A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
מאמר זה מתאר כיצד לנצל ביעילות שלוש פלטפורמות עיבוד קריו-EM, כלומר, cryoSPARC v3, RELION-3 ו- Scipion 3, כדי ליצור זרימת עבודה אחת וחזקה החלה על מגוון ערכות נתונים של חלקיקים בודדים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה.
ההתפתחויות האחרונות הן בתוכנות מכשור והן בתוכנת עיבוד תמונה הפכו מיקרוסקופיה קריו-אלקטרון של חלקיק יחיד (קריו-EM) לשיטה המועדפת על ביולוגים מבניים לקבוע מבנים ברזולוציה גבוהה של מגוון רחב של מקרומולקולות. חבילות תוכנה מרובות זמינות למשתמשים חדשים ומומחים לעיבוד תמונה וחישוב מבנה, המייעלים את אותה זרימת עבודה בסיסית: סרטים שנרכשו על ידי גלאי המיקרוסקופ עוברים תיקון להערכת תנועה והעברת ניגודיות (CTF) הנגרמת על ידי קרן. לאחר מכן, תמונות חלקיקים נבחרות ומופקות ממסגרות סרט ממוצעות לסיווג דו-ממדי ותלת-ממדי איטראטיבי, ולאחר מכן שחזור, עידון ואימות תלת-ממדיים. מכיוון שחבילות תוכנה שונות משתמשות באלגוריתמים שונים ודורשות רמות שונות של מומחיות כדי לפעול, המפות התלת-ממדיות שהן מייצרות שונות לעתים קרובות באיכות וברזולוציה. לכן, משתמשים באופן קבוע להעביר נתונים בין מגוון רחב של תוכניות לקבלת תוצאות אופטימליות. מאמר זה מספק מדריך למשתמשים לנווט בזרימת עבודה על פני חבילות התוכנה הפופולריות: cryoSPARC v3, RELION-3 ו- Scipion 3 כדי לקבל מבנה רזולוציה כמעט אטומית של הווירוס הקשור לאדנו (AAV). אנו מפרטים תחילה צינור עיבוד תמונה עם cryoSPARC v3, שכן האלגוריתמים היעילים שלו ו- GUI קל לשימוש מאפשרים למשתמשים להגיע במהירות למפה תלת-ממדית. בשלב הבא, אנו משתמשים ב- PyEM ובסקריפטים פנימיים כדי להמיר ולהעביר קואורדינטות חלקיקים מהשחזור התלת-ממדי האיכותי ביותר המתקבל ב- cryoSPARC v3 ל- RELION-3 ו- Scipion 3 ולחשב מחדש מפות תלת-ממדיות. לבסוף, אנו מתארים שלבים לעידון נוסף ואימות של המבנים המתקבלים על ידי שילוב אלגוריתמים מ- RELION-3 ו- Scipion 3. במאמר זה, אנו מתארים כיצד לנצל ביעילות שלוש פלטפורמות עיבוד כדי ליצור זרימת עבודה אחת וחזקה החלה על מגוון ערכות נתונים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה.
מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית (cryo-EM) וניתוח חלקיקים בודדים (SPA) מאפשרים קביעת מבנה של מגוון רחב של מכלולים ביו-מולקולריים במצבם הלחותי, ומסייעים להאיר את תפקידיהם של מקרומולקולות אלה בפירוט אטומי. שיפורים במיקרוסקופ אופטיקה, חומרת מחשב, ותוכנה לעיבוד תמונה אפשרו לקבוע מבנים של ביומולקולות ברזולוציה להגיע מעבר 2 Å1,2,3. יותר מ-2,300 מבני קריו-EM הופקדו במאגר נתוני החלבון (PDB) ב-2020, לעומת 192 מבנים ב-2014, מה שמצביע על כך שהקפאה-EM הפכה לשיטת הבחירה של ביולוגים מבניים רבים. כאן אנו מתארים זרימת עבודה המשלבת שלוש תוכניות ספא שונות לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה (איור 1).
המטרה של SPA היא לשחזר אמצעי אחסון תלת-ממדיים של דגימת יעד מתמונות דו-ממדיות רועשות שנרשמו על ידי גלאי מיקרוסקופ. גלאים אוספים תמונות כסרטים עם מסגרות בודדות של אותו שדה ראייה. על מנת לשמר את המדגם, מסגרות נאספים עם מינון אלקטרונים נמוך ולכן יש יחס אות לרעש גרוע (SNR). בנוסף, חשיפה לאלקטרונים יכולה לגרום לתנועה בתוך רשתות ההקפאה-EM המיובשות, וכתוצאה מכך טשטוש תמונה. כדי להתגבר על בעיות אלה, מסגרות מיושרות כדי לתקן עבור תנועה הנגרמת על ידי קרן וממוצע להניב מיקרוגרף עם SNR מוגבר. מיקרוגרפים אלה עוברים הערכה של פונקציית העברת ניגודיות (CTF) כדי להסביר את ההשפעות של דפוקוס וסטיות שהוטלו על ידי המיקרוסקופ. מהמיקרוגרפים המתוקנים של CTF, חלקיקים בודדים נבחרים, מופקים ומוינים לממוצעים דו-ממדיים המייצגים אוריינטציות שונות שאומצו על ידי הדגימה בקרח זגוגי. קבוצת החלקיקים ההומוגנית שנוצרת משמשת כקלט לשחזור תלת-ממדי ab initio כדי ליצור מודל או מודלים גסים, אשר לאחר מכן מעודנים באופן איטרטיבי כדי לייצר מבנה אחד או יותר ברזולוציה גבוהה. לאחר השחזור, שיפורים מבניים מבוצעים כדי לשפר עוד יותר את האיכות והרזולוציה של מפת cryo-EM. לבסוף, מודל אטומי נגזר ישירות מהמפה, או שהמפה מצוידת בקואורדינטות אטומיות המתקבלות במקום אחר.
חבילות תוכנה שונות זמינות כדי להשלים את המשימות המתוארות לעיל, כולל Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13, ואחרים. בעוד שתוכניות אלה מבצעות שלבי עיבוד דומים, הן משתמשות באלגוריתמים שונים, לדוגמה, כדי לבחור חלקיקים, ליצור מודלים ראשוניים ולמקד שחזורים. בנוסף, תוכניות אלה דורשות רמה משתנה של ידע משתמש והתערבות לפעול, כמו כמה תלויים כוונון עדין של פרמטרים שיכולים לשמש משוכה עבור משתמשים חדשים. אי-התאמות אלה גורמות לעתים קרובות למפות עם איכות ורזולוציה לא עקביות בפלטפורמות14, מה שגורם לחוקרים רבים להשתמש בחבילות תוכנה מרובות כדי למקד ולאמת תוצאות. במאמר זה, אנו מדגישים את השימוש של cryoSPARC v3, RELION-3, ו Scipion 3 כדי לקבל שחזור 3D ברזולוציה גבוהה של AAV, וקטור נפוץ לטיפול גנטי15. חבילות התוכנה הנ"ל הן בחינם למשתמשים אקדמיים; cryoSPARC v3 ו Scipion 3 דורשים רישיונות.
1. יצירת פרויקט v3 קריוSPARC חדש וייבוא נתונים
הערה: הנתונים נרכשו באוניברסיטת אורגון לבריאות ומדע (OHSU) בפורטלנד באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים טיטאן Krios 300 kV המצויד בגלאי אלקטרונים ישיר פלקון 3. התמונות נאספו במצב ספירה עם מינון כולל של 28.38 e−/Å2 מחולק על פני 129 מסגרות, וטווח defocus מ-0.5 מיקרומטר ל-2.5 מיקרומטר-, בגודל פיקסל של 1.045 Å באמצעות EPU. המדגם של AAV- DJ סופק על ידי הצוות של OHSU.
2. CryoSPARC v3 - יישור סרט והערכת CTF
3. CryoSPARC v3 - קטיף חלקיקים ידני ומבוסס תבנית
4. CryoSPARC v3 - סיווג דו-ממדי
5. CryoSPARC v3 - שחזור ab-initio ועידון הומוגני
6. ייצוא קואורדינטות חלקיקים מ cryoSPARC v3 וייבואם ל- RELION-3 באמצעות PyEM
הערה: קואורדינטות חלקיקים נושאות מידע על מיקומם של חלקיקים בודדים בכל מיקרוגרף. העברת קואורדינטות במקום ערימות חלקיקים ל- RELION-3 מאפשרת הפעלת שלבי עידון שאחרת לא היו זמינים. לדוגמה, ליטוש חלקיקים דורש גישה למסגרות סרט ראשוניות. לפיכך, לפני ייצוא קואורדינטות חלקיקים מ cryoSPARC v3 כדי RELION-3, לייבא סרטים ולבצע תיקון תנועה והערכת CTF ב RELION-3. עיין בערכת הלימוד של RELION-319 לקבלת פרטים.
7. RELION-3 - מיצוי חלקיקים וסיווג דו-ממדי
8. RELION-3 - עידון תלת-ממדי, יצירת מסיכות ופוסט-עיבוד
9. RELION-3 - אימון ליטוש וליטוש חלקיקים
10. RELION-3 - עידון CTF ולחלקיקים
11. העברת קואורדינטות חלקיקים RELION-3 ומפה תלת-ממדית ל- Scipion 3
12. Scipion 3 - עידון ברזולוציה גבוהה
13. סיפיון 3 - אימות מפה
הצגנו צינור ספא מקיף כדי לקבל מבנה ברזולוציה גבוהה באמצעות שלוש פלטפורמות עיבוד שונות: cryoSPARC v3, RELION-3, ו Scipion 3. איור 1 ואיור 4 מסכמים את זרימת העבודה הכללית של העיבוד, וטבלה 1 מפרטת פרוטוקולי עידון. פרוטוקולים אלה שימשו במהלך עידון של מבנה 2.3 Å של AAV, השג?...
במאמר זה, אנו מציגים זרימת עבודה חזקה של SPA לעיבוד נתונים Cryo-EM בפלטפורמות תוכנה שונות כדי להשיג שחזורי תלת-ממד ברזולוציה גבוהה (איור 1). זרימת עבודה זו חלה על מגוון רחב של מקרומולקולות ביולוגיות. השלבים הבאים של הפרוטוקול מפורטים באיור 4, כולל טרום עיבוד סרט, ק...
למחברים אין מה לחשוף.
אנו מודים לקרלוס אוסקר סורזאנו על העזרה בהתקנת Scipion3 וקיליאן שנלה וארנה מולר על העזרה בהעברת נתונים בין פלטפורמות עיבוד שונות. חלק ממחקר זה נתמך על ידי מענק NIH U24GM129547 ובוצע ב- PNCC ב- OHSU ונגיש באמצעות EMSL (רשת.436923.9), משרד DOE של מתקן משתמש מדע בחסות המשרד למחקר ביולוגי וסביבתי. מחקר זה נתמך על ידי מענק סטארט-אפ מאוניברסיטת ראטגרס לארק קולצ'יק.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CryoSPARC | Structura Biotechnology Inc. | https://cryosparc.com/ | |
CTFFIND 4 | Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | |
MotionCorr2 | UCSF Macromolecular Structure Group | https://msg.ucsf.edu/software | |
Phenix | Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC) | http://www.phenix-online.org/ | |
PyEM | Univerisity of California, San Francisco | https://github.com/asarnow/pyem | |
RELION | MRC Laboratory of Structural Biology | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page | |
Scipion | Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab | http://scipion.i2pc.es/ | |
UCSF Chimera | UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved