Ein robuster Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie-Verarbeitungs-Workflow (Kryo-EM) mit cryoSPARC, RELION und Scipion

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt, wie drei Kryo-EM-Verarbeitungsplattformen, d. h. cryoSPARC v3, RELION-3 und Scipion 3, effektiv genutzt werden können, um einen einzigen und robusten Workflow zu erstellen, der auf eine Vielzahl von Einzelpartikeldatensätzen für die hochauflösende Strukturbestimmung anwendbar ist.

Zusammenfassung

Jüngste Fortschritte sowohl in der Instrumentierung als auch in der Bildverarbeitungssoftware haben die Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) zur bevorzugten Methode für Strukturbiologen gemacht, um hochauflösende Strukturen einer Vielzahl von Makromolekülen zu bestimmen. Für die Bildverarbeitung und Strukturberechnung stehen neue und erfahrene Benutzer mehrere Software-Suiten zur Verfügung, die den gleichen grundlegenden Workflow rationalisieren: Filme, die von den Mikroskopdetektoren aufgenommen wurden, werden für die Schätzung der strahleninduzierten Bewegung und der Kontrastübertragungsfunktion (CTF) korrigiert. Als nächstes werden Partikelbilder ausgewählt und aus gemittelten Filmbildern für die iterative 2D- und 3D-Klassifizierung extrahiert, gefolgt von 3D-Rekonstruktion, Verfeinerung und Validierung. Da verschiedene Softwarepakete unterschiedliche Algorithmen verwenden und unterschiedliche Fachkenntnisse erfordern, unterscheiden sich die von ihnen generierten 3D-Karten häufig in Qualität und Auflösung. So übertragen Benutzer regelmäßig Daten zwischen einer Vielzahl von Programmen für optimale Ergebnisse. Dieses Dokument bietet eine Anleitung für Benutzer zum Navigieren in einem Workflow durch die gängigen Softwarepakete: cryoSPARC v3, RELION-3 und Scipion 3, um eine nahezu atomare Auflösungsstruktur des Adeno-assoziierten Virus (AAV) zu erhalten. Wir haben zunächst eine Bildverarbeitungspipeline mit cryoSPARC v3 detailliert beschrieben, da die effizienten Algorithmen und die benutzerfreundliche GUI es den Benutzern ermöglichen, schnell zu einer 3D-Karte zu gelangen. Im nächsten Schritt verwenden wir PyEM und interne Skripte, um Partikelkoordinaten von der besten 3D-Rekonstruktion in cryoSPARC v3 zu RELION-3 und Scipion 3 zu konvertieren und zu übertragen und 3D-Karten neu zu berechnen. Schließlich skizzieren wir Schritte zur weiteren Verfeinerung und Validierung der resultierenden Strukturen durch die Integration von Algorithmen aus RELION-3 und Scipion 3. In diesem Artikel beschreiben wir, wie Sie drei Verarbeitungsplattformen effektiv nutzen können, um einen einzigen und robusten Workflow zu erstellen, der auf eine Vielzahl von Datensätzen für die hochauflösende Strukturbestimmung anwendbar ist.

Einleitung

Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) und Einzelpartikelanalyse (SPA) ermöglichen die Strukturbestimmung einer Vielzahl von biomolekularen Baugruppen in ihrem hydratisierten Zustand und helfen, die Rolle dieser Makromoleküle im atomaren Detail zu beleuchten. Verbesserungen in der Mikroskopoptik, Computerhardware und Bildverarbeitungssoftware haben es ermöglicht, Strukturen von Biomolekülen mit einer Auflösung von mehr als 2 Å ^1,2,3 zu bestimmen. Mehr als 2.300 Kryo-EM-Strukturen wurden 2020 in der Protein Data Bank (PDB) hinterlegt, verglichen mit 192 Strukturen im Jahr 20144, was darauf hindeutet, dass Kryo-EM für viele Strukturbiologen zur Methode der Wahl geworden ist. Hier beschreiben wir einen Workflow, der drei verschiedene SPA-Programme zur hochauflösenden Strukturfindung kombiniert (Abbildung 1).

Das Ziel von SPA ist es, 3D-Volumina einer Zielprobe aus verrauschten 2D-Bildern zu rekonstruieren, die von einem Mikroskopdetektor aufgenommen wurden. Detektoren sammeln Bilder als Filme mit einzelnen Bildern des gleichen Sichtfeldes. Um die Probe zu erhalten, werden Frames mit einer niedrigen Elektronendosis gesammelt und haben somit ein schlechtes Signal-Rausch-Verhältnis (SNR). Darüber hinaus kann die Elektronenbelichtung eine Bewegung innerhalb der verglasten Kryo-EM-Gitter induzieren, was zu Bildunschärfe führt. Um diese Probleme zu überwinden, werden die Rahmen so ausgerichtet, dass sie die strahleninduzierte Bewegung korrigieren, und gemittelt, um eine Mikroaufnahme mit einem erhöhten SNR zu erhalten. Diese Mikroaufnahmen werden dann einer CTF-Schätzung (Contrast Transfer Function) unterzogen, um die Auswirkungen von Defokus und Aberrationen, die vom Mikroskop auferlegt werden, zu berücksichtigen. Aus den CTF-korrigierten Mikroaufnahmen werden einzelne Partikel ausgewählt, extrahiert und in 2D-Klassendurchschnitte sortiert, die unterschiedliche Orientierungen der Probe in Glaseis darstellen. Der resultierende homogene Satz von Partikeln wird als Input für die ab initio 3D-Rekonstruktion verwendet, um ein grobes Modell oder Modelle zu erzeugen, die dann iterativ verfeinert werden, um eine oder mehrere hochauflösende Strukturen zu erzeugen. Nach der Rekonstruktion werden strukturelle Verfeinerungen durchgeführt, um die Qualität und Auflösung der Kryo-EM-Karte weiter zu verbessern. Schließlich wird entweder ein Atommodell direkt von der Karte abgeleitet, oder die Karte ist mit atomaren Koordinaten ausgestattet, die an anderer Stelle erhalten wurden.

Verschiedene Softwarepakete sind verfügbar, um die oben beschriebenen Aufgaben zu erfüllen, einschließlich ^Appion5, ^cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, ^Xmipp13 und andere. Während diese Programme ähnlichen Verarbeitungsschritten folgen, verwenden sie verschiedene Algorithmen, um beispielsweise Partikel auszuwählen, anfängliche Modelle zu generieren und Rekonstruktionen zu verfeinern. Darüber hinaus erfordern diese Programme ein unterschiedliches Maß an Benutzerwissen und Eingriffen, da einige von der Feinabstimmung von Parametern abhängen, die als Hürde für neue Benutzer dienen können. Diese Diskrepanzen führen oft zu Karten mit inkonsistenter Qualität und Auflösung auf allen ^{Plattformen14}, was viele Forscher dazu veranlasst, mehrere Softwarepakete zu verwenden, um die Ergebnisse zu verfeinern und zu validieren. In diesem Artikel heben wir die Verwendung von cryoSPARC v3, RELION-3 und Scipion 3 hervor, um eine hochauflösende 3D-Rekonstruktion von AAV, einem weit verbreiteten Vektor für die ^{Gentherapie15}, zu erhalten. Die oben genannten Softwarepakete sind für akademische Benutzer kostenlos; cryoSPARC v3 und Scipion 3 benötigen Lizenzen.

Protokoll

1. Erstellen eines neuen cryoSPARC v3-Projekts und Importieren von Daten

HINWEIS: Die Daten wurden an der Oregon Health and Science University (OHSU) in Portland mit einem 300-kV-Titan Krios-Elektronenmikroskop erfasst, das mit einem Falcon 3-Direktelektronendetektor ausgestattet ist. Die Bilder wurden in einem Zählmodus mit einer Gesamtdosis von 28,38 e⁻/^Å2 über 129 Frames und einem Defokussierungsbereich von -0,5 μm bis -2,5 μm bei einer Pixelgröße von 1,045 Å unter Verwendung von EPU gesammelt. Das Sample von AAV-DJ wurde von den Mitarbeitern der OHSU zur Verfügung gestellt.

1. Öffnen Sie cryoSPARC v3 in einem Webbrowser und klicken Sie auf die Kopfzeile Projekte . Wählen Sie + Hinzufügen , um ein neues Projekt zu erstellen. Betiteln Sie das Projekt entsprechend und geben Sie einen Pfad zu einem vorhandenen Verzeichnis an, in dem Aufträge und Daten gespeichert werden.
2. Erstellen Sie einen Arbeitsbereich für das Projekt, indem Sie das Projekt öffnen, auf + Hinzufügen klicken und Neuer Arbeitsbereich auswählen. Betiteln Sie den Arbeitsbereich und klicken Sie auf Erstellen.
3. Navigieren Sie zum neuen Arbeitsbereich und öffnen Sie den Job Builder im rechten Bereich. Auf dieser Registerkarte werden alle Funktionen angezeigt, die in cryoSPARC v3 verfügbar sind. Klicken Sie auf Filme importieren und geben Sie den Filmpfad, den Pfad der Verstärkungsreferenzdatei und die Erfassungsparameter wie folgt ein: Rohpixelgröße 1,045 Å, Beschleunigungsspannung 300 kV, Sphärische Aberration 2,7 mm, Gesamtexpositionsdosis 28,38 e^-/Å^2.
4. Klicken Sie auf Warteschlange, wählen Sie eine Lane aus, um den Job und einen Arbeitsbereich auszuführen, und klicken Sie auf Erstellen.
   HINWEIS: Die Erfassungsparameter sind proben- und mikroskopabhängig.

2. CryoSPARC v3 - Filmausrichtung und CTF-Schätzung

1. Öffnen Sie die Patch-Bewegungskorrektur (Multi). Dieser Auftrag erfordert die in Schritt 1.3 importierten Filme als Eingabe. Öffnen Sie die Auftragskarte zum Importieren von Filmen im Arbeitsbereich und ziehen Sie die Imported_movies Ausgabe auf den Platzhalter Filme des neuen Auftrags. Stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange.
   HINWEIS: Weitere Informationen zu den in diesem Artikel beschriebenen cryoSPARC-Methoden finden Sie im cryoSPARC-Lernprogramm16.
2. Um eine CTF-Schätzung durchzuführen, öffnen Sie Patch CTF Estimation (Multi). Geben Sie die in Schritt 2.1 generierten Mikroaufnahmen ein und stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange.
3. Um die gemittelten und CTF-korrigierten Mikrographen zu untersuchen und eine Teilmenge für die weitere Verarbeitung auszuwählen, öffnen Sie Curate Exposures und geben Sie die in Schritt 2.2 erhaltenen Expositionen ein. Stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange.
4. Nachdem der Auftrag in den Wartemodus gewechselt ist, klicken Sie auf der Jobkarte auf die Registerkarte Interaktion , passen Sie die Parameterschwellenwerte an und akzeptieren oder lehnen Sie einzelne Mikroaufnahmen zur weiteren Verarbeitung ab. Akzeptieren Sie Mikroaufnahmen mit gut abgestimmten geschätzten und experimentellen CTFs (Abbildung 2) und verwerfen Sie solche mit hohem Astigmatismus, schlechter CTF-Passform und dickem Eis.
5. Setzen Sie bei der Verarbeitung der aktuellen Daten die obere Schwelle von Astigmatismus auf 400 Å, die CTF-Anpassungsauflösung auf 5 Å und die relative Eisdicke auf 2. Klicken Sie auf Fertig , um die Mikroaufnahmen für die nachgelagerte Verarbeitung auszuwählen.

3. CryoSPARC v3 - manuelle und vorlagenbasierte Partikelkommissionierung

1. Öffnen Sie die manuelle Auswahl, geben Sie die akzeptierten Belichtungen aus den Schritten 2.4 bis 2.5 ein, und stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange. Klicken Sie auf die Registerkarte Interaktiv, stellen Sie die Boxgröße (px) auf 300 ein und klicken Sie auf einige hundert Partikel über mehrere Mikroaufnahmen hinweg, um die Auswahl überlappender Partikel zu vermeiden. Hier wurden 340 Partikel in 29 Mikroaufnahmen ausgewählt. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Fertige Auswahl! Partikel extrahieren.
   HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet die manuelle Partikelkommissionierung, um Vorlagen für die automatische Auswahl zu generieren. Es stehen jedoch auch andere Methoden zur ^Verfügung17.
2. Um Vorlagen für die automatisierte Partikelkommissionierung zu generieren, klicken Sie auf 2D-Klassifizierung und geben Sie die in Schritt 3.1 generierten Partikelpicks ein. Ändern Sie die Anzahl der 2D-Klassen in 10, und stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange .
3. Öffnen Sie 2D-Klassen auswählen. Geben Sie die in Schritt 3.2 erhaltenen Partikel und Klassendurchschnitte ein und klicken Sie auf die Registerkarte Interaktiv. Wählen Sie repräsentative 2D-Klassen mit gutem SNR aus und klicken Sie auf Fertig.
   HINWEIS: Die Klassendurchschnitte spiegeln unterschiedliche Partikelansichten wider. Wählen Sie Klassendurchschnitte aus, die jede Ansicht widerspiegeln. Ziel ist es, klar definierte Vorlagen zu erstellen, die verschiedene Ansichten der Probe für die automatisierte Kommissionierung darstellen.
4. Öffnen Sie die Vorlagenauswahl und geben Sie die in Schritt 3.3 ausgewählten 2D-Klassen sowie die Mikroaufnahmen aus den Schritten 2.4-2.5 ein. Legen Sie den Partikeldurchmesser (å) auf 220 å fest und stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange .
5. Um die automatisierten Kommissioniervorgänge zu überprüfen, öffnen Sie "Partikelauswahlen auswählen", geben Sie die in Schritt 3.4 generierten Partikel und Mikroaufnahmen ein und stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange.
6. Klicken Sie auf der Jobkarte Partikelauswahl auswählen auf die Registerkarte Interaktiv und legen Sie die Boxgröße (px) auf 300 fest. Klicken Sie auf eine einzelne Mikroaufnahme, stellen Sie den Tiefpassfilter ein, bis die Partikel deutlich sichtbar sind, und stellen Sie den NCC-Schwellenwert (Normalized Cross Corlation) auf 0,41 und den Leistungsschwellenwert zwischen 54000 und 227300 ein.
7. Untersuchen Sie mehrere Mikroaufnahmen und passen Sie bei Bedarf die Schwellenwerte so an, dass die meisten Partikel ausgewählt werden, ohne falsche Positive einzubeziehen. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Fertige Auswahl! Partikel extrahieren.
   HINWEIS: Echte Partikel haben typischerweise einen hohen NCC- und Leistungswert, was darauf hindeutet, dass sie der Schablone ähnlich sind bzw. einen hohen SNR aufweisen.
8. Öffnen Sie den Auszug aus den Mikroaufnahmen und geben Sie die Mikroaufnahmen und Partikel aus Schritt 3.7 ein. Legen Sie die Größe des extrahierten Felds (px) auf 300 fest, und stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange.

4. CryoSPARC v3 - 2D-Klassifizierung

1. Klicken Sie auf 2D-Klassifizierung und geben Sie die extrahierten Partikel aus Schritt 3.8 ein. Legen Sie die Anzahl der 2D-Klassen auf 50 fest und stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange.
2. Um die besten 2D-Klassen für die weitere Verarbeitung auszuwählen, öffnen Sie 2D-Klassen auswählen. Geben Sie die in Schritt 4.1 erhaltenen Partikel und Klassendurchschnitte ein. Klicken Sie auf die Registerkarte Interaktiv und wählen Sie 2D-Klassen basierend auf der Auflösung und der Anzahl der Partikel in der Klasse aus (Abbildung 3). Wählen Sie keine Klassen aus, die Artefakte enthalten. Klicken Sie nach der Auswahl auf Fertig.
   HINWEIS: Normalerweise sind mehrere Runden der 2D-Klassifizierung erforderlich, um Partikel zu entfernen, die nicht in verschiedene, genau definierte Klassen konvergieren. Führen Sie so viele Runden der 2D-Klassifizierung wie nötig durch, um solche Partikel aus dem Datensatz zu entfernen (Abbildung 3).

5. CryoSPARC v3 - ab-initio Rekonstruktion und homogene Verfeinerung

1. Um ein anfängliches 3D-Volumen zu erzeugen, öffnen Sie Ab-initio Reconstruction und geben Sie die Partikel ein, die Sie in Schritt 4.2 oder aus der endgültigen 2D-Klassifizierung erhalten haben. Passen Sie die Symmetrie an die Ikosaeder an. Stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange.
   HINWEIS: Die Symmetrie ist sampleabhängig und sollte entsprechend geändert werden. Wenn unbekannt, verwenden Sie die C1-Symmetrie.
2. Offene homogene Raffination. Geben Sie das Volumen aus Schritt 5.1 und Partikel aus 4.2 oder die endgültige 2D-Klassifizierung ein. Ändern Sie die Symmetrie und stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange. Wenn der Auftrag abgeschlossen ist, untersuchen Sie die Fourier-Shell-Korrelationskurve (FSC) und laden Sie das Volume herunter, um es in UCSF ^Chimera18 zu untersuchen.

6. Exportieren von Partikelkoordinaten aus cryoSPARC v3 und Importieren in RELION-3 mit PyEM

HINWEIS: Partikelkoordinaten enthalten Informationen über die Position einzelner Partikel in jeder Mikroaufnahme. Die Übertragung von Koordinaten anstelle von Partikelstapeln an RELION-3 ermöglicht das Ausführen von Verfeinerungsschritten, die sonst nicht verfügbar wären. Zum Beispiel erfordert das Polieren von Partikeln Zugriff auf anfängliche Filmframes. Importieren Sie daher vor dem Exportieren von Partikelkoordinaten aus cryoSPARC v3 nach RELION-3 Filme und führen Sie eine Bewegungskorrektur und CTF-Schätzung in RELION-3 durch. Weitere Informationen finden Sie im RELION-3-Tutorial19^.

1. Navigieren Sie zum RELION-3-Projektverzeichnis und starten Sie RELION-3.
2. Öffnen Sie Importieren aus dem Auftragstypbrowser, und geben Sie den Pfad zu den Filmen und Erfassungsparametern wie in Schritt 1.3 beschrieben an.
3. Um eine Bewegungskorrektur durchzuführen, verwenden Sie UCSF MotionCor220 über die RELION-3 GUI, öffnen Sie die Bewegungskorrektur und legen Sie die Standardparameter wie im UCSF MotionCor2 ^Handbuch21 fest. Geben Sie den Pfad zu den in Schritt 6.2 importierten Filmen ein. Geben Sie auf der Registerkarte Bewegung den Pfad zur ausführbaren Datei motioncor2 an.
   HINWEIS: MotionCor2 kann parallel über mehrere GPUs ausgeführt werden.
4. Führen Sie die CTF-Schätzung mit CTFFIND-4.122 über die grafische Benutzeroberfläche RELION-3 durch. Öffnen Sie CTF Estimation und geben Sie die in Schritt 6.3 generierten micrographs.star ein. Geben Sie auf der Registerkarte CTFFIND-4.1 den Pfad zur ausführbaren Datei CTFFIND-4.1 an, und legen Sie die Parameter wie im RELION-3.1-Lernprogramm19 fest.
5. Um Partikelstapel aus cryoSPARC v3 nach RELION-3 zu importieren, müssen diese zunächst aus cryoSPARC v3 exportiert werden. Öffnen Sie in cryoSPARC v3 die Jobkarte des Auftrags "2D-Klasse auswählen " aus Schritt 4.2 oder der endgültigen 2D-Klassifizierung. Klicken Sie auf der Registerkarte Details auf Auftrag exportieren. Job exportieren gibt die particles_exported.cs Datei aus.
6. Vor dem Importieren von Partikelkoordinaten aus cryoSPARC v3 in RELION-3 muss die particles_exported.cs Datei aus Schritt 6.5 in das .star-Format konvertiert werden. Konvertieren Sie die Datei particles_exported.cs mit ^PyEM23 in das .star-Format, indem Sie den folgenden Befehl ausführen: csparc2star.py particles_exported.cs particles_exported.star
7. Klicken Sie in RELION-3 auf die Registerkarte Manuelle Kommissionierung und geben Sie auf der Registerkarte E/A die in Schritt 6.4 beschriebenen Mikroaufnahmen aus der CTF-Verfeinerung ein. Geben Sie auf der Registerkarte Anzeige die folgenden Parameter ein: Partikeldurchmesser (A): 220, Tiefpassfilter (A): -1 , Maßstab für CTF-Bild: 0,5. Führen Sie den Auftrag aus. Ein Verzeichnis namens ManualPick wird im RELION-3 Home-Ordner generiert.
   HINWEIS: Dieser Schritt wird durchgeführt, um eine manuelle Kommissionierordnerstruktur in RELION-3 zu erstellen. Während der manuellen Kommissionierung wird eine einzelne .star-Datei mit Koordinaten der ausgewählten Partikel für jede gemittelte Mikroaufnahme erstellt, die für die Kommissionierung in der RELION-3-GUI verwendet wird.
8. Navigieren Sie zu dem Ordner, der die Datei particles_exported.star aus Schritt 6.6 enthält, und führen Sie ein selbst geschriebenes Skript aus, das eine einzelne manualpick.star-Datei für jede gemittelte Mikroaufnahme erstellt, die für die Kommissionierung von Kryo-SPARC v3-Partikeln verwendet wird, die zur endgültigen 2D-Klassifizierung beigetragen hat, die in Schritt 6.5 exportiert wurde. Die resultierenden Koordinatendateien werden im Ordner ManualPick/Movies gespeichert.
9. Kehren Sie zu RELION-3 zurück und öffnen Sie den manuellen Kommissionierjob erneut. Klicken Sie auf Weiter. Dadurch werden Partikel, die zuvor in cryoSPARC v3 ausgewählt wurden, in der RELION-3-GUI angezeigt. Untersuchen Sie einige Mikroaufnahmen, um zu überprüfen, ob die Übertragung der Partikelkoordinaten durchgeführt wurde und ob die Partikel richtig ausgewählt wurden.

7. RELION-3 - Partikelextraktion und 2D-Klassifizierung

1. Klicken Sie auf Partikelextraktion. Geben Sie auf der Registerkarte I/O die CTF-korrigierten Mikroaufnahmen aus Schritt 6.4 und Koordinaten aus Schritt 6.9 ein. Klicken Sie auf die Registerkarte Extrahieren und ändern Sie die Partikelboxgröße (pix) auf 300. Führen Sie den Auftrag aus.
2. Führen Sie eine 2D-Klassifizierung durch, um den in cryoSPARC v3 erzeugten Partikelsatz weiter zu reinigen, um eine Rekonstruktion mit höherer Auflösung zu erreichen. Klicken Sie auf 2D-Klassifizierung und geben Sie auf der Registerkarte E/A die in Schritt 7.1 generierte Datei particles.star ein. Legen Sie auf der Registerkarte Optimierung die Anzahl der Klassen auf 50 und den Maskendurchmesser (A) auf 280 fest. Führen Sie den Auftrag aus.
   HINWEIS: Die Maske sollte das gesamte Partikel umfassen.
3. Um die besten 2D-Klassen auszuwählen, klicken Sie auf die Subset-Auswahlmethode , geben Sie die Datei _model.star aus Schritt 7.2 ein und führen Sie den Auftrag aus . Wählen Sie Klassen wie in Schritt 4.2 beschrieben aus.
4. Wiederholen Sie die Schritte 7.2 und 7.3, um nicht konvergierende Partikel zu entfernen.

8. RELION-3 - 3D-Verfeinerung, Maskenerstellung und Nachbearbeitung

1. Verwenden Sie die in cryoSPARC v3 (Schritt 5.2) generierte Karte als erstes Modell für die 3D-Verfeinerung in RELION-3. Wählen Sie die Importmethode aus, und legen Sie auf der Registerkarte E/A die folgenden Parameter fest: Import Raw Movies/Micrographs: Nein, Raw Input Files: Movies/*.mrc.
2. Geben Sie die MTF-Datei ein und geben Sie die Filmaufnahmeparameter wie in Schritt 1.3 beschrieben ein. Wählen Sie auf der Registerkarte Andere die cryoSPARC v3-Zuordnung als Eingabedatei aus, ändern Sie den Knotentyp in 3D-Referenz (.mrc), und führen Sie den Auftrag aus.
3. Wählen Sie 3D Auto-Refine und legen Sie auf der Registerkarte I/O Input Images als particles.star-Datei aus Schritt 7.3 oder dem letzten Auswahlauftrag fest. Geben Sie die KryoSPARC v3-Rekonstruktion als Referenzkarte an. Klicken Sie auf die Registerkarte Referenz und ändern Sie den anfänglichen Tiefpassfilter (Å) in 50 und Symmetrie in Ikosaeder. Ändern Sie auf der Registerkarte Optimierung den Maskendurchmesser (Å) in 280, und führen Sie den Auftrag aus.
4. Nachdem der Lauf beendet ist, öffnen Sie run_class001.mrc in UCSF Chimera.
5. Klicken Sie in UCSF Chimera auf Extras und wählen Sie unter Volume Data die Option Volume Viewer aus. Dadurch wird ein neues Fenster geöffnet, in dem Sie die Lautstärkeeinstellungen anpassen können. Ändern Sie den Schritt in 1, und passen Sie den Schieberegler an, bis der Pegelwert erreicht ist, bei dem die Karte kein Rauschen aufweist. Notieren Sie diesen Wert, da er im nächsten Schritt für die Maskenerstellung verwendet wird.
6. Die aus der automatischen Verfeinerung erstellte Karte spiegelt nicht den wahren FSC wider, da das Rauschen des umgebenden Lösungsmittels die Auflösung senkt. Erstellen Sie vor der Nachbearbeitung eine Maske, um die Probe vom Lösungsmittelbereich zu unterscheiden.
   1. Klicken Sie auf Maskenerstellung und geben Sie run_class001.mrc aus Schritt 8.3 ein.
   2. Klicken Sie auf die Registerkarte Maske und passen Sie die Parameter wie folgt an: Tiefpassfilterkarte (Å): 10, Pixelgröße (Å): 1.045, Anfänglicher Binarisierungsschwellenwert : der Pegelwert, der in Schritt 8.5, Binäre Zuordnung so vieler Pixel erweitern: 3, und Hinzufügen einer weichen Kante dieser vielen Pixel: 3. Führen Sie den Auftrag aus.
7. Untersuchen Sie die Maske in UCSF Chimera. Wenn die Maske zu eng ist, erhöhen Sie Binary Map so viele Pixel erweitern und/oder fügen Sie eine Soft-Edge von so vielen Pixeln hinzu. Es ist wichtig, eine Maske mit weichen Kanten zu erstellen, da eine scharfe Maske zu einer Überanpassung führen kann.
8. Klicken Sie auf Nachbearbeitung und geben Sie auf der Registerkarte I/O die in Schritt 8.3 erstellten Halbkarten und die Maske aus 8.6 ein. Stellen Sie die kalibrierte Pixelgröße auf 1,045 Å ein. Geben Sie auf der Registerkarte Schärfen Folgendes ein: B-Faktor automatisch schätzen?: Ja, niedrigste Auflösung für Auto-B-Anpassung (A): 10, verwenden Sie Ihren eigenen B-Faktor?: Nein. Setzen Sie auf der Registerkarte Filter die Option Fsc-Gewichtung überspringen? auf Nein. Führen Sie den Auftrag aus.

9. RELION-3 - Poliertraining und Partikelpolieren

1. Bevor Sie die durch den Teilchenstrahl induzierte Bewegung korrigieren, verwenden Sie zunächst den Trainingsmodus, um optimale Bewegungsspuren für den Datensatz zu identifizieren. Öffnen Sie Bayesian Polishing , und geben Sie auf der Registerkarte E/A die bewegungskorrigierten Mikroaufnahmen aus Schritt 6.3, Partikel aus Schritt 8.3 und die .star-Datei nach dem Prozess aus Schritt 8.8 ein. Klicken Sie auf die Registerkarte Training und legen Sie die folgenden Parameter fest: Trainiere optimale Parameter : Ja, Bruchteil der Fourier-Pixel zum Testen: 0,5, Verwenden Sie so viele Partikel: 5000. Führen Sie den Auftrag aus.
   HINWEIS: Dieses Skript erzeugt opt_params_all_groups.txt Datei im Ordner RELION-3 Polish mit optimierten Polierparametern, die für die Ausführung des folgenden Schritts erforderlich sind.
2. Sobald der Trainingsjob beendet ist, klicken Sie auf Bayesian Polishing. Klicken Sie auf die Registerkarte Training und setzen Sie Train Optimal Parameters? auf Nein. Wählen Sie die Registerkarte Polnisch und geben Sie unter Optimierte Parameterdatei den Pfad zur opt_params_all_groups.txt Datei aus Schritt 9.1 an. Klicken Sie auf Ausführen.
3. Wiederholen Sie die 3D-Verfeinerung (Schritt 8.3) und die Nachbearbeitung (Schritt 8.8) mit einer Reihe polierter Partikel.

10. RELION-3 - CTF- und Partikelverfeinerungen

1. Um Aberrationen höherer Ordnung zu schätzen, öffnen Sie CTF Refinement , und wählen Sie auf der Registerkarte E/A unter Partikel den Pfad zur .star-Datei aus, die polierte Partikel aus dem letzten Refine 3D-Auftrag (run_data.star) enthält.
   1. Legen Sie unter Postprocess Star File den Pfad zur Ausgabe des letzten Nachbearbeitungsauftrags fest (Schritt 9.3).
   2. Wählen Sie die Registerkarte Anpassen (Fit ) und legen Sie die folgenden Parameter fest: Schätzung (anisotrope Vergrößerung): Nein, CTF-Parameteranpassung durchführen? Nein, Schätze Beamtilt: Ja, auch Trefoil schätzen? Ja, schätzen Sie die Abberationen 4^. Ordnung? Ja. Führen Sie den Auftrag aus.
2. Wiederholen Sie Schritt 10.1 mit Partikeln (von Refine3D), die im vorherigen Auftrag (particles_ctf_refine.star) generiert wurden, als Eingabe. Ändern Sie auf der Registerkarte Anpassung die Option Schätzung (anisotrope Vergrößerung) in Ja, und führen Sie den Auftrag aus.
3. Wiederholen Sie Schritt 10.2 mit Partikeln (von Refine3D), die im vorherigen Auftrag (particles_ctf_refine.star) erzeugt wurden. Legen Sie auf der Registerkarte Anpassen die folgenden Parameter fest: Schätzung (anisotrope Vergrößerung): Nein, CTF-Parameteranpassung durchführen?: Ja, Fokussierung anpassen?: Pro-Partikel, Astigmatismus anpassen? Pro-Mikrogramm, B-Faktor anpassen?: Nein, Phasenverschiebung anpassen: Nein, Strahlneigung schätzen?: Nein, Aberrationen 4. Ordnung schätzen?: Nein^. Führen Sie es aus .
   HINWEIS: Da das Partikel einen ausreichenden Kontrast aufweist, kann die Registerkarte Fit Astigmatism? kann auf Pro-Partikel gesetzt werden. Für diesen Datensatz hat die Verfeinerung des Astigmatismus pro Partikel die Qualität und Auflösung der Karte nicht verbessert.
4. Wiederholen Sie die 3D-Verfeinerung mit den Partikeln aus Schritt 10.3 und setzen Sie auf der Registerkarte E/A die Option Use Solvent-Flattened FSCs? auf yes. Wenn Sie mit der Ausführung fertig sind, führen Sie einen Nachbearbeitungsauftrag aus (Schritt 8.8) und untersuchen Sie die Karte in UCSF Chimera (Schritt 5.2).

11. Übertragung von RELION-3-Partikelkoordinaten und 3D-Karte nach Scipion 3

1. Um die RELION-3-Karte weiter zu verfeinern und zu validieren, importieren Sie zunächst das Volumen und die Partikel aus dem letzten Nachbearbeitungsauftrag (Schritt 10.4) in Scipion 3. Starten Sie Scipion 3 und erstellen Sie ein neues Projekt.
2. Wählen Sie im linken Protokollbereich das Dropdown-Menü Importe aus und klicken Sie auf Partikel importieren. Ändern Sie die folgenden Parameter: Import From: RELION-3, Star File: postprocess.star, und geben Sie die Erfassungsparameter wie in Schritt 1.3 an. Klicken Sie auf Ausführen.
3. Klicken Sie auf das Dropdown-Menü Importe und wählen Sie Import Volumes aus. Geben Sie unter Importieren von den Pfad zur RELION-3-Karte ein. Ändern Sie die Pixelgröße (Abtastrate) å/px auf 1,045 und führen Sie sie aus.

12. Scipion 3 - Hochauflösende Verfeinerung

1. Führen Sie zunächst eine globale Ausrichtung durch. Wählen Sie im Bedienfeld "Protokolle" das Dropdown-Menü "Verfeinern" und klicken Sie auf Xmipp3 - highres24. Geben Sie die importierten Partikel und Volumina aus den Schritten 11.2 und 11.3 als Bilder in voller Größe bzw. Anfangsvolumen ein und legen Sie die Symmetriegruppe auf ikosaedrisch fest. Wählen Sie auf der Registerkarte Bildausrichtung unter Winkelzuweisung die Option Global aus, legen Sie die maximale Zielauflösung auf 3 Å fest, und führen Sie den Auftrag aus.
2. Wenn der Auftrag abgeschlossen ist, klicken Sie auf Ergebnisse analysieren. Klicken Sie im neuen Fenster auf das UCSF Chimera Symbol, um das verfeinerte Volumen zu untersuchen. Klicken Sie außerdem auf Display Resolution Plots ( FSC), um zu sehen, wie sich der FSC nach der Verfeinerung geändert hat, sowie auf Plot Histogram with Angular Changes , um zu sehen, ob sich die Euler-Winkelzuweisungen geändert haben.
   HINWEIS: Abhängig von der Auflösung der Eingangsstruktur RELION-3 kann dieser Schritt mehrmals wiederholt werden, wobei verschiedene Werte für die Max Target Resolution auf der Registerkarte Angular Assignment eingestellt sind. Weitere Informationen finden Sie im ^{Scipion-Tutorial25}.
3. Wiederholen Sie Schritt 12.1 mit einer lokalen Ausrichtung. Kopieren Sie den vorherigen Auftrag, und ändern Sie Select Previous Run in Xmipp3 - highres Global. Ändern Sie auf der Registerkarte Winkelzuweisung die Bildausrichtung in Lokal. Legen Sie die maximale Zielauflösung auf 2,1 å fest.
4. Untersuchen Sie die verfeinerte Karte in UCSF Chimera und analysieren Sie die Änderung der FSC- und Winkelzuordnungen (Schritt 12.2). Wiederholen Sie die lokale Einschränkung, bis sich die Auflösung nicht verbessert hat und die Winkelzuordnungen konvergiert sind, und passen Sie die maximale Zielauflösung nach Bedarf an.
5. Die Ausgabekarte aus Scipion 3 kann in ^Phenix26 zusätzlich dichtemodifiziert und geschärft werden.

13. Scipion 3 - Kartenvalidierung

1. Untersuchen Sie die lokale Auflösung der endgültigen Karte, die in Xmipp3 - highres generiert wurde. Öffnen Sie Xmipp - lokales MonoRes27 und geben Sie das letzte Volume aus dem vorherigen Job und der Maske ein, die in Schritt 8.6 generiert wurden. Legen Sie den Auflösungsbereich von 1 bis 6 Å mit einem Intervall von 0,1 Å fest und führen Sie den Auftrag aus.
2. Wenn Sie mit der Ausführung fertig sind, klicken Sie auf Ergebnisse analysieren und untersuchen Sie das Auflösungshistogramm und die Volume-Segmente, die nach Auflösung gefärbt sind.
3. Um zu sehen, ob die Partikel gut ausgerichtet sind^, öffnen Sie Multireference Alignability28 und geben Sie die Partikel und das Volumen aus Schritt 12.3 ein. Klicken Sie auf Ergebnisse analysieren, um das Validierungsdiagramm anzuzeigen. Idealerweise sollten alle Punkte gruppiert werden (1.0,1.0).
4. Öffnen Sie Xmipp3 - Überprüfen Sie die Überanpassung. Geben Sie die Partikel und Volumina aus Schritt 12.3 ein. Wenn Sie mit der Ausführung fertig sind, analysieren Sie die Ergebnisse und überprüfen Sie das Overfit-Diagramm. Die Kreuzung des ausgerichteten Gaußschen Rauschens und der ausgerichteten Partikelkurven weist auf eine Überanpassung hin.

Ergebnisse

Wir haben eine umfassende SPA-Pipeline vorgestellt, um eine hochauflösende Struktur mit drei verschiedenen Verarbeitungsplattformen zu erhalten: cryoSPARC v3, RELION-3 und Scipion 3. Abbildung 1 und Abbildung 4 fassen den allgemeinen Verarbeitungsworkflow zusammen, und in Tabelle 1 sind die Einschränkungsprotokolle aufgeführt. Diese Protokolle wurden bei der Verfeinerung einer 2,3 Å-Struktur von AAV verwendet, wodurch eine nahezu Nyquist-Au...

Diskussion

In diesem Artikel stellen wir einen robusten SPA-Workflow für die Kryo-EM-Datenverarbeitung über verschiedene Softwareplattformen hinweg vor, um hochauflösende 3D-Rekonstruktionen zu erreichen (Abbildung 1). Dieser Workflow ist auf eine Vielzahl von biologischen Makromolekülen anwendbar. Die nachfolgenden Schritte des Protokolls sind in Abbildung 4 dargestellt, einschließlich Filmvorverarbeitung, Partikelkommissionierung und -klassifizierung sowie mehrerer ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
CryoSPARC	Structura Biotechnology Inc.	https://cryosparc.com/
CTFFIND 4	Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School	https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4
MotionCorr2	UCSF Macromolecular Structure Group	https://msg.ucsf.edu/software
Phenix	Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC)	http://www.phenix-online.org/
PyEM	Univerisity of California, San Francisco	https://github.com/asarnow/pyem
RELION	MRC Laboratory of Structural Biology	https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page
Scipion	Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab	http://scipion.i2pc.es/
UCSF Chimera	UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/