Ein robuster Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie-Verarbeitungs-Workflow (Kryo-EM) mit cryoSPARC, RELION und Scipion

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt, wie drei Kryo-EM-Verarbeitungsplattformen, d. h. cryoSPARC v3, RELION-3 und Scipion 3, effektiv genutzt werden können, um einen einzigen und robusten Workflow zu erstellen, der auf eine Vielzahl von Einzelpartikeldatensätzen für die hochauflösende Strukturbestimmung anwendbar ist.

Zusammenfassung

Jüngste Fortschritte sowohl in der Instrumentierung als auch in der Bildverarbeitungssoftware haben die Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) zur bevorzugten Methode für Strukturbiologen gemacht, um hochauflösende Strukturen einer Vielzahl von Makromolekülen zu bestimmen. Für die Bildverarbeitung und Strukturberechnung stehen neue und erfahrene Benutzer mehrere Software-Suiten zur Verfügung, die den gleichen grundlegenden Workflow rationalisieren: Filme, die von den Mikroskopdetektoren aufgenommen wurden, werden für die Schätzung der strahleninduzierten Bewegung und der Kontrastübertragungsfunktion (CTF) korrigiert. Als nächstes werden Partikelbilder ausgewählt und aus gemittelten Filmbildern für die iterative 2D- und 3D-Klassifizierung extrahiert, gefolgt von 3D-Rekonstruktion, Verfeinerung und Validierung. Da verschiedene Softwarepakete unterschiedliche Algorithmen verwenden und unterschiedliche Fachkenntnisse erfordern, unterscheiden sich die von ihnen generierten 3D-Karten häufig in Qualität und Auflösung. So übertragen Benutzer regelmäßig Daten zwischen einer Vielzahl von Programmen für optimale Ergebnisse. Dieses Dokument bietet eine Anleitung für Benutzer zum Navigieren in einem Workflow durch die gängigen Softwarepakete: cryoSPARC v3, RELION-3 und Scipion 3, um eine nahezu atomare Auflösungsstruktur des Adeno-assoziierten Virus (AAV) zu erhalten. Wir haben zunächst eine Bildverarbeitungspipeline mit cryoSPARC v3 detailliert beschrieben, da die effizienten Algorithmen und die benutzerfreundliche GUI es den Benutzern ermöglichen, schnell zu einer 3D-Karte zu gelangen. Im nächsten Schritt verwenden wir PyEM und interne Skripte, um Partikelkoordinaten von der besten 3D-Rekonstruktion in cryoSPARC v3 zu RELION-3 und Scipion 3 zu konvertieren und zu übertragen und 3D-Karten neu zu berechnen. Schließlich skizzieren wir Schritte zur weiteren Verfeinerung und Validierung der resultierenden Strukturen durch die Integration von Algorithmen aus RELION-3 und Scipion 3. In diesem Artikel beschreiben wir, wie Sie drei Verarbeitungsplattformen effektiv nutzen können, um einen einzigen und robusten Workflow zu erstellen, der auf eine Vielzahl von Datensätzen für die hochauflösende Strukturbestimmung anwendbar ist.

Einleitung

Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) und Einzelpartikelanalyse (SPA) ermöglichen die Strukturbestimmung einer Vielzahl von biomolekularen Baugruppen in ihrem hydratisierten Zustand und helfen, die Rolle dieser Makromoleküle im atomaren Detail zu beleuchten. Verbesserungen in der Mikroskopoptik, Computerhardware und Bildverarbeitungssoftware haben es ermöglicht, Strukturen von Biomolekülen mit einer Auflösung von mehr als 2 Å ^1,2,3 zu bestimmen. Mehr als 2.300 Kryo-EM-Strukturen wurden 2020 in der Protein Data Bank (PDB) hinterlegt, verglichen mit 192 Strukturen im Jahr 20144,....

Protokoll

1. Erstellen eines neuen cryoSPARC v3-Projekts und Importieren von Daten

HINWEIS: Die Daten wurden an der Oregon Health and Science University (OHSU) in Portland mit einem 300-kV-Titan Krios-Elektronenmikroskop erfasst, das mit einem Falcon 3-Direktelektronendetektor ausgestattet ist. Die Bilder wurden in einem Zählmodus mit einer Gesamtdosis von 28,38 e⁻/^Å2 über 129 Frames und einem Defokussierungsbereich von -0,5 μm bis -2,5 μm bei einer Pixelgröße von 1,045 Å unter Verwendung von EPU gesammelt. Das Sample von AAV-DJ wurde von den Mitarbeitern der OHSU zur Verfügung gestellt.

1. Öffnen Sie cry....

Ergebnisse

Wir haben eine umfassende SPA-Pipeline vorgestellt, um eine hochauflösende Struktur mit drei verschiedenen Verarbeitungsplattformen zu erhalten: cryoSPARC v3, RELION-3 und Scipion 3. Abbildung 1 und Abbildung 4 fassen den allgemeinen Verarbeitungsworkflow zusammen, und in Tabelle 1 sind die Einschränkungsprotokolle aufgeführt. Diese Protokolle wurden bei der Verfeinerung einer 2,3 Å-Struktur von AAV verwendet, wodurch eine nahezu Nyquist-Au.......

Diskussion

In diesem Artikel stellen wir einen robusten SPA-Workflow für die Kryo-EM-Datenverarbeitung über verschiedene Softwareplattformen hinweg vor, um hochauflösende 3D-Rekonstruktionen zu erreichen (Abbildung 1). Dieser Workflow ist auf eine Vielzahl von biologischen Makromolekülen anwendbar. Die nachfolgenden Schritte des Protokolls sind in Abbildung 4 dargestellt, einschließlich Filmvorverarbeitung, Partikelkommissionierung und -klassifizierung sowie mehrerer .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
CryoSPARC	Structura Biotechnology Inc.	https://cryosparc.com/
CTFFIND 4	Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School	https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4
MotionCorr2	UCSF Macromolecular Structure Group	https://msg.ucsf.edu/software
Phenix	Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC)	http://www.phenix-online.org/
PyEM	Univerisity of California, San Francisco	https://github.com/asarnow/pyem
RELION	MRC Laboratory of Structural Biology	https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page
Scipion	Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab	http://scipion.i2pc.es/
UCSF Chimera	UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/