Method Article
* Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen
Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Erstellung eines 3D-Modells der Metabolitenverteilung während der Trypanosomatideninfektion, einschließlich Probenentnahme, Metabolitenextraktion, überblick über die Datenerfassung von Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie, 3D-Modellgenerierung und schließlich Datenvisualisierung.
Pathogentropismus und Krankheitstropismus beziehen sich auf die Gewebestellen, die selektiv von Krankheitserregern besiedelt oder beschädigt werden, was zu lokalisierten Krankheitssymptomen führt. Zu den humaninfektiösen Trypanosomatidenparasiten gehören Trypanosoma cruzi, der Erreger der Chagas-Krankheit; Trypanosoma brucei, der Erreger der Schlafkrankheit; und Leishmania-Arten , Erreger der Leishmaniose. Zusammen betreffen sie 20 Millionen Menschen auf der ganzen Welt. Diese Parasiten zeigen einen spezifischen Tropismus: Herz, Speiseröhre, Dickdarm für T. cruzi, Fettgewebe, Bauchspeicheldrüse, Haut, Kreislaufsystem und Zentralnervensystem für T. brucei, Haut für dermotrope Leishmania-Stämme und Leber, Milz und Knochenmark für viscerotrope Leishmania-Stämme . Eine räumliche Perspektive ist daher unerlässlich, um die Pathogenese der Trypanosomatid-Krankheit zu verstehen. Die chemische Kartographie erzeugt 3D-Visualisierungen der Häufigkeit kleiner Moleküle, die durch Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie erzeugt werden, im Vergleich zu mikrobiologischen und immunologischen Parametern. Dieses Protokoll zeigt, wie die chemische Kartographie angewendet werden kann, um pathogene Prozesse während der Trypanosomatideninfektion zu untersuchen, beginnend mit der systematischen Gewebeentnahme und Metabolitenextraktion, gefolgt von der Erfassung von Daten zur Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie und abschließend mit der Erstellung von 3D-Karten der Metabolitenverteilung. Diese Methode kann für mehrere Forschungsfragen verwendet werden, wie z.B. Nährstoffbedarf für die Gewebebesiedlung durch T. cruzi, T. brucei oder Leishmania, Immunmetabolismus an Infektionsorten und die Beziehung zwischen lokaler Gewebemetabolische Störung und klinischen Krankheitssymptomen, was zu einem umfassenden Einblick in die Pathogenese der Trypanosomatid-Krankheit führt.
Trypanosomatidenparasiten bestehen aus Leishmania-Arten, afrikanischen Trypanosomen (Trypanosoma brucei) und amerikanischen Trypanosomen (Trypanosoma cruzi). Leishmania protozoa verursachen Leishmaniose, die selbstheilende und selbstbegrenzte lokalisierte kutane Leishmaniose, mukokutane Leishmaniose, bei der das Schleimhautgewebe von Mund, Nase und Rachen geschädigt wird, und viszerale Leishmaniose mit Parasitentropismus zu den viszeralen Organen, die Fieber und Hepatosplenomegalie verursachen1,2 umfasst. T. brucei verursacht humane afrikanische Trypanosomiasis (HAT), auch bekannt als Schlafkrankheit, die hauptsächlich in afrikanischen Ländern berichtet wird3. Zu den klinischen Anzeichen und Symptomen gehören Hepatosplenomegalie, Fieber, Kopfschmerzen, Muskel-Skelett-Schmerzen, Lymphadenopathien und Anämie im hämo-lymphatischen Stadium, wenn Parasiten im Blutkreislauf und in der Lymphgefäße lokalisiert sind. Es folgt das meningo-enzephalitische Stadium, in dem Parasiten im zentralen Nervensystem lokalisiert sind und Schlafstörungen, Verhaltensänderungen und schließlich tödliches Komas verursachen4. T. cruzi verursacht die Chagas-Krankheit, die in Amerika endemisch ist. Infizierte Personen erleben ein anfängliches akutes Stadium, in der Regel asymptomatisch, mit breitem Parasitentropismus. Etwa 10%-30% der infizierten Personen erleben nach jahrzehntelanger Infektion chronische Symptome im Stadium, die durch Megaösophagus, Megakolon und kardiovaskuläre Komplikationen gekennzeichnet sind5,6.
Metabolomics untersucht kleine molekulare Spezies (50-1.500 Da), einschließlich biologischer Verbindungen aus dem primären oder sekundären Stoffwechsel und extern abgeleiteter Verbindungen wie Medikamente oder aus Lebensmitteln gewonnene Moleküle. Im Kontext von Wirt-Pathogen-Interaktionen kann die Metabolomik die Auswirkungen einer Infektion auf die Umgebungen der Wirtsmetaboliten untersuchen, was entscheidend für den Zugang zur Wirkung des Erregers auf den Wirt ist. Es kann auch die Anpassung von Krankheitserregern an die Ernährungs- und immunologische Umgebung des Wirts beurteilen7,8,9. Massenspektrometrie (MS) und Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) sind gängige Metabolomik-Werkzeuge, die zur Identifizierung, Quantifizierung und Charakterisierung von Metaboliten verwendet werden. Dieser "Omics"-Ansatz kann auch auf die Entdeckung von Biomarkern und die Arzneimittelentwicklung angewendet werden10,11.
Angesichts des spezifischen Gewebetropismus von Trypanosomatiden-Parasiten können räumliche Metabolomik-Analysen einen signifikanten Einblick in die Pathogenese der von ihnen verursachten Krankheiten ermöglichen. Die Kartierung der räumlichen Verteilung der Metaboliten ergab Metaboliten, die lokal von einer chronischen Trypanosoma cruzi-Infektion im Herzgewebe der Maus und einer akuten und langfristigen Trypanosoma cruzi-Infektion im Magen-Darm-Trakt der Maus betroffen sind6,12,13. Insbesondere zeigte die chemische 3D-Kartographie eine Diskrepanz zwischen Parasitenpersistenz und metabolischen Veränderungen im Herzgewebe von chronisch Trypanosoma cruzi-infizierten Mäusen. Der Stoffwechsel war in den unteren und apikalen Segmenten des Herzens am stärksten gestört und stimmte mit den Stellen der Symptome der Chagas-Krankheit (herzapikale Aneurysmen) überein. Zu den Metabolitenfamilien, die durch eine Infektion an bestimmten kardialen Stellen gestört werden und mit dem Schweregrad der Erkrankung korrelieren, gehören Acylcarnitine und Glycerophosphocholine12,13,14. Im Magen-Darm-Trakt stimmten anhaltende Stoffwechselveränderungen mit den Symptomen der Chagas-Krankheit überein: Speiseröhre und Dickdarm. Im Gegensatz dazu ist der Stoffwechsel an Stellen, die nicht mit den Symptomen der Chagas-Krankheit assoziiert sind, wie dem Dünndarm, wieder normalisiert. Zu den Metaboliten, die lokal durch eine Infektion im Magen-Darm-Trakt gestört werden, gehören Acylcarnitine, Glycerophosphocholine, Kynurenin, Tryptophan und Cholsäure. Darüber hinaus ermöglichten diese Analysen die Identifizierung eines neuen metabolischen Mechanismus der Toleranz gegenüber der Chagas-Krankheit6. Die Anwendung dieser Methoden auf die Untersuchung der kutanen Leishmaniose zeigte signifikante metabolische Störungen an der Stelle der Läsion, aber auch spezifische metabolische Veränderungen im läsionsbenachbarten, makroskopisch gesunden Gewebe. Zum Beispiel wurde Glutamin an der Läsionsstelle erschöpft, während Glycerophosphocholine im m / z (Masse-Ladungs-Verhältnis) 200-299, 400-499, 500-599 und 600-699 an der Läsionsstelle signifikant erhöht waren. PC (O-34:1) war nur an läsionsbenachgebliebenen Stellen erhöht15.
Ziel dieses Manuskripts ist es, die Schritte zu demonstrieren, die notwendig sind, um 3D-Modelle der Metabolitenverteilung ("chemische Kartographie") zu generieren, wie sie auf Trypanosomatiden-Parasiteninfektionsmodelle angewendet werden (Abbildung 1). Dieser Ansatz baut auf mehreren kritischen Fortschritten im Zusammenhang mit der Metabolomik und der Metabolomik-Datenverarbeitung auf, insbesondere auf der Entwicklung einer Software zur Darstellung von Metabolomik-Daten auf 3D-Modellen16.
Alle beschriebenen Tierversuche wurden von der University of Oklahoma oder dem University of California San Diego Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. Alle Schritte im Umgang mit infektiösem Material wurden in einer Biosicherheitswerkbank (Klasse II, Typ A2) und gemäß den örtlichen Vorschriften durchgeführt.
1. Gewebeentnahme
2. Extraktion von Metaboliten
HINWEIS: Es dürfen nur Flüssigkeiten und Reagenzien in LC-MS-Qualität verwendet werden. Diese Methode wurde von Reference20 übernommen.
3. LC-MS Datenerfassung
4. LC-MS Datenverarbeitung
5.3D Modellgenerierung
6. Generierung von Grundstücken
Die Anzahl der erhaltenen Metabolitenmerkmale hängt vom analysierten Gewebetyp und den Datenverarbeitungsparametern ab. Zum Beispiel wurde dieses Protokoll verwendet, um die räumlichen Auswirkungen der T. cruzi-Infektion auf das Metabolom des Magen-Darm-Trakts in einem Mausmodell der T. cruzi-Infektion zu analysieren. In früheren Arbeiten wurden männlichen C3H/HeJ intraperitoneal 1.000 CL + luc T. cruzi Parasiten injiziert32,6. Die Tiere wurden 12 oder 89 Tage nach der Infektion eingeschläfert, und eine chemische Kartographieanalyse von 13 zusammenhängenden Segmenten des Magen-Darm-Traktes wurde wie in diesem Protokoll beschrieben durchgeführt. Diese Analyse führte zu einer Feature-Tabelle mit 5.502 Features, die dann mit den in diesem Protokoll beschriebenen Schritten in 3D visualisiert wurden. Dieser Ansatz ermöglicht die Visualisierung von Metabolitenmerkmalen bei einzelnen Tieren, die an der Stelle hoher Parasitenlast hoch sind (Kynurenin, Abbildung 2B vs. Parasitenlast, Abbildung 2A), von Metaboliten mit differentieller Verteilung über Geweberegionen (Glutamin, Abbildung 2C) und Metabolitenmerkmalen, die in vergleichbaren Konzentrationen über Dünn- und Dickdarm gefunden werden (LPE 16:0 Abbildung 2D). ). Kynurenin wurde aufgrund seiner bekannten Beziehung zur Entzündung und früherer Veröffentlichungen über die Fähigkeit von Kynurenin-abgeleiteten Metaboliten, die T. cruzi-Last zu regulieren, für die Visualisierung ausgewählt33. Random-Forest-basierte Machine-Learning-Modelle hatten zuvor einen Zusammenhang zwischen Kynureninspiegeln und Infektionsstatus6 aufgedeckt. Glutamin wurde für eine Visualisierung ausgewählt, die auf früheren Publikationen basiert, die einen Zusammenhang zwischen der Verfügbarkeit von In-vitro-Glutamin und der Sensitivität des T. cruzi-Medikaments zeigen34. Die Differentialverteilung wurde mit Hilfe der logistischen Regression, p < 0,05, bestätigt. LPE 16:0 wurde nach visueller Inspektion der Daten ausgewählt, um Metabolitenmerkmale zu entdecken, die in vergleichbaren Konzentrationen an Gewebestellen gefunden wurden.
Abbildung 1: Protokollübersicht. Die Illustration wurde mit BioRender.com erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Chemische Kartographieanalyse. Männlichen C3H/HeJ-Mäusen wurden intraperitoneal 1.000 CL+luc T. cruzi Parasiten injiziert32. Die Tiere wurden 12 oder 89 Tage nach der Infektion eingeschläfert, und der Magen-Darm-Trakt wurde systematisch entnommen und abschnittiert (Schritt 1)6. Die Metaboliten wurden wie in Schritt 2 extrahiert und von LC-MS/MS analysiert.3D Modellgenerierung wurde mit der SketchUp-Software durchgeführt (Schritt 5), und die Daten wurden in 3D wie in Schritt 6 dargestellt. (A) Parasitenverteilung in einer bestimmten Maus, 12 Tage nach der Infektion. (B) Verteilung des Kynurenin-Metaboliten in derselben Maus, 12 Tage nach der Infektion. (C) Mittlere Glutaminverteilung über infizierte Mäuse, 89 Tage nach der Infektion. (D) Vergleichbare Mengen an m/z 454,292 Retentionszeit 2,929 min, annotiert als 2-Hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (LPE 16:0), in derselben Maus wie in A und B im Dünndarm und Dickdarm. Stichproben und Daten wurden in6 generiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Das Verständnis von Trypanosomatid-Infektionen ist unerlässlich, um neuartige Arzneimittelentwicklungs- und Behandlungsansätze zu leiten. Diese chemische Kartographiemethode ist einzigartig aufgestellt, um umsetzbare Einblicke in die Beziehung zwischen Stoffwechsel und Trypanosomatid-Krankheitspathogenese zu liefern und so diesen translationalen Bedarf zu decken.
Bei der Metabolitenextraktion und ms-Analysen werden nur Lösungsmittel in LC-MS-Qualität empfohlen, um die Hintergrundkontamination zu verringern. Polymere Verunreinigungen35, die üblicherweise aus Paraffinfolien und/oder anderen Kunststoffen stammen36,37,38, sind nach Möglichkeit zu vermeiden. Insbesondere Parafilm darf niemals verwendet werden. Diese Aspekte sind von entscheidender Bedeutung, da die LC-MS-Datenqualität von den Materialien abhängt, die bei der Probenvorbereitung und Metabolitenextraktion verwendet werden. Die Datenqualität sollte vor der Erstellung von "ili-Plots" sichergestellt werden. Darüber hinaus erfordert die Erstellung dieser umfassenden räumlichen Metabolomik-Karten die Sammlung aller benachbarten Gewebeproben und die Extraktion von Metaboliten aus allen gesammelten Proben, um Lücken in diesen Karten zu vermeiden. Die Sammelverfahren, die Logistik der Metabolitenextraktion und die LC-MS-Analyse sowie die Kosten sollten daher entsprechend berücksichtigt und geplant werden.
Dieses Protokoll kann auf verschiedene Arten geändert werden, um die Benutzeranforderungen zu erfüllen. Beispielsweise beeinflussen die Polarität und Löslichkeit von Lösungsmitteln, die während der Metabolitenextraktion verwendet werden, welche Metaboliten nachgewiesen werden39. Um die Vielfalt der nachgewiesenen Metabolitenmerkmale für ungezielte chemische Kartographieanalysen zu maximieren, wird die Kombination mehrerer Extraktionsschritte und Lösungsmittel empfohlen. Zum Beispiel verwendet diese Methode Dichlormethan, Methanol und Wasser als Extraktionslösungsmittel, da sie einen genauen Nachweis von unpolaren und polaren Molekülen ermöglichen20,40. Diese Lösungsmittel sind jedoch nicht universell für jedes MS-Experiment geeignet, und forscher sollten Extraktionslösungsmittel basierend auf den Zielen ihres Projekts auswählen. Ebenso können verschiedene LC-MS/MS-Bedingungen verwendet werden, wie z.B. das Ersetzen der Umkehrphasenchromatographie durch die Normalphasenchromatographie. Alternative Säulen können auch für die Erfassung von Umkehrphasendaten anstelle der C8-Chromatographie verwendet werden, obwohl die C8-Chromatographie empirisch robuster gegenüber Gewebelipiden ist und eine geringere Verstopfungshäufigkeit aufweist. Konzeptionell können diese Protokolle auch auf andere massenspektrometrische Methoden wie Gaschromatographie-Massenspektrometrie usw. angewendet werden.
Ein alternativer Ansatz ist die massenspektrometrische Bildgebung. Im Gegensatz zu massenspektrometrischen Bildgebungsansätzen bewahrt die Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie die räumliche Information nicht von Natur aus10. Chemische Kartographieansätze schließen diese Lücke, indem sie den Probenstandort zum Zeitpunkt der Projektkonzeption, in die Probenmetadaten und in die Datenverarbeitungsschritte einbeziehen. Eine Stärke dieses chemischen Kartographieansatzes ist im Gegensatz zur massenspektrometrischen Bildgebung die Fähigkeit, zuverlässige Anmerkungen zu liefern (Metabolomics Standards Initiative Level 1 oder Level 2 Annotation Confidence41), im Gegensatz zur massenspektrometrischen Bildgebung, bei der der Großteil der Anwendungen nur für die Annotation auf genaue Masse angewiesen ist. Die massenspektrometrische Bildgebung ermöglicht eine feinkörnige räumliche Kartierung, manchmal bis auf die Einzelzellebene, z. B. 42,43. Im Gegensatz dazu ermöglichen chemische Kartographieansätze eine großräumige organübergreifende Kartierung der Metabolitenverteilung, ohne dass hochspezialisierte Kryosektionsfähigkeiten für ganze Tiere erforderlich sind. Die chemische Kartographie liefert ergänzende Beweise für die vielen räumlichen transkriptomischen Ansätze, die entwickelt werden, z.B. 44, mit dem Vorteil, dass sie sich auf die "Omics-Schicht" konzentriert, die dem Phänotyp am nächsten ist"45. Alternative Methoden zur Quantifizierung der Parasitenbelastung umfassen die Messung der Biolumineszenz zum Zeitpunkt der Probenentnahme6. Feine Segmente könnten auch gesammelt werden, um konfokale oder Elektronenmikroskopie zu ermöglichen, um die lokalisierte Parasitenbelastung und Gewebeschäden zu beurteilen. Das Wasserhomogenat, das in diesem Protokoll und früheren Publikationen13 für die Zytokinquantifizierung verwendet wird, könnte auch zur Quantifizierung proteinbasierter Marker für Gewebeschäden verwendet werden.
Es gibt auch mehrere Möglichkeiten, 3D-Modelle zu erhalten, die geeignet sind, die resultierenden LC-MS-Daten darzustellen. Zusätzlich zu der hier vorgeschlagenen Methode können Modelle vorgefertigt von verschiedenen Online-Anbietern erworben werden. Stellen Sie sicher, dass die Nutzungsbedingungen mit dem Verwendungszweck übereinstimmen, insbesondere in Bezug auf die Veröffentlichung. Modelle für große Organe können de novo mit 3D-Scannern nach Scanneranweisungen erstellt werden. Für die Generierung und Visualisierung von 3D-Modellen für die chemische Kartographie46 existieren Alternativen wie MATLAB, die aber vor allem vor der Entwicklung von 'ili16 implementiert wurden. MATLAB ist eine Datenanalyse- und Programmier-Tool-Suite, die eine Vielzahl von Anwendungen in vielen Bereichen bietet. MATLAB ist jedoch weder frei noch Open-Source und erfordert die Vertrautheit mit MATLAB-Schnittstellen, insbesondere wenn man bedenkt, dass MATLAB nicht für die Verarbeitung von Massenspektrometriedaten entwickelt wurde. Die Alternativen dieser vorgeschlagenen Methode, nämlich SketchUp, Meshlab und 'ili, sind frei zugänglich, benutzerfreundlich und bieten ähnliche Funktionen wie MATLAB für chemische Kartographiezwecke.
Diese Methode ist robust in Bezug auf probenpräparation und metabolitenextraktion. Die Fehlerbehebung ist meistens im LC-MS-Datenerfassungsschritt erforderlich. Dies würde den Rahmen dieses Artikels sprengen. Die Leser werden zu exzellenten Publikationen zur Fehlerbehebung bei der LC-MS-Datenerfassung weitergeleitet, darunter20,47. Ebenso geht die Komplexität der Metabolitenannotation über den Rahmen des Fokus dieser Methode auf die 3D-Modellgenerierung hinaus. Nützliche Referenzen zu diesem Thema sind24,25,48,49.
Während diese Methode die Pathogenese von Krankheiten effektiv erforscht, gibt es Einschränkungen für diesen Ansatz, von denen einige in jedem Metabolomics-Experiment üblich sind. Eine dieser Einschränkungen ist die geringe Annotationsrate der LC-MS-Features50, die von der Verfügbarkeit und Qualität der Referenzspektralbibliotheken abhängt. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass dieses Protokoll mRNA aufgrund der Inkompatibilität von RNA-Konservierungsreagenzien wie RNAlater mit der LC-MS/MS-Analyse nicht konserviert. Die Proteinqualität ist jedoch für nachgelagerte Analysen ausreichend und kann somit mRNA-basierte Analysen ersetzen.
Ein chemischer kartographischer Ansatz zur Infektionspathogenese spiegelt direkt wider, wie sich bakterielle, virale oder parasitäre Infektionen in Organsystemen entwickeln und lokalisierte Krankheiten verursachen. Die Analyse dieser regionalen Teilstichproben und die Generierung von 3D-Modellen vermittelt letztendlich, wie Metaboliten im dreidimensionalen Raum funktionieren, und beleuchtet diese bisher nicht erkannten räumlichen Dimensionen der Molekularbiologie. Unter Verwendung dieses Protokolls wurde beispielsweise die Metabolitenlokalisation mit der Parasitenbelastung von Trypanosoma cruzi verglichen. Die Ergebnisse klärten die Beziehung zwischen dem Erreger und dem Wirtsgewebe und zeigten auch die metabolische Dynamik der Symptomprogression der Chagas-Krankheit6. Chemische Kartographiemethoden wurden auch auf verschiedene Themen angewendet, wie z.B. die Interaktion zwischen Mensch und gebauter Umwelt51,52,53, die chemische Zusammensetzung von Organsystemen wie menschliche Haut46 und Lunge54 sowie pflanzenstoffwechsel und Umweltinteraktionen55. Zukünftige Anwendungen können die Bewertung der lokalen Krankheitstoleranz und -resilienz oder der Beziehung zwischen lokalen Metabolitenspiegeln, Pathogentropismus und Krankheitstropismus in Modellen über die Trypanosomatideninfektion hinaus umfassen. Dieser Ansatz sollte auch eine breite Anwendbarkeit haben, um die aktuellen pharmakokinetischen Protokolle zu erweitern, um die Beziehung zwischen lokalen Gewebearzneimittelspiegeln und Arzneimittelstoffwechsel vs. gesamtmetabolischem Kontext, Gewebeschäden und Pathogenclearance zu bewerten. Insgesamt ermöglicht die chemische Kartographie einzigartige Erkundungen der Metabolitenverteilung in verschiedenen Probentypen, mit Anwendungen wie Krankheitspathogenese, menschliche Gesundheit, Mensch-Umwelt-Interaktionen und mikrobielle Dynamik.
Keine zu meldenden Interessenkonflikte.
Laura-Isobel McCall, PhD, ist Preisträgerin des Investigators in the Pathogenesis of Infectious Disease Award des Burroughs Wellcome Fund. Die Autoren möchten ferner die Unterstützung durch die NIH-Auszeichnungsnummer R21AI148886, ein Pilotstipendium des Oklahoma Center for Respiratory and Infectious Diseases (OCRID) unter der NIH-Preisnummer P20GM103648 und Startkapital der University of Oklahoma (an LIM) würdigen. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der Geldgeber dar. Die Autoren möchten sich auch bei den Entwicklern der in diesem Protokoll verwendeten Tools bedanken. Gegebenenfalls wurden alle relevanten Publikationen zitiert.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL Eppendorf tubes | NA | NA | any brand, as available |
1 L bottle, pyrex | NA | NA | any brand, as available |
1 L graduated cylinder, pyrex | NA | NA | any brand, as available |
2 mL SafeLock Eppendorf tubes | VWR | 20901-540 | use the appropriate tube model for the available tissue homogenizer |
3D model (de-novo generated according to protocol steps, or purchased) | NA | NA | as appropriate for system under investigation |
5 mm stainless steel bead | Qiagen | 69989 | |
96 well plate | Fisher | 3252449 | |
AATTCCTCCAAGCAGCGGATA primer | NA | NA | any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007). |
analytical balance | NA | NA | any brand, as available |
ASTCGGCTGATCGTTTTCGA primer | NA | NA | any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007). |
benchtop centrifuge with microcentrifuge, falcon tube and 96-well-plate capacity | NA | NA | any brand, as available |
biosafety cabinet | NA | NA | class II, type A2; any brand, as available |
CAGCAAGCATCTATGCACTTAG ACCCC primer | NA | NA | any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003). |
camera | NA | NA | any brand, as available. A cellphone camera is adequate for this protocol |
chemiluminescent-capable imaging system | NA | NA | any system, as available |
cotton balls | NA | NA | any brand, as available |
cryogloves | VWR | 97008-208 | replace with any brand, as available |
dissection scissors | NA | NA | any brand, as available |
dry ice | NA | NA | any brand, as available |
extra-length forceps | NA | NA | any brand, as available |
flammable-grade refrigerator | NA | NA | any brand, as available |
freezer storage boxes for microcentrifuge tubes | NA | NA | any brand, as available |
fume hood | NA | NA | any brand, as available |
high-resolution mass spectrometer | NA | NA | any brand, as available, such as ThermoFisher Q-Exactive Plus (catalog number 0726030) |
ice bucket | NA | NA | any brand, as available |
ili software | ili.embl.de | NA | |
isoflurane | Covetrus | 29405 | |
large tupperware | NA | NA | any brand, as available; large enough to comfortably contain mouse, cotton ball |
LC-MS grade acetonitrile | Fisher Optima | A955-4 | |
LC-MS grade dicholoromethane | Fisher Optima | D151-4 | |
LC-MS grade formic acid | Fisher Optima | A11750 | |
LC-MS grade methanol | Fisher Optima | A456-4 | |
LC-MS grade water | Fisher Optima | W64 | |
liquid chromatography column | Phenomenex | 00B-4499-AN | may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest |
liquid chromatography column guard cartridge | Phenomenex | AJ0-8784 | may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest |
liquid chromatography column guard cartridge holder | Phenomenex | AJ0-9000 | may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest |
liquid nitrogen | NA | NA | any brand, as available |
luciferin | Goldbio | LUCK-1G | |
MeshLab software | https://www.meshlab.net/ | NA | |
Meshmixer software | https://www.meshmixer.com/ | NA | |
MS calibrant | NA | NA | appropriate one for available instrument |
MS data processing software | NA | NA | multiple options available; authors recommend MZmine |
MSConvert software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | NA | |
Nanodrop | ThermoFisher | ND-ONE-W | other nanodrop models are also suitable |
p1000 pipet tips | NA | NA | use the appropriate brand to fit available pipettors |
p1000 pipettor | NA | NA | any brand, as available |
p20 pipette tips | NA | NA | use the appropriate brand to fit available pipettors |
p20 pipettor | NA | NA | any brand, as available |
p200 pipette tips | NA | NA | use the appropriate brand to fit available pipettors |
p200 pipettor | NA | NA | any brand, as available |
personal protective equipment (gloves, lab coat, safety glasses/goggles; faceshield) | NA | NA | any brand, as available |
Q-Plex Mouse Cytokine - Screen (16-Plex) | Quansys biosciences | 110949MS | can replace with other protein-based cytokine assays such as other commercial cytokine ELISA kits |
Quick-DNA Miniprep Plus Kit (200 preps) | Zymo | D4069 | replace with any brand of mammalian DNA extraction kit, as available |
real-time thermocycler | NA | NA | any brand, as available |
salt shaker or tea infuser | NA | NA | any brand; to contain isoflurane-soaked cotton ball and prevent contact with mouse skin |
SketchUp software | https://www.sketchup.com/ | NA | |
specimen forceps | NA | NA | any brand, as available |
speedvac with microcentrifuge tube and 96-well-plate capacity | NA | NA | any brand, as available |
spreadsheet software | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel | NA | can replace with other spreadsheet management software, as applicable |
sulfachloropyridazine | Sigma | S9882-100G | |
sulfadimethoxine | Sigma | S7007-10G | |
Sybr green qPCR reaction mix | Fisher | A25780 | can replace with other Sybr green qPCR reaction mixes, as desired |
TCCCTCTCATCAGTTCTAT GGCCCA primer | NA | NA | any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003). |
tissue homogenizer | NA | NA | any brand, as available; for example, Qiagen TissueLyser II, catalog number 85300, with TissueLyser Adapter Set (2 x 24), catalog number 69982 |
tissue samples | NA | NA | from appropriate infection model |
TissueLyser single-bead dispenser | Qiagen | 69965 | |
UHPLC | NA | NA | any brand, as available, such as ThermoFisher Vanquish (catalog number IQLAAAGABHFAPUMBHV) |
ultra-low temperature freezer (-80) | NA | NA | any brand, as available |
ultrasonic bath | NA | NA | any system, as available |
wet ice | NA | NA | any brand, as available |
zone-free sealing film | VWR | 490007-390 |
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