическая картография позволяет проводить уникальные исследования распределения метаболитов в различных типах образцов, включая патогенез заболеваний, здоровье человека, взаимодействие человека и окружающей среды и микробную динамику.

Раскрытие информации

Отсутствие конфликта интересов, о котором можно сообщить.

Благодарности

Лора-Изобель Макколл, доктор философии, имеет награду «Исследователи в патогенезе инфекционных заболеваний» от Фонда Берроуза Уэллкома. Авторы также хотели бы отметить поддержку со стороны премии NIH No R21AI148886, пилотного гранта От Центра респираторных и инфекционных заболеваний Оклахомы (OCRID) под номером награды NIH P20GM103648 и стартовых фондов от Университета Оклахомы (до LIM). Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения спонсоров. Авторы также хотели бы поблагодарить разработчиков инструментов, используемых в этом протоколе. Все соответствующие публикации были процитированы, где это применимо.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL Eppendorf tubesNANAany brand, as available
1 L bottle, pyrexNANAany brand, as available
1 L graduated cylinder, pyrexNANAany brand, as available
2 mL SafeLock Eppendorf tubesVWR20901-540use the appropriate tube model for the available tissue homogenizer
3D model (de-novo generated according to protocol steps, or purchased)NANAas appropriate for system under investigation
5 mm stainless steel beadQiagen69989
96 well plateFisher3252449
AATTCCTCCAAGCAGCGGATA primerNANAany brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007).
analytical balanceNANAany brand, as available
ASTCGGCTGATCGTTTTCGA primerNANAany brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007).
benchtop centrifuge with microcentrifuge, falcon tube and 96-well-plate capacityNANAany brand, as available
biosafety cabinetNANAclass II, type A2; any brand, as available
CAGCAAGCATCTATGCACTTAG
ACCCC primer		NANAany brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003).
cameraNANAany brand, as available. A cellphone camera is adequate for this protocol
chemiluminescent-capable imaging systemNANAany system, as available
cotton ballsNANAany brand, as available
cryoglovesVWR97008-208replace with any brand, as available
dissection scissorsNANAany brand, as available
dry iceNANAany brand, as available
extra-length forcepsNANAany brand, as available
flammable-grade refrigeratorNANAany brand, as available
freezer storage boxes for microcentrifuge tubesNANAany brand, as available
fume hoodNANAany brand, as available
high-resolution mass spectrometerNANAany brand, as available, such as ThermoFisher Q-Exactive Plus (catalog number 0726030)
ice bucketNANAany brand, as available
ili softwareili.embl.deNA
isofluraneCovetrus29405
large tupperwareNANAany brand, as available; large enough to comfortably contain mouse, cotton ball
LC-MS grade acetonitrileFisher OptimaA955-4
LC-MS grade dicholoromethaneFisher OptimaD151-4
LC-MS grade formic acidFisher OptimaA11750
LC-MS grade methanolFisher OptimaA456-4
LC-MS grade waterFisher OptimaW64
liquid chromatography columnPhenomenex00B-4499-ANmay be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest
liquid chromatography column guard cartridgePhenomenexAJ0-8784may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest
liquid chromatography column guard cartridge holderPhenomenexAJ0-9000may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest
liquid nitrogenNANAany brand, as available
luciferinGoldbioLUCK-1G
MeshLab softwarehttps://www.meshlab.net/NA
Meshmixer softwarehttps://www.meshmixer.com/NA
MS calibrantNANAappropriate one for available instrument
MS data processing softwareNANAmultiple options available; authors recommend MZmine
MSConvert softwarehttp://proteowizard.sourceforge.net/NA
NanodropThermoFisherND-ONE-Wother nanodrop models are also suitable
p1000 pipet tipsNANAuse the appropriate brand to fit available pipettors
p1000 pipettorNANAany brand, as available
p20 pipette tipsNANAuse the appropriate brand to fit available pipettors
p20 pipettorNANAany brand, as available
p200 pipette tipsNANAuse the appropriate brand to fit available pipettors
p200 pipettorNANAany brand, as available
personal protective equipment (gloves, lab coat, safety glasses/goggles; faceshield)NANAany brand, as available
Q-Plex Mouse Cytokine - Screen (16-Plex)Quansys biosciences110949MScan replace with other protein-based cytokine assays such as other commercial cytokine ELISA kits
Quick-DNA Miniprep Plus Kit (200 preps)ZymoD4069replace with any brand of mammalian DNA extraction kit, as available
real-time thermocyclerNANAany brand, as available
salt shaker or tea infuserNANAany brand; to contain isoflurane-soaked cotton ball and prevent contact with mouse skin
SketchUp softwarehttps://www.sketchup.com/NA
specimen forcepsNANAany brand, as available
speedvac with microcentrifuge tube and 96-well-plate capacityNANAany brand, as available
spreadsheet softwarehttps://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excelNAcan replace with other spreadsheet management software, as applicable
sulfachloropyridazineSigmaS9882-100G
sulfadimethoxineSigmaS7007-10G
Sybr green qPCR reaction mixFisherA25780can replace with other Sybr green qPCR reaction mixes, as desired
TCCCTCTCATCAGTTCTAT
GGCCCA primer		NANAany brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003).
tissue homogenizerNANAany brand, as available; for example, Qiagen TissueLyser II, catalog number 85300, with TissueLyser Adapter Set (2 x 24), catalog number 69982
tissue samplesNANAfrom appropriate infection model
TissueLyser single-bead dispenserQiagen69965
UHPLCNANAany brand, as available, such as ThermoFisher Vanquish (catalog number IQLAAAGABHFAPUMBHV)
ultra-low temperature freezer (-80)NANAany brand, as available
ultrasonic bathNANAany system, as available
wet iceNANAany brand, as available
zone-free sealing filmVWR 490007-390

Ссылки

  1. McCall, L. -. I., et al. Adaptation of Leishmania donovani to and visceral environments: in vivo selection and proteomic analysis. Journal of Proteome Research. 14 (2), 1033-1059 (2015).
  2. McCall, L. -. I., Zhang, W. -. W., Matlashewski, G. Determinants for the development of visceral leishmaniasis disease. PLoS Pathogens. 9 (1), 1003053 (2013).
  3. de Castro Neto, A. L., da Silveira, J. F., Mortara, R. A. Comparative analysis of virulence mechanisms of trypanosomatids pathogenic to humans. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 669079 (2021).
  4. Franco, J. R., Simarro, P. P., Diarra, A., Jannin, J. G. Epidemiology of human African trypanosomiasis. Clinical Epidemiology. 6, 257-275 (2014).
  5. Ottilie, S., et al. Rapid chagas disease drug target discovery using directed evolution in drug-sensitive yeast. ACS Chemical Biology. 12 (2), 422-434 (2017).
  6. Hossain, E., et al. Mapping of host-parasite-microbiome interactions reveals metabolic determinants of tropism and tolerance in Chagas disease. Science Advances. 6 (30), (2020).
  7. Parab, A. R., McCall, L. -. I. Tryp-ing up metabolism: Role of metabolic adaptations in kinetoplastid disease pathogenesis. Infection and Immunity. 89 (4), (2021).
  8. Lewis, C. M., McCall, L. -. I., Sharp, R. R., Spicer, P. G. Ethical priority of the most actionable system of biomolecules: the metabolome. American Journal of Physical Anthropology. 171 (2), 177-181 (2020).
  9. Liu, Z., Ulrich vonBargen, R., McCall, L. I. Central role of metabolism in Trypanosoma cruzi tropism and Chagas disease pathogenesis. Current Opinion in Microbiology. 63, 204-209 (2021).
  10. Newsom, S. N., McCall, L. -. I. Metabolomics: Eavesdropping on silent conversations between hosts and their unwelcome guests. PLoS Pathogens. 14 (4), 1006926 (2018).
  11. Wishart, D. S., et al. HMDB: the Human Metabolome Database. Nucleic Acids Research. 35, 521-526 (2007).
  12. Dean, D. A., et al. Spatial metabolomics identifies localized chemical changes in heart tissue during chronic cardiac Chagas disease. PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (10), 0009819 (2021).
  13. McCall, L. -. I., et al. Mass spectrometry-based chemical cartography of a cardiac parasitic infection. Analytical Chemistry. 89 (19), 10414-10421 (2017).
  14. Hoffman, K., et al. Alterations to the cardiac metabolome induced by chronic infection relate to the degree of cardiac pathology. ACS Infectious Diseases. 7 (6), 1638-1649 (2021).
  15. Parab, A. R., et al. Dysregulation of glycerophosphocholines in the cutaneous lesion caused by Leishmania major in experimental murine models. Pathogens. 10 (5), 593 (2021).
  16. Protsyuk, I., et al. 3D molecular cartography using LC-MS facilitated by Optimus and 'ili software. Nature Protocols. 13 (1), 134-154 (2018).
  17. McCall, L. -. I., et al. Targeting ergosterol biosynthesis in Leishmania donovani: Essentiality of Sterol 14alpha-demethylase. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003588 (2015).
  18. Tear, W. F., et al. Selectivity and physicochemical optimization of repurposed Pyrazolo[1,5-]pyridazines for the treatment of human African trypanosomiasis. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (2), 756-783 (2020).
  19. Klug, D. M., et al. Hit-to-lead optimization of benzoxazepinoindazoles as human African trypanosomiasis therapeutics. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (5), 2527-2546 (2020).
  20. Want, E. J., et al. Global metabolic profiling of animal and human tissues via UPLC-MS. Nature Protocols. 8 (1), 17-32 (2013).
  21. Piron, M., et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta Tropica. 103 (3), 195-200 (2007).
  22. Cummings, K. L., Tarleton, R. L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and Biochemical Parasitology. 129 (1), 53-59 (2003).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  24. Nothias, L. -. F., et al. Feature-based molecular networking in the GNPS analysis environment. Nature Methods. 17 (9), 905-908 (2020).
  25. Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with global natural products social molecular networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
  26. Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  27. Tsugawa, H., et al. MS-DIAL: data-independent MS/MS deconvolution for comprehensive metabolome analysis. Nature Methods. 12 (6), 523-526 (2015).
  28. Sturm, M., et al. OpenMS - an open-source software framework for mass spectrometry. BMC Bioinformatics. 9, 163 (2008).
  29. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 395 (2010).
  30. Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification. Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).
  31. . FBMN with MZmine Available from: https://ccms-ucsd.github.io/GNPSDocumentation/featurebasedmolecularnetworking-with-mzmine2/ (2021)
  32. Lewis, M. D., et al. Bioluminescence imaging of chronic Trypanosoma cruzi infections reveals tissue-specific parasite dynamics and heart disease in the absence of locally persistent infection. Cellular Microbiology. 16 (9), 1285-1300 (2014).
  33. Knubel, C. P., et al. 3-Hydroxy kynurenine treatment controls T. cruzi replication and the inflammatory pathology preventing the clinical symptoms of chronic Chagas disease. PloS One. 6 (10), 26550 (2011).
  34. Dumoulin, P. C., Vollrath, J., Tomko, S. S., Wang, J. X., Burleigh, B. Glutamine metabolism modulates azole susceptibility in amastigotes. eLife. 9, (2020).
  35. Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
  36. Weaver, R., Riley, R. J. Identification and reduction of ion suppression effects on pharmacokinetic parameters by polyethylene glycol 400. Rapid Communications in Mass Spectrometry: RCM. 20 (17), 2559-2564 (2006).
  37. Larger, P. J., Breda, M., Fraier, D., Hughes, H., James, C. A. Ion-suppression effects in liquid chromatography-tandem mass spectrometry due to a formulation agent, a case study in drug discovery bioanalysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 39 (1-2), 206-216 (2005).
  38. Furey, A., Moriarty, M., Bane, V., Kinsella, B., Lehane, M. Ion suppression; a critical review on causes, evaluation, prevention and applications. Talanta. 115, 104-122 (2013).
  39. Lu, W., et al. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  40. Masson, P., Alves, A. C., Ebbels, T. M. D., Nicholson, J. K., Want, E. J. Optimization and evaluation of metabolite extraction protocols for untargeted metabolic profiling of liver samples by UPLC-MS. Analytical Chemistry. 82 (18), 7779-7786 (2010).
  41. Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).
  42. Rappez, L., et al. SpaceM reveals metabolic states of single cells. Nature Methods. 18 (7), 799-805 (2021).
  43. Yang, B., Tsui, T., Caprioli, R. M., Norris, J. L. Sample preparation and analysis of single cells using high performance MALDI FTICR mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 2064, 125-134 (2020).
  44. Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics. Nature Reviews. Genetics. 22 (10), 627-644 (2021).
  45. Patti, G. J., Yanes, O., Siuzdak, G. Innovation: Metabolomics: the apogee of the omics trilogy. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (4), 263-269 (2012).
  46. Bouslimani, A., et al. Molecular cartography of the human skin surface in 3D. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 2120-2129 (2015).
  47. Dudzik, D., Barbas-Bernardos, C., García, A., Barbas, C. Quality assurance procedures for mass spectrometry untargeted metabolomics. A review. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 147, 149-173 (2018).
  48. Alseekh, S., et al. Mass spectrometry-based metabolomics: a guide for annotation, quantification and best reporting practices. Nature Methods. 18 (7), 747-756 (2021).
  49. Chaleckis, R., Meister, I., Zhang, P., Wheelock, C. E. Challenges, progress and promises of metabolite annotation for LC-MS-based metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 55, 44-50 (2019).
  50. Viant, M. R., Kurland, I. J., Jones, M. R., Dunn, W. B. How close are we to complete annotation of metabolomes. Current Opinion in Chemical Biology. 36, 64-69 (2017).
  51. Kapono, C. A., et al. Creating a 3D microbial and chemical snapshot of a human habitat. Scientific Reports. 8 (1), 3669 (2018).
  52. Petras, D., et al. Mass spectrometry-based visualization of molecules associated with human habitats. Analytical Chemistry. 88 (22), 10775-10784 (2016).
  53. McCall, L. -. I., et al. Analysis of university workplace building surfaces reveals usage-specific chemical signatures. Building and Environment. 162, 106289 (2019).
  54. Garg, N., et al. Three-dimensional microbiome and metabolome cartography of a diseased human lung. Cell Host & Microbe. 22 (5), 705-716 (2017).
  55. Floros, D. J., et al. Mass spectrometry based molecular 3D-cartography of plant metabolites. Frontiers in Plant Science. 8, 429 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1793D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены